CN113552265B - 富马酸丙酚替诺福韦合成原料中杂质的检测方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种富马酸丙酚替诺福韦合成原料中杂质的检测方法及应用，该检测方法包括以下步骤：取供试品溶液，通过液相色谱‑质谱联用仪进行检测；液相色谱包括如下条件：流动相A：甲酸溶液；流动相B：乙腈；洗脱方式：梯度洗脱。本发明通过液相色谱‑质谱联用法实现了对L‑丙氨酸异丙酯原料中杂质的质量控制。本发明的检测方法系统适用性好、专属性好、检测限度低、灵敏度高、线性关系好、准确度高、重复性好且稳定性好。

Description

富马酸丙酚替诺福韦合成原料中杂质的检测方法及应用
技术领域
本发明涉及药物分析技术领域，具体涉及一种富马酸丙酚替诺福韦合成原料中杂质的检测方法及应用。
背景技术
乙型肝炎病毒感染为世界性传染病。富马酸丙酚替诺福韦的开发为临床治疗乙型肝炎感染提供了新的选择。
富马酸丙酚替诺福韦原料药的生产过程中可能引入起始原料等有关物质杂质，同时在原料药的生产、贮藏与运输过程中，亦可能产生副产物或其他降解产物，因此对其起始原料的质量把控极为重要。
L-丙氨酸异丙酯为富马酸丙酚替诺福韦合成过程中的一种重要的起始原料，其分子式为C6H13NO2，分子量为131.17，结构式如下：
Figure 668621DEST_PATH_IMAGE002
。
L-丙氨酸异丙酯的纯度对富马酸丙酚替诺福韦原料药的纯度造成影响，因此，对起始原料L-丙氨酸异丙酯中杂质进行质量控制具有重要意义。
相关技术中对L-丙氨酸异丙酯原料中杂质的控制通过对原料中杂质衍生化处理进行检测，衍生化的过程存在响应值偏低的问题，从而导致检测结果准确度较低。
因此，开发一种检测限低且准确度高的L-丙氨酸异丙酯中杂质的检测方法，具有非常重要的社会意义和经济效益。
发明内容
本发明要解决的第一个技术问题为：提供一种系统适用性好、专属性好、检测限度低、灵敏度高、线性关系好、准确度高、重复性好且稳定性好的富马酸丙酚替诺福韦合成原料中杂质的检测方法。
本发明要解决的第二个技术问题为：提供一种富马酸丙酚替诺福韦合成原料的质量控制方法。
为解决上述第一个技术问题，本发明提供的技术方案为：一种富马酸丙酚替诺福韦合成原料中杂质的检测方法，包括以下步骤：
取供试品溶液，通过液相色谱-质谱联用仪进行检测；
液相色谱包括如下条件：
流动相A：甲酸溶液；
流动相B：乙腈；
洗脱方式：梯度洗脱；
梯度洗脱的程序方式为：
0min~4min，流动相A的体积分数为85%~95%；
4min~7min，流动相A的体积分数由85%~95%下降至1%~3%；
7min~9min，流动相A的体积分数保持为1%~3%；
9min~9.1min，流动相A的体积分数由1%~3%升高至85%~95%；
9.1min~15min，流动相A的体积分数保持为85%~95%；
优选地，富马酸丙酚替诺福韦合成原料为L-丙氨酸异丙酯；
更优选地，L-丙氨酸异丙酯中杂质包括L-丙氨酸、L-丙氨酸甲酯或L-丙氨酸乙酯中的至少一种。
根据本发明的一些实施方式，L-丙氨酸的结构如下式所示：
Figure 398811DEST_PATH_IMAGE004
。
根据本发明的一些实施方式，L-丙氨酸甲酯的结构如下式所示：
Figure 975286DEST_PATH_IMAGE006
。
根据本发明的一些实施方式，L-丙氨酸乙酯的结构如下式所示：
Figure 167233DEST_PATH_IMAGE008
。
根据本发明的一些实施方式，质谱的检测条件为：
离子源为ESI；
离子传输管温度为300℃~320℃；
雾化器温度为350℃~400℃；
毛细管电压为3000V~4000V；
鞘气流量为30Arb~50Arb；
辅气流量为8Arb~12Arb。
根据本发明的一些实施方式，质谱质核比为：
L-丙氨酸母离子m/z:90，子离子m/z:44；
L-丙氨酸甲酯·母离子m/z:104，子离子m/z:44；
L-丙氨酸乙酯·母离子m/z:118，子离子m/z:44。
