CN110568103A - 一种氘代标记物及其在食用香精3-乙酰基-2,5-二甲基噻吩检测中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种氘代标记物及其在食用香精3‑乙酰基‑2,5‑二甲基噻吩检测中的应用，本发明首次采用同位素内标‑超高效液相色谱‑三重四极杆质谱联用法测定食用香精中的3‑乙酰基‑2,5‑二甲基噻吩，以目标物的氘代同位素标记物为内标，能更好校正不同香精可能存在的基质效应及提取效果的差异，同时也能减少系统误差，提高了定量的准确性和方法的稳定性，应用更广。采用超高效液相色谱‑三重四极杆质谱联用仪来测定，拓展了3‑乙酰基‑2,5‑二甲基噻吩的检测手段。本方法前处理简单，重复性佳，结果可靠，在样品量为0.1g、定容体积为10mL时，方法的定量限为1mg/kg。

Description

一种氘代标记物及其在食用香精3-乙酰基-2,5-二甲基噻吩 检测中的应用
(一)技术领域
本发明涉及食品添加剂检测技术领域，具体涉及同位素内标-超高效液相色谱-三重四极杆质谱联用法测定食用香精中3-乙酰基-2,5-二甲基噻吩的方法。
(二)背景技术
食用香精香料是现代食品工业不可或缺的食品添加剂，往往由数种甚至几十、上百种天然或合成香料复配而成。3-乙酰基-2,5-二甲基噻吩是一种具有烧烤、坚果气味的合成香料，在我国国家标准GB 2760-2014《食品安全国家标准食品添加剂使用标准》中，允许其作为食品用合成香料使用，但在2013年6月，欧洲食品安全管理局经过评估认为其在体内和体外试验均表现出致突变性，作为食品用香料使用存在安全问题。同年6月，欧盟委员会通过法规(Regulation(EC)No 545/2013)，禁止该物质作为食品用香料使用。中国香精香料化妆品工业协会也于同年8月发布自律文件(香化协字[2013]62号)，要求香料生产企业不得生产用作食品用香料的3-乙酰基-2,5-二甲基噻吩，食品用香精生产企业调整配方，不得使用该物质。
目前对3-乙酰基-2,5-二甲基噻吩的定量检测在国标中尚属空白，已报道的检测方法以气相色谱-质谱联用法为主，以草酸二乙酯为内标进行定量，或直接以外标法定量。在质谱检测中常采用内标法定量来减少因操作误差以及仪器波动对定量结果产生的影响，但以草酸二乙酯为内标进行定量时，因香精成分复杂多变，并不能保证任何香精成分中均不含该物质，因此以该物质作为内标进行定量时只适用于本身不含草酸二乙酯的香精样品。且质谱检测常存在基质效应，内标物与目标物若基质效应不一致，也会造成定量的不准确。
以目标物的同位素标记物作为内标物进行定量是在质谱检测中更准确的定量方法。除具备普通内标的优点外，同位素内标与目标物近乎一致的理化性质，能更好地校正样品在提取时的提取效率，并且在仪器测定时，因与目标物具有相同的基质效应，只需配制一条溶剂标曲就能校准不同样品中目标物的含量，获得更准确的定量结果。然而由于3-乙酰基-2,5-二甲基噻吩的检测在国内仍然较少，其同位素标记的内标物也未见报道，在市场上也无法购得。为了填补这一空白，设计合理的合成方法制备3-乙酰基-2,5-二甲基噻吩的同位素标记内标物对于该物质的分析检测具有重要的意义。
(三)发明内容
本发明首次设计合成了3-乙酰基-2,5-二甲基噻吩的氘代标记物3-乙酰基-2,5-二甲基噻吩-D3，并以此化合物作为内标，为更准确地测定食用香精中3-乙酰基-2,5-二甲基噻吩提供了一种适用范围更加广泛的方法。另外，本发明采用超高效液相色谱-三重四极杆质谱联用法，丰富了对3-乙酰基-2,5-二甲基噻吩的检测手段，结合原有的气相色谱-质谱联用法，便于各实验室根据已有的检测设备灵活选择。
本发明采用的技术方案是：
本发明提供一种式(3)所示氘代标记物3-乙酰基-2,5-二甲基噻吩-D3，
