CN116183783B - 一种同时检测血液中6种药物浓度的方法 - Google Patents

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Abstract

本公开涉及一种同时检测血液中6种药物浓度的方法，所述方法包括：（1）配制至少三种不同浓度的含有6种药物及其内标物的标准溶液，并利用液相色谱‑质谱对所述标准溶液进行检测，根据检测结果分别建立所述6种药物的标准曲线；（2）将待测样品与稳定剂混合保存备用，待测试之前，混合液与内标物混合、离心，取上清液作为进样样品；（3）利用液相色谱‑质谱对所述进样样品进行检测，根据检测结果和所述标准曲线确定所述待测样品中6种药物的含量；所述6种药物为卡比多巴、多巴胺、美金刚、卡巴拉汀、左旋多巴和3‑甲氧基多巴。本公开检测方法能够减少杂质干扰、降低残留、降低基质效应，待测样品和标准曲线更加稳定，提高检测结果准确度。

Description

一种同时检测血液中6种药物浓度的方法
技术领域
本公开涉及药物检测技术领域，尤其涉及一种同时检测血液中6种药物浓度的方法。
背景技术
帕金森病又称震颤麻痹，是一种中枢神经系统椎体外系功能障碍的慢性进行性疾病。卡比多巴是一种外周脱羧酶抑制剂，不易进入神经中枢，与左旋多巴合用治疗帕金森病可以抑制外周左旋多巴转化为多巴胺，使进入神经中枢的左旋多巴逐渐增加，进而减少左旋多巴对周围心血管的不良反应，另外，左旋多巴代谢物3-甲氧基多巴也有较强活性。
多巴胺是一种脑内分泌物，是大脑中含量最丰富的儿茶酚胺类神经递质，能够调控中枢神经系统的多种生理功能，多巴胺系统调节障碍可能会导致帕金森病、精神分裂症、注意力缺陷多动综合征或垂体肿瘤的发生等。
卡巴拉汀属第二代中枢AChE抑制药，对大脑皮层和海马的AchE有选择性抑制作用，而对纹状体和心脏的AChE几乎无影响，且可减慢淀粉样蛋白前体（APP）的形成。口服迅速吸收，约1h达到Cmax，血浆蛋白结合率约40%，已透过血脑屏障，临床用于轻、中度AD，改善认知功能障碍，提高记忆力、注意力和方位感。
美金刚主要作用于脑内谷氨酸神经递质系统，通过与NMDA受体作用降低背景噪声，使谷酰胺信号恢复至正常生理状态。
监测以上药物的血药浓度，对开展与原研药的生物等效性研究具有重要意义。目前已知的对血液中卡比多巴、多巴胺、美金刚、卡巴拉汀、左旋多巴及其代谢物含量通常均是采用高效液相色谱质谱联用的方法对上述药物分别进行检测，并没有关于如何实现卡比多巴、多巴胺、美金刚、卡巴拉汀、左旋多巴及其代谢物（3-甲氧基多巴）同时检测的方法的存在。且目前提供的检测方法中，一般存在样品量需求较大、样品前处理条件复杂、样本稳定性差、同类药物检测方法差异大、检测难度大检测效率低等问题，尚不适于大通量的样本检测。
发明内容
为了解决上述技术问题，本公开提供了一种同时检测血液中6种药物浓度的方法。本公开提供的检测方法在满足检测要求的前提下，能够减少样品用量，延长样本稳定性，降低检测难度，提高检测效率。
第一方面，本公开提供了一种同时检测血液中6种药物浓度的方法，所述方法包括：
（1）配制至少三种不同浓度的含有6种药物及其内标物的标准溶液，并利用液相色谱-质谱对所述标准溶液进行检测，根据检测结果分别建立所述6种药物的标准曲线；
（2）将待测样品与稳定剂混合保存备用，待测试之前，混合液与内标物混合、离心，取上清液作为进样样品；
（3）利用液相色谱-质谱对所述进样样品进行检测，根据检测结果和所述标准曲线确定所述待测样品中6种药物的含量；
其中，所述6种药物为卡比多巴、多巴胺、美金刚、卡巴拉汀、左旋多巴和3-甲氧基多巴。
本公开提供的检测方法能够一针测得6种药物的含量，检测时间短，在5.5 min以内出结果，提高检测效率的同时降低操作难度，适用于高通量样本的检测。
本公开待测样品中添加同位素内标物经稳定剂沉淀蛋白后取上清液直接进样，检测过程简便快速，分析时间短；另外通过对待测样品中添加稳定剂能够延长其稳定时间更利于大通量的样本检测。
作为本公开的一种优选技术方案，所述稳定剂为含有5-10%酸类化合物（例如6%、7%、8%、9%等）和5-15%焦亚硫酸钠的水溶液（例如6%、8%、10%、12%、14%等），所述酸类化合物选自高氯酸、磺基水杨酸或三氯乙酸。