本发明还提供一种式(3)所示氘代标记物3-乙酰基-2,5-二甲基噻吩-D3的制备方法：在冰盐浴冷却条件下(优选-15℃)，向2,5-二甲基噻吩(2)的CS2溶液中滴加氘代乙酰氯(1)，在搅拌条件下加入无水氯化铝(优选十分钟内平均分六次加入研磨成粉状的无水氯化铝)，缓慢升温至室温，TLC(薄层色谱，展开剂为体积比10:1的石油醚/乙酸乙酯)检测，继续搅拌直至反应结束，所得混合物倒入0℃冰水中，用乙醚萃取(优选30mL×3次)，收集乙醚层，用无水硫酸镁干燥后，过滤，取滤液浓缩至干，浓缩物以体积比10:1的石油醚/乙酸乙酯为洗脱液进行硅胶柱层析分离，TLC跟踪检测，以体积比10:1的石油醚/乙酸乙酯为展开剂，收集Rf值为0.48的组分，得到内标物3-乙酰基-2,5-二甲基噻吩-D3(3)。
所述2,5-二甲基噻吩与氘代乙酰氯物质的量之比为1:1.1；所述2,5-二甲基噻吩与无水氯化铝物质的量之比为1:1.2；所述CS2体积用量以2,5-二甲基噻吩物质的量计为2mL/mmol。
所述D3-氘代乙酰氯(1)按如下方法制备：在回流条件下，往二氯亚砜中缓慢滴加氘代乙酸(过量)，反应至没有气体产生即结束，混合物经蒸馏得到无色油状氘代乙酰氯(1)。
本发明还提供一种3-乙酰基-2,5-二甲基噻吩-D3在食用香精中3-乙酰基-2,5-二甲基噻吩检测中的应用，所述应用的方法为：将待测食用香精样品加入装有内标工作液的容量瓶中，再加入提取溶剂，室温下超声提取30min，静置冷却至室温后用提取溶剂定容，混匀，(若提取溶剂与待测香精不能互溶，则增加离心步骤，优选5000r/min离心5min使分层，取上清液过滤)，过0.22μm有机相滤膜，取续滤液采用超高效液相色谱-三重四极杆质谱联用仪(UPLC-MS/MS)进行检测，MRM模式监测，内标法定量，根据3-乙酰基-2,5-二甲基噻吩标准曲线，获得待测食用香精样品中3-乙酰基-2,5-二甲基噻吩含量；所述内标工作液是将内标物3-乙酰基-2,5-二甲基噻吩-D3用提取溶剂配制而成(优选用甲醇溶解配制成浓度为1mg/mL的内标储备液，再将内标储备液用体积浓度80％甲醇水溶液稀释得到浓度为100μg/mL的内标工作液)；所述提取溶剂为甲醇、乙腈、体积浓度80％甲醇水溶液或体积浓度80％乙腈水溶液；所述3-乙酰基-2,5-二甲基噻吩标准曲线是以3-乙酰基-2,5-二甲基噻吩与内标物浓度比为横坐标，以3-乙酰基-2,5-二甲基噻吩与内标物峰面积比为纵坐标制成；所述待测样品中内标物终浓度与3-乙酰基-2,5-二甲基噻吩标准曲线制作中内标物终浓度相同；所述待测样品终浓度为10g/L。
优选，将待测食用香精样品加入装有50μL内标工作液的10mL容量瓶中，再加入6mL提取溶剂，室温下超声提取30min，静置冷却后用提取剂定容，混匀，(若提取溶剂与待测香精不能互溶，则增加离心，优选5000r/min离心5min使分层，取上清液)，提取液过0.22μm有机相滤膜，取续滤液采用超高效液相色谱-三重四极杆质谱联用仪(UPLC-MS/MS)进行检测；所述内标工作液是将内标物3-乙酰基-2,5-二甲基噻吩-D3用提取溶剂(优选为甲醇)溶解配制成浓度为1mg/mL的内标储备液，再将内标储备液用提取溶剂(优选为体积浓度80％甲醇水溶液)稀释得到浓度为100μg/mL的内标工作液。
所述3-乙酰基-2,5-二甲基噻吩标准曲线按如下方法制作：称取3-乙酰基-2,5-二甲基噻吩标准品用提取溶剂(优选为甲醇)溶解配制成浓度为1mg/mL的标准储备液；取标准储备液用提取溶剂(优选为80％甲醇水溶液)稀释得到浓度为10μg/mL的标准工作液；分别准确吸取10μg/mL的3-乙酰基-2,5-二甲基噻吩标准工作液20.0μL、50.0μL、100.0μL、200.0μL、0.50mL，1.00mL、1.50mL、2.00mL于8个10mL容量瓶中，各加100μg/mL的内标工作液50.0μL，用提取溶剂(优选为体积浓度80％甲醇水溶液)稀释并定容至刻度，得标准品浓度为20ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL、500ng/mL、1000ng/mL、1500ng/mL、2000ng/mL的标准曲线工作溶液，内标物浓度为0.5μg/mL，采用超高效液相色谱-三重四极杆质谱联用仪(UPLC-MS/MS)检测，以3-乙酰基-2,5-二甲基噻吩与内标浓度比为横坐标，以3-乙酰基-2,5-二甲基噻吩与内标峰面积比为纵坐标制成。