卡比多巴、多巴胺、卡巴拉汀、左旋多巴等在血清/血浆中均不稳定，利用本公开提供的稳定剂处理后的样品更加稳定，常温可保存24 h，4℃可保存48 h，降低样品运输要求和运输成本，提取回收率高，基质效应小，而且操作简单易行。
作为本公开的一种优选技术方案，所述待测样品和稳定剂的体积比为1:(1-3)，例如1:1.5、1:2、1:2.5等。
作为本公开的一种优选技术方案，所述液相色谱的条件包括：
流动相：A相为含有0.2-3%甲酸、1-10 mmol/L甲酸铵或乙酸铵的水溶液，B相为乙腈；
梯度洗脱：
0.00 min：A相98-80%，B相2-20%；
0.50 min：A相98-80%，B相2-20%；
0.60 min：A相60-40%，B相40-60%；
1.00 min：A相60-40%，B相40-60%；
1.10 min：A相5-15%，B相95-85%；
2.50 min：A相5-15%，B相95-85%；
3.00 min：A相98-80%，B相2-20%；
5.50 min：A相98-80%，B相2-20%。
所述0.2-3%甲酸可以为0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%等；所述1-10mmol/L可以为2mmol/L、4 mmol/L、6 mmol/L、8 mmol/L等。
在梯度洗脱条件中，对于0.00-0.50 min，A相可以为96%、94%、90%、85%等，B相可以为3%、5%、10%、15%等。对于0.60-1.00 min，A相可以为58%、55%、52%、50%、48%、45%、42%等，B相可以为42%、45%、48%、50%、52%、55%、58%等。对于1.10-2.50 min，A相可以为6%、8%、10%、12%、13%、14%等，B相可以为94%、92%、90%、88%、87%、86%等。对于3.00-5.50 min，A相可以为96%、94%、90%、85%等，B相可以为3%、5%、10%、15%等。
作为本公开的一种优选技术方案，柱温为35-40℃，例如36℃、37℃、38℃、39℃等。
作为本公开的一种优选技术方案，所述流动相的流速为0.3-0.5mL/min，例如0.35mL/min、0.4 mL/min、0.45 mL/min等。
作为本公开的一种优选技术方案，所述液相色谱的条件包括：使用的分析色谱柱为Agilent Poroshell 120 EC-C18、phenomenex Kinetex F5。
本公开通过对液相条件的优化，如流动相的选择（水相中盐浓度及酸浓度的选择、有机相的选择等）、梯度洗脱程序优化及色谱柱的选择使卡比多巴、多巴胺、美金刚、卡巴拉汀、左旋多巴及其代谢物3-甲氧基多巴得到良好的色谱峰形，且色谱分离，避免离子串扰并有效降低基质效应。
作为本公开的一种优选技术方案，所述质谱的条件包括：雾化气温度：300-400℃，雾化气气流：10-14 L/min，喷雾器：40-50psi，毛细管电压：4000-4500 V，电子倍增器电压值：300-350 V。
所述雾化气温度：300-400℃，可以为320℃、340℃、360℃、380℃等；所述雾化气气流：10-14 L/min，可以为11 L/min、12 L/min、13 L/min等；所述喷雾器：40-50 psi，可以为42 psi、44 psi、46 psi、48 psi等；所述毛细管电压：4000-4500 V，可以为4100 V、4200 V、4300 V、4400V等；所述电子倍增器电压值：300-350 V，可以为310 V、320 V、330V、340 V等。
作为本公开的一种优选技术方案，所述6种药物的内标物分别为卡比多巴-d3、多巴胺-d3、美金刚-d6、卡巴拉汀-d6、左旋多巴-d3和3-甲氧基多巴-d3。
作为本公开的一种优选技术方案，在步骤（2）中，所述内标物以内标工作液的形式与待测样品混合，所述内标工作液为含有所述6种药物的内标物的溶液，所述待测样品和所述内标工作液的体积比为(5-10):1，例如6:1、7:1、8:1、9:1等。
作为本公开的一种优选技术方案，在步骤（2）中，所述待测样品为血浆或血清。