优选，所述超高效液相色谱-三重四极杆质谱联用仪(UPLC-MS/MS)检测条件为：
色谱条件：采用Thermo Syncronis C18色谱柱(2.1×100mm，1.7μm)进行分离，柱温35℃，进样量2μL，流动相为0.1％甲酸水(A相)和0.1％甲酸甲醇(B相)，流速为0.2mL/min，洗脱模式为梯度洗脱，梯度洗脱条件如表1所示。
质谱条件：采用电喷雾离子源，扫描方式为正离子扫描，检测模式为多反应监测模式(MRM)，干燥气温度为350℃，干燥气流速为10L/min，鞘气温度为380℃，鞘气流速为11L/min。各化合物的定性定量离子、碰撞能量及去簇电压如表2所示。
与现有技术相比，本发明有益效果主要体现在：
本发明采用商业可得的原料、操作简单的方法高效合成了3-乙酰基-2,5-二甲基噻吩的氘代同位素标记物，并以此为内标，采用同位素内标-超高效液相色谱-三重四极杆质谱联用法测定食用香精中的3-乙酰基-2,5-二甲基噻吩。以目标物的氘代同位素标记物为内标，能更好校正不同香精可能存在的基质效应及提取效果的差异，同时也能减少系统误差，提高了定量的准确性和方法的稳定性，应用更广。采用超高效液相色谱-三重四极杆质谱联用仪来测定，拓展了3-乙酰基-2,5-二甲基噻吩的检测手段。本方法前处理简单，重复性佳，结果可靠，在样品量为0.1g、定容体积为10mL时，方法的定量限为1mg/kg。
(四)附图说明
图1是3-乙酰基-2,5-二甲基噻吩-D3的氢谱。
图2是3-乙酰基-2,5-二甲基噻吩-D3的碳谱。
图3是标准品质谱图，A为总离子流(TIC)图，B为3-乙酰基-2,5-二甲基噻吩定量离子的提取离子图，C为内标定量离子的提取离子图。
图4是加标回收试验样品中3-乙酰基-2,5-二甲基噻吩的质谱图，A为总离子流(TIC)图，B为3-乙酰基-2,5-二甲基噻吩定量离子的提取离子图，C为内标定量离子的提取离子图。
图5是2倍定量限(加标量2mg/kg)的图谱，A为总离子流图，B为3-乙酰基-2,5-二甲基噻吩定量离子的提取离子图。
图6为3-乙酰基-2,5-二甲基噻吩标准曲线。
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
本发明实施例中的样品为稀膏状肉味香精。本发明实施例所述室温是指25±5℃。
实施例1：
一、3-乙酰基-2,5-二甲基噻吩-D3的合成
1、D3-氘代乙酰氯的合成
在回流条件下，往5mL二氯亚砜中缓慢滴加4.5mL氘代乙酸(过量)，反应至没有气体产生即结束，混合物经蒸馏得到4.5g无色油状氘代乙酰氯(1)，待用，基于二氯亚砜收率80％。
2、3-乙酰基-2,5-二甲基噻吩-D3的合成
在-15℃冰盐浴冷却条件下，向2,5-二甲基噻吩(2)(1.12g，10.0mmol)的CS2(20mL)溶液中滴加氘代乙酰氯(1)(0.89g，11.0mmol)，在搅拌条件下，十分钟内平均分六次加入研磨成粉状的无水氯化铝(1.63g，12.0mmol)，缓慢升温至室温，继续搅拌直至TLC(薄层色谱，展开剂为体积比10:1的石油醚/乙酸乙酯)检测反应结束，所得混合物倒入0℃、30mL冰水中，用乙醚萃取(30mL×3次)，收集并合并乙醚层，用无水硫酸镁干燥后，过滤，滤液浓缩至干，所得浓缩物以体积比10:1的石油醚/乙酸乙酯为洗脱液进行硅胶柱层析提纯，硅胶柱高30cm，内径30mm，TLC跟踪检测，以体积比10:1的石油醚/乙酸乙酯为展开剂，收集Rf值为0.48的流出液，得到目标产物3，即3-乙酰基-2,5-二甲基噻吩-D3 1.10g，质量收率70％，3-乙酰基-2,5-二甲基噻吩-D3氢谱见图1所示，碳谱见图2所示。
1H NMR(500MHz,CDCl3):δ＝6.98(s,1H),2.66(s,3H),2.40(s,3H)ppm；
13C NMR(125MHz,CDCl3):δ＝194.2,147.2,135.9,135.0,126.6,29.6-28.6(m),16.0,14.9ppm。
二、标准储备液、内标储备液及各自工作液的配制
标准工作液：称取3-乙酰基-2,5-二甲基噻吩标准品10mg，用甲醇溶解并定容至10mL，配制成浓度为1mg/mL的标准储备液。取标准储备液100.0μL，用80％甲醇水溶液稀释并定容至10mL，得浓度为10μg/mL的标准工作液。
内标工作液：称取10mg 3-乙酰基-2,5-二甲基噻吩-D3，用甲醇溶解并定容至10mL，配制成浓度为1mg/mL的内标储备液。取内标储备液200.0μL，用80％甲醇水溶液稀释并定容至2.0mL，得浓度为100μg/mL的内标工作液。
三、标准曲线工作溶液的制备
分别准确吸取10μg/mL的标准工作液20.0μL、50.0μL、100.0μL、200.0μL、0.50mL，1.00mL、1.50mL、2.00mL于8个10mL容量瓶中，各加100μg/mL的内标工作液50.0μL，用80％甲醇水溶液稀释并定容至刻度，得标准品浓度为20ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL、500ng/mL、1000ng/mL、1500ng/mL、2000ng/mL的标准曲线工作溶液，内标物终浓度均为0.5μg/mL。
四、超高效液相色谱-三重四极杆质谱联用仪(UPLC-MS/MS)气相色谱/质谱条件
色谱条件：采用Thermo Syncronis C18色谱柱(2.1×100mm，1.7μm)进行分离，柱温35℃，进样量2μL，流动相为0.1％甲酸水(A相)和0.1％甲酸甲醇(B相)，流速为0.2mL/min，洗脱模式为梯度洗脱，梯度洗脱条件如表1所示。
表1梯度洗脱条件
质谱条件：采用电喷雾离子源，扫描方式为正离子扫描，检测模式为多反应监测模式(MRM)，干燥气温度为350℃，干燥气流速为10L/min，鞘气温度为380℃，鞘气流速为11L/min，各化合物的定性定量离子、碰撞能量及去簇电压如表2所示。
表2各化合物的定性定量离子、碰撞能量及去簇电压
*定量离子
五、标准曲线的制作
采用超高效液相色谱-三重四极杆质谱联用仪(UPLC-MS/MS)，根据步骤四条件上机测定不同浓度的标准曲线工作溶液，MRM模式监测，内标法定量，典型质谱图见图3，以标准品与内标物浓度比为横坐标，以标准品与内标物峰面积比值为纵坐标，绘制标准曲线，见图6所示。
六、样品测定
准确称取食用香精样品0.1g于10mL容量瓶中，加入100μg/mL的内标工作液50.0μL，加6mL 80％甲醇水溶液，室温下超声(100Hz)提取30min，静置冷却后用80％甲醇水溶液定容，其中内标终浓度为0.5μg/mL，混匀后5000r/min离心5min使分层，上部提取液过0.22μm有机相滤膜，取滤液采用超高效液相色谱-三重四极杆质谱联用仪(UPLC-MS/MS)，根据步骤四条件上机测定，MRM模式监测，内标法定量，根据标准曲线中标准品与内标物峰面积比值，获得待测食用香精中3-乙酰基-2,5-二甲基噻吩含量。
经测试发现，试剂空白无干扰，样品未检出。
七、回收率与方法精密度试验
准确称取食用香精样品0.1g于10mL容量瓶中，按表3所列的加标量进行加标，然后同样品检测条件处理，取续滤液上机测定，考察加标回收率，典型质谱图见图4，结果见表3。不同加标浓度平行测定6份，以相对标准偏差(RSD％)来考察方法的精密度。
表3三水平加标回收及精密度试验结果
从表3可知，在该香精样品中，目标物在不同加标浓度下的回收率在97.9～102.0％之间，说明本方法回收良好。平行试验精密度在1.1～3.7％之间，说明本方法重复性好。
图3是标准品典型图谱；图4是加标回收试验样品图谱。从图中可以看到，目标物峰型对称，响应良好。

Claims (10)

1.一种式(3)所示3-乙酰基-2,5-二甲基噻吩-D3，