作为本公开的一种优选技术方案，所述标准溶液的制备方法包括：制备至少三个级别浓度的标准工作液，标准工作液、内标工作液和蛋白沉淀剂混合，取上清液为所述标准溶液，所述蛋白沉淀剂为含有5-10%酸类化合物的水溶液，所述酸类化合物选自高氯酸、磺基水杨酸或三氯乙酸。
所述含有5-10%酸类化合物的水溶液可以是6%、7%、8%、9%等，所述含有5-10%磺基水杨酸的水溶液可以是6%、7%、8%、9%等。
为了使建立的标曲更能符合待测样品的检测，准确性更高，因此，本公开所述标准溶液的制备方法参照待测样品的前处理方法进行，由于标准工作液中已经含有稀释剂I，即已经含有焦亚硫酸钠，因此此处只添加蛋白沉淀剂酸类化合物即可（此处使用的蛋白沉淀剂中酸类化合物的种类和浓度与样品前处理中稳定剂中酸类化合物的种类和浓度相同）。焦亚硫酸钠和酸类化合物配合使用能够减少杂质干扰、降低残留、降低基质效应，使得到的标准曲线更加稳定。
作为本公开的一种优选技术方案，各所述级别浓度的标准工作液均利用稀释剂I由标准中间液稀释得到，所述标准中间液利用稀释剂I由标准品储备液稀释得到，所述标准品储备液是利用溶剂分别溶解所述6种药物各自的标准品得到。
作为本公开的一种优选技术方案，所述内标工作液利用稀释剂II由内标中间液稀释得到，所述内标中间液利用稀释剂II由内标储备液稀释得到，所述内标储备液是利用溶剂分别溶解所述6种药物各自的内标物标准品得到。
在本公开中，部分药物可以直接由储备液制备得到工作液，则此时，无需制备中间液。
作为本公开的一种优选技术方案，所述稀释剂I为含有焦亚硫酸钠的甲醇水溶液，所述甲醇水溶液的浓度为5-15%，例如6%、8%、10%、12%、14%等。
本公开稀释剂I中含有焦亚硫酸钠，所述焦亚硫酸钠的浓度为5-15%，例如6%、8%、10%、12%、14%等，优选为10%。本公开利用稀释剂I对标准品储备液进行稀释，能够使得到的标准中间液更加稳定，存储稳定性高，无需现用现配，且得到的标准曲线也更加稳定。
作为本公开的一种优选技术方案，所述稀释剂II为浓度为65-75%的甲醇水溶液，所述65-75%可以为66%、68%、70%、72%、74%等。
本公开实施例提供的技术方案与现有技术相比具有如下优点：
1、本公开提供的检测方法能够一针测得6种药物的含量，检测时间短，在5.5 min以内出结果，提高检测效率的同时降低操作难度，适用于高通量样本的检测。
2、本公开提供的检测方法通过对流动相、洗脱梯度、色谱柱的优化使药物有效分离避免离子串扰，结合特定的酸类化合物和焦亚硫酸钠，能够减少杂质干扰、降低残留、降低基质效应，使待测样品和标准曲线更加稳定，提高了检测结果的准确度。
3、本公开提供样品前处理的方法中的稳定剂中含有焦亚硫酸钠，能够使待测样品更加稳定，常温可保存24 h，4℃可保存48 h，降低样品运输要求和运输成本。
附图说明
此处的附图被并入说明书中并构成本说明书的一部分，示出了符合本公开的实施例，并与说明书一起用于解释本公开的原理。
为了更清楚地说明本公开实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，对于本领域普通技术人员而言，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本公开实施例所述标准溶液中卡比多巴、多巴胺、美金刚、卡巴拉汀、左旋多巴及其代谢物3-甲氧基多巴的色谱图；
图2为本公开实施例所述血浆样品中卡比多巴、多巴胺、美金刚、卡巴拉汀、左旋多巴及其代谢物3-甲氧基多巴的色谱图；
图3为使用实施例4的色谱柱得到的色谱图；
图4为使用实施例7的稳定剂得到的色谱图；
图5为使用对比例1提供待测样本处理方法后得到的色谱图；
图6为使用对比例2的稳定剂得到的色谱图；
图7为使用对比例4的梯度条件得到的色谱图。
具体实施方式
为了能够更清楚地理解本公开的上述目的、特征和优点，下面将对本公开的方案进行进一步描述。需要说明的是，在不冲突的情况下，本公开的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本公开，但本公开还可以采用其他不同于在此描述的方式来实施；显然，说明书中的实施例只是本公开的一部分实施例，而不是全部的实施例。
实施例1
本实施例提供了一种标准工作液的制备方法。
（1）配制6种药物标准品储备液
天平精密称量左旋多巴标准品2.50 mg于2 mL冻存管中，加入2mL甲醇:水=7:3溶液进行溶解，再加入40 μL甲酸，纯度为99.5%，混匀得到浓度为1221.31 μg/mL的储备液；
天平精密称量3-甲氧基多巴标准品3.750 mg于2 mL冻存管中，加入0.5 mL甲醇溶解，再加入1 mL甲醇:水=1:1溶液，纯度为100.0%，混匀得到浓度为2500.00 μg/mL的储备液；
天平精密称量卡比多巴标准品3.62 mg于2 mL冻存管中，加入2mL甲醇:水=7:3溶液进行溶解，再加入40 μL甲酸，纯度为92.0%，混匀得到浓度为1627.68 μg/mL的储备液；
天平精密称量美金刚标准品（盐酸美金刚）3.147 mg于2 mL冻存管中，加入1 mL甲醇溶解，再加入0.5 mL甲醇:水=7:3溶液，纯度为100.0%，混匀得到浓度为1727.92 μg/mL的储备液；
天平精密称量多巴胺标准品（盐酸多巴胺）1.85 mg于2 mL冻存管中，加入1.5 mL甲醇溶解，纯度为100.0%，混匀得到浓度为992.13μg/mL的储备液；
天平精密称量卡巴拉汀标准品（酒石酸卡巴拉汀）2.00 mg于2 mL冻存管中，加入1.5 mL甲醇:水=7:3溶液，纯度为100.0%，混匀得到浓度为833.57 μg/mL的储备液。
（2）利用含有10%焦亚硫酸钠的甲醇:水=1:9的稀释剂配制标准中间液，标准中间液混合，并利用含有10%焦亚硫酸钠的甲醇:水=1:9的稀释剂进行稀释得到具有8种级别浓度的标准工作液，具体见表1：
表1
Figure SMS_1
实施例2
本实施例提供了一种内标工作液的制备方法。
（1）配制内标储备液
左旋多巴-d3标准品规格为2.00 mg，纯度为98.7%，先加入1 mL甲醇:水=1:1溶液，再加入40 μL甲酸，最后加入960 μL甲醇:水=7:3溶液，得到浓度为987 μg/mL的储备液；
卡比多巴-d3标准品规格为1.00 mg，纯度为99.1%，先加入0.5 mL甲醇:水=1:1溶液，再加入20 μL甲酸，最后加入480 μL甲醇:水=7:3溶液，得到浓度为991 μg/mL的储备液；
多巴胺-d3标准品为多巴胺-[d3]盐酸盐，规格为2.00 mg，纯度为99.2%，加入1 mL甲醇，再加入1 mL甲醇:水=7:3溶液，得到浓度为803.24 μg/mL的储备液；
美金刚-d6标准品为美金刚-d6盐酸盐，规格为2.00 mg，纯度为97.8%，加入1 mL甲醇，再加入1 mL甲醇:水=7:3溶液，得到浓度为815.73 μg/mL的储备液；
卡巴拉汀-d6标准品为卡巴拉汀-[d6]酒石酸盐，规格为1.00 mg，纯度为99.3%，加入0.5 mL甲醇，再加入0.5 mL甲醇:水=7:3溶液，得到浓度为618.05 μg/mL的储备液；
3-甲氧基多巴-d3标准品规格为1.00 mg，纯度为89.4%，加入0.5 mL甲醇，再加入0.5 mL甲醇:水=7:3溶液，得到浓度为894 μg/mL的储备液。
（2）利用甲醇:水=7:3的稀释剂配制内标中间液，内标储备液/内标中间液混合，并利用甲醇:水=7:3的稀释剂稀释得到内标工作液，具体见表2：
表2
Figure SMS_2
实施例3
本实施例提供了一种样本处理方法以及检测方法。
（1）配制标准溶液
a.内标工作液和标准工作液在室温下放置30 min，以平衡至室温；
b.取9支1.5 mL离心管，分别编号为L8-L1、空白，用微量移液器（量程：0.5-10 µL）吸取10 µL内标工作液加入到编号L8-L1的离心管中，空白的离心管中加入10 µL甲醇:水=7:3的稀释剂。
c.用微量移液器（量程：0.5-10 µL）吸取各标准品工作液10 µL，加入相应编号的离心管中，编号为空白的离心管中加入10 µL含10%焦亚硫酸钠的甲醇:水=1:9的稀释剂，准确吸取90 μL纯水和100 μL 6%高氯酸的水溶液到上述各离心管中，2000 r/min混匀1 min，得到8种不同浓度的标准溶液。
（2）待测样品前处理
a.样品采集
样本类型：EDTA血浆
容器和添加剂类型：紫帽管/EDTA抗凝管