2.一种权利要求1所述3-乙酰基-2,5-二甲基噻吩-D3的制备方法，其特征在于所述方法为：在冰盐浴冷却条件下，向2,5-二甲基噻吩的CS2溶液中滴加氘代乙酰氯，在搅拌条件下加入无水氯化铝，缓慢升温至室温，TLC检测，展开剂为体积比10:1的石油醚/乙酸乙酯，继续搅拌直至反应结束，所得混合物倒入0℃冰水中，用乙醚萃取，收集乙醚层，用无水硫酸镁干燥后，过滤，取滤液浓缩至干，浓缩物以体积比10:1的石油醚/乙酸乙酯为洗脱液进行硅胶柱层析分离，TLC跟踪检测，以体积比10:1的石油醚/乙酸乙酯为展开剂，收集Rf值为0.48的组分，得到3-乙酰基-2,5-二甲基噻吩-D3。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于所述2,5-二甲基噻吩与氘代乙酰氯物质的量之比为1:1.1；所述2,5-二甲基噻吩与无水氯化铝物质的量之比为1:1.2；所述CS2体积用量以2,5-二甲基噻吩物质的量计为2mL/mmol。
4.如权利要求2所述，其特征在于所述氘代乙酰氯按如下方法制备：在回流条件下，往二氯亚砜中缓慢滴加过量氘代乙酸，反应至没有气体产生即结束，混合物经蒸馏得到无色油状氘代乙酰氯。
5.一种权利要求1所述3-乙酰基-2,5-二甲基噻吩-D3在食用香精中3-乙酰基-2,5-二甲基噻吩检测中的应用。
6.如权利要求4所述的应用，其特征在于所述应用的方法为：将待测食用香精样品加入装有内标工作液的容量瓶中，再加入提取溶剂，室温下超声提取30min，静置冷却至室温后用提取溶剂定容，混匀，过0.22μm有机相滤膜，取续滤液采用超高效液相色谱-三重四极杆质谱联用仪进行检测，MRM模式监测，内标法定量，根据3-乙酰基-2,5-二甲基噻吩标准曲线，获得待测食用香精样品中3-乙酰基-2,5-二甲基噻吩含量；所述内标工作液是将内标物用提取溶剂配制而成，所述内标物为3-乙酰基-2,5-二甲基噻吩-D3；所述提取溶剂为甲醇、乙腈、体积浓度80％甲醇水溶液或体积浓度80％乙腈水溶液；所述3-乙酰基-2,5-二甲基噻吩标准曲线是以3-乙酰基-2,5-二甲基噻吩与内标物浓度比为横坐标，以3-乙酰基-2,5-二甲基噻吩与内标物峰面积比为纵坐标制成。
7.如权利要求5所述的应用，其特征在于所述待测样品终浓度为10g/L。
8.如权利要求5所述的应用，其特征在于所述3-乙酰基-2,5-二甲基噻吩标准曲线按如下方法制作：称取3-乙酰基-2,5-二甲基噻吩标准品用提取溶剂溶解配制成浓度为1mg/mL的标准储备液；取标准储备液用提取溶剂稀释得到浓度为10μg/mL的标准工作液；分别准确吸取10μg/mL的3-乙酰基-2,5-二甲基噻吩标准工作液20.0μL、50.0μL、100.0μL、200.0μL、0.50mL，1.00mL、1.50mL、2.00mL于8个10mL容量瓶中，各加100μg/mL的内标工作液50.0μL，用提取溶剂稀释并定容至刻度，得标准品浓度为20ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL、500ng/mL、1000ng/mL、1500ng/mL、2000ng/mL的标准曲线工作溶液，内标物浓度为0.5μg/mL，采用超高效液相色谱-三重四极杆质谱联用仪检测，以3-乙酰基-2,5-二甲基噻吩与内标浓度比为横坐标，以3-乙酰基-2,5-二甲基噻吩与内标峰面积比为纵坐标制成。
9.如权利要求5所述的应用，其特征在于所述超高效液相色谱-三重四极杆质谱联用仪检测色谱条件：采用Thermo Syncronis C18色谱柱，2.1×100mm，1.7μm，柱温35℃，进样量2μL，流动相为0.1％甲酸水和0.1％甲酸甲醇，流速为0.2mL/min。
10.如权利要求5所述的应用，其特征在于所述超高效液相色谱-三重四极杆质谱联用仪检测质谱条件：采用电喷雾离子源，扫描方式为正离子扫描，检测模式为多反应监测模式，干燥气温度为350℃，干燥气流速为10L/min，鞘气温度为380℃，鞘气流速为11L/min。
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