采集与处理：静脉采血，3500 r/min离心10 min，及时分离血浆。取1 mL血浆加入1mL稳定剂（6%高氯酸+10%焦亚硫酸钠），混匀。
保存方法：避光，冷藏，4℃可保存48h，常温可保存24h。
b.样品处理
移液枪移取10 µL内标工作液至1.5 mL塑料离心管中，加入200µL样品，2000r/min涡旋混匀5 min，然后14000 r/min离心10 min，取上清液100 µL作为待测样品。
（3）标准溶液和待测样品的检测
使用高效液相色谱质谱联用仪对标准溶液进行检测，分别建立6种药物的标准曲线；
在建立标准曲线时，以目标物的峰面积和其对应内标峰面积的比值为Y，以目标物的浓度和其对应内标浓度的比值为X；
使用高效液相色谱质谱联用仪对待测样品进行检测，并利用建立的标准曲线确定待测样品中6种药物的浓度。
检测参数为：
A、检测仪器为安捷伦MS6470A 检测器
色谱分析所使用的色谱柱为Agilent Poroshell 120 EC-C18，3.0×100mm，2.7 µm；
流动相：A相为含0.3%甲酸的6 mmol/L甲酸铵水溶液，B相为乙腈；分析色谱柱采用梯度洗脱方式，流速为0.4 mL/min，柱温为40℃，进样量为5 µL；分析时间5.5 min，梯度洗脱条件见表3：
表3
Figure SMS_3
对于质谱条件，采用电喷雾离子源（ESI），正离子模式，多反应监测(MRM)，具体参数见表4，离子对参数见表5。
表4
Figure SMS_4
表5
Figure SMS_5
标准溶液中卡比多巴、多巴胺、美金刚、卡巴拉汀、左旋多巴及其代谢物3-甲氧基多巴的色谱图见图1，在图1中，从左往右依次为左旋多巴、多巴胺、卡比多巴、3-甲氧基多巴、美金刚和卡巴拉汀的色谱峰，血浆样品中卡比多巴、多巴胺、美金刚、卡巴拉汀、左旋多巴及其代谢物3-甲氧基多巴的色谱图见图2，在图2中，从左往右依次为左旋多巴、多巴胺、卡比多巴、3-甲氧基多巴、美金刚和卡巴拉汀的色谱峰。由图可知，本公开提供的样品前处理方法结合液相色谱-质谱检测条件，能够准确的分离并检测6种药物的含量。由图可知，各药物保留时间如下表6所示：
表6
Figure SMS_6
实施例4
本实施例提供了一种检测方法。
与实施例3的区别在于，在本实施例中，色谱分析所使用的色谱柱为phenomenexKinetex F5，得到的色谱图见图3。
实施例5
本实施例提供了一种检测方法。
与实施例3的区别在于，在本实施例中，A相为含3%甲酸的1mmol/L甲酸铵水溶液，B相为乙腈，柱温为35℃，梯度洗脱条件见表7：
表7
Figure SMS_7
实施例6
本实施例提供了一种检测方法。
与实施例3的区别在于，在本实施例中，A相为含1.5%甲酸的10mmol/L甲酸铵水溶液，B相为乙腈，柱温为40℃，梯度洗脱条件见表8：
表8
Figure SMS_8
性能分析1
对本公开实施例3-6提供的分析方法进行线性、回收率和精密度、基质效应等分析，方法如下：
（1）线性分析
对实施例3得到的6种药物的标准曲线论证其线性关系，结果见表9：
表9
Figure SMS_9
由表7可知，本公开提供的分析方法的检测范围广，且线性相关性好。实施例4-6的线性范围与实施例3的线性范围类似，具体的检测限和定量限结果见表10：
表10
Figure SMS_10
由表9-10可知，本公开提供的检测方法的检测限和定量限等各项指标均符合要求。
（2）回收率和精密度
分别取卡比多巴、多巴胺、美金刚、卡巴拉汀、左旋多巴和3-甲氧基多巴的标准工作液配制成低、中、高3种浓度进行加样回收率实验和精密度实验，按实施例3-6提供的方法进行测定，重复分析测定5批次，回收率和精密度分别如下表11-12和表13-14所示：
表11：回收率
Figure SMS_11
表12：回收率
Figure SMS_12
表13：精密度
Figure SMS_13
表14：精密度
Figure SMS_14
由表11-14可知，低、中、高的3个添加水平范围内的平均回收率为91.25%-107.99%，精密度为1.04%-5.95%，本公开提供的分析方法回收率、精密度均符合要求，重现性良好，加样回收率高，提高了检测结果的准确度。
（3）基质效应
在同一份高浓度（浓度大于等于10×基质样本中浓度）的标准溶液中加入不同基质比例的样本（90%基质、80%基质、50%基质、20%基质、0基质），每个基质样本考察5个不同比例条件。对实施例3的研究发现：
1.不同基质相同基质比例的目标物面积/内标面积的RSD≤10%；
2.相同基质不同基质比例的目标物面积/内标面积比值偏倚=（X基质-0基质）/0基质均小于10%，均符合要求。
实施例7-12
本实施例提供了一种样本处理方法以及检测方法。
与实施例3的区别在于，在本实施例中，步骤（2）待测样品前处理中的稳定剂为6%磺基水杨酸和10%的焦亚硫酸钠（实施例7）、5%高氯酸+15%焦亚硫酸钠（实施例8）、10%高氯酸+5%焦亚硫酸钠（实施例9）、6%三氯乙酸和10%的焦亚硫酸钠（实施例10）、5%三氯乙酸和9%的焦亚硫酸钠（实施例11）、10%三氯乙酸和5%的焦亚硫酸钠（实施例12），对应性的替换标准溶液中的酸和焦亚硫酸钠的种类和浓度。
对比例1
本对比例提供了一种样本处理方法以及检测方法。
与实施例3的区别在于，在本对比例中，步骤（2）待测样品前处理中的稳定剂为乙腈（沉淀剂），对应性的替换标准溶液中的高氯酸。
对比例2
本对比例提供了一种样本处理方法以及检测方法。
与实施例3的区别在于，在本对比例中，将实施例3中使用的6%高氯酸替换为10%氢氟酸，对应性的替换标准溶液中的高氯酸。
性能分析2
对实施例3、7-12和对比例1-2的提供的样品前处理方法利用实施例3提供的检测方法进行色谱分析，分析结果如下：
图4为使用实施例7的稳定剂得到的色谱图，实施例8-12得到的色谱图与之类似，由图可知，采用本公开使用的稳定剂（沉淀剂）的除杂效果好，且对卡比多巴等稳定效果佳，基质效应小，能够满足定量要求的同时能够准确定量。图5为使用对比例1提供待测样本处理方法最后得到的液相色谱图，由图2和图5对比可知，使用乙腈进行样本前处理，有明显的溶剂效应，卡比多巴、多巴胺、左旋多巴基质效应极强，定量限不能满足检测要求。图6为使用对比例2的稳定剂得到的色谱图，由图6可知，使用氢氟酸与本公开使用的稳定剂可达相似效果，但氢氟酸易挥发，有剧烈刺激性气味且具有极强的腐蚀性，对人体危害极大。
对比例3
本对比例提供了一种检测方法。
与实施例3的区别在于，在本对比例中，色谱分析中的流动相B相为甲醇。
对比例4
本对比例提供了一种检测方法。
与实施例3的区别在于，在本对比例中，色谱分析中的梯度洗脱条件见表15：
表15
Figure SMS_15
性能分析3
（1）对实施例3和对比例3提供的检测方法进行美金刚残余信号评价，结果见表16：
表16
Figure SMS_16
由表16可知，本公开使用乙腈作为流动相B，美金刚的残余更低，一方面能够提高美金刚的检测准确性，另一方面能够避免后续的清洗时间过长，能够降低整体分析时间。
（2）对实施例3和对比例4提供的检测方法进行回收率和精密度评价，结果见表17：
表17：回收率
Figure SMS_17
表18：精密度
Figure SMS_18
由实施例和对比例的性能测试可知，利用本公开提供的梯度洗脱条件配合其他条件使用，能够得到良好的色谱分离及较高的准确度和精密度。
图7为使用对比例4的梯度条件得到的色谱图，由图7可知，对比例4相对于本公开梯度洗脱条件，色谱分离较差，个别物质严重拖尾且准确度较低，精密度较差。
需要说明的是，在本文中，诸如“第一”和“第二”等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同要素。
以上所述仅是本公开的具体实施方式，使本领域技术人员能够理解或实现本公开。对这些实施例的多种修改对本领域的技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本公开的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本公开将不会被限制于本文所述的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims (10)

1.一种同时检测血液中6种药物浓度的方法，其特征在于，所述方法包括：
（1）配制至少三种不同浓度的含有6种药物及其内标物的标准溶液，并利用液相色谱-质谱对所述标准溶液进行检测，根据检测结果分别建立所述6种药物的标准曲线；
（2）将待测样品与稳定剂混合保存备用，待测试之前，混合液与内标物混合、离心，取上清液作为进样样品；
（3）利用液相色谱-质谱对所述进样样品进行检测，根据检测结果和所述标准曲线确定所述待测样品中6种药物的含量；
其中，所述6种药物为卡比多巴、多巴胺、美金刚、卡巴拉汀、左旋多巴和3-甲氧基多巴；
所述稳定剂为含有5-10%酸类化合物和5-15%焦亚硫酸钠的水溶液，所述酸类化合物选自高氯酸、磺基水杨酸或三氯乙酸；
所述液相色谱的条件包括：
流动相：A相为含有0.2-3%甲酸、1-10 mmol/L甲酸铵或乙酸铵的水溶液，B相为乙腈；
梯度洗脱：
0.00 min：A相98-80%，B相2-20%；
0.50 min：A相98-80%，B相2-20%；
0.60 min：A相60-40%，B相40-60%；
1.00 min：A相60-40%，B相40-60%；
1.10 min：A相5-15%，B相95-85%；
2.50 min：A相5-15%，B相95-85%；
3.00 min：A相98-80%，B相2-20%；
5.50 min：A相98-80%，B相2-20%。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述待测样品和稳定剂的体积比为1:(1-3)。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述液相色谱的条件包括：
柱温为35-40℃；
和/或，所述流动相的流速为0.3-0.5 mL/min。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述液相色谱的条件包括：使用的分析色谱柱为Agilent Poroshell 120 EC-C18、phenomenex Kinetex F5。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述质谱的条件包括：雾化气温度：300-400℃，雾化气气流：10-14 L/min，喷雾器：40-50psi，毛细管电压：4000-4500 V，电子倍增器电压值：300-350 V。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述6种药物的内标物分别为卡比多巴-d3、多巴胺-d3、美金刚-d6、卡巴拉汀-d6、左旋多巴-d3和3-甲氧基多巴-d3。
7.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，在步骤（2）中，所述内标物以内标工作液的形式与待测样品混合，所述内标工作液为含有所述6种药物的内标物的溶液，所述待测样品和所述内标工作液的体积比为(5-10):1；
和/或，所述待测样品为血浆或血清。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其特征在于，所述标准溶液的制备方法包括：制备至少三个级别浓度的标准工作液，标准工作液、内标工作液和蛋白沉淀剂混合，取上清液为所述标准溶液，所述蛋白沉淀剂为含有5-10%酸类化合物的水溶液，所述酸类化合物选自高氯酸、磺基水杨酸或三氯乙酸。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，各所述级别浓度的标准工作液均利用稀释剂I由标准中间液稀释得到，所述标准中间液利用稀释剂I由标准品储备液稀释得到，所述标准品储备液是利用溶剂分别溶解所述6种药物各自的标准品得到；
所述内标工作液利用稀释剂II由内标中间液稀释得到，所述内标中间液利用稀释剂II由内标储备液稀释得到，所述内标储备液是利用溶剂分别溶解所述6种药物各自的内标物标准品得到。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述稀释剂I为含有焦亚硫酸钠的甲醇水溶液，所述甲醇水溶液的浓度为5-15%；
和/或，所述稀释剂II为浓度为65-75%的甲醇水溶液。
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