根据本发明的一些实施方式，液相色谱中的色谱柱包括十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱。
根据本发明的一些实施方式，十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱包括ACE Excel 3C18 4.6*150mm 3μm。
根据本发明的一些实施方式，甲酸溶液的质量分数为0.05%~0.3%。
根据本发明的一些实施方式，液相色谱的柱温为30℃~40℃；液相色谱，进样室的温度为5℃~10℃。
根据本发明的一些实施方式，液相色谱的进样量为1μL~5μL。
根据本发明的一些实施方式，流动相A的流速为0.3mL/min~0.5mL/min；流动相B的流速为0.3mL/min~0.5mL/min。
根据本发明的一些实施方式，L-丙氨酸异丙酯中杂质的检测方法：还包括以下步骤：
S1、配制供试品溶液：取供试品添加至稀释剂中，即得供试品溶液；
S2、配制对照品溶液：取对照品添加至稀释剂中，即得对照品溶液。
根据本发明的一些实施方式，稀释剂包括乙腈水溶液。
根据本发明的一些实施方式，乙腈水溶液中乙腈的体积分数约为20%。
根据本发明的一些实施方式，供试品包括L-丙氨酸异丙酯原料；供试品溶液中供试品的质量浓度为40μg/mL~60μg/mL。
根据本发明的一些实施方式，对照品为杂质L-丙氨酸、L-丙氨酸甲酯或L-丙氨酸乙酯中的至少一种。
根据本发明的一些实施方式，当对照品为L-丙氨酸，对照品溶液的质量浓度为1400ng/mL~1600ng/mL。
根据本发明的一些实施方式，当对照品为L-丙氨酸甲酯，对照品溶液的质量浓度为40ng/mL~60ng/mL。
根据本发明的一些实施方式，当对照品为L-丙氨酸乙酯，对照品溶液的质量浓度为40ng/mL~60ng/mL。
根据本发明实施方式的L-丙氨酸异丙酯原料中杂质的检测方法，至少具备如下有益效果：
1、该方法系统适用性良好：
空白溶液无干扰，对照品溶液所得色谱图中L-丙氨酸、L-丙氨酸甲酯和L-丙氨酸乙酯峰信噪比不低于20，6针对照品溶液色谱图中L-丙氨酸的保留时间RSD（相对标准偏差）为0.0%，峰面积的RSD为1.8%；L-丙氨酸甲酯的保留时间RSD为0.15%，峰面积的RSD为2.2%；L-丙氨酸乙酯的保留时间RSD为0.21%，峰面积的RSD为2.1%。L-丙氨酸、L-丙氨酸甲酯和L-丙氨酸乙酯保留时间RSD均小于1.0%，L-丙氨酸、L-丙氨酸甲酯和L-丙氨酸乙酯峰面积RSD均小于10%，说明该方法的系统适用性良好。
2、该方法专属性良好：
空白溶液无干扰，空白溶液色谱图中L-丙氨酸、L-丙氨酸甲酯和L-丙氨酸乙酯相应位置处的峰面积占定量限溶液各相应峰峰面积的百分比分别为0.64%、3.7%和2.8%，L-丙氨酸、L-丙氨酸甲酯和L-丙氨酸乙酯相应位置处的峰面积占定量限溶液各相应峰峰面积的百分比均小于20%；说明空白溶液对供试品中有关物质检测无干扰。
对照品溶液及专属性混合溶液色谱图中L-丙氨酸、L-丙氨酸甲酯和L-丙氨酸乙酯峰的保留时间均与各定位溶液色谱图中相应峰的保留时间一致，且离子对一致；说明对照品溶液及专属性混合溶液中L-丙氨酸、L-丙氨酸甲酯和L-丙氨酸乙酯均能有效检出，从而说明该方法专属性良好。
3、该方法检测限度低且灵敏度好：
L-丙氨酸定量限浓度为163.81ng/mL（相当于供试品溶液浓度的0.3276%），6份定量限溶液色谱图中L-丙氨酸信噪比均大于10，保留时间RSD为0.0%，不大于1.0%；峰面积RSD为0.5%，不大于10%；检测限浓度为49.143ng/mL（相当于供试品溶液浓度的0.0983%），3针检测限溶液色谱中L-丙氨酸峰的信噪比均大于3。
L-丙氨酸甲酯定量限浓度为4.31ng/mL（相当于供试品溶液浓度的0.00862%），6份定量限溶液色谱图中L-丙氨酸甲酯峰的信噪比均大于10，保留时间RSD为0.0%，不大于1.0%；峰面积RSD为5%，不大于10%；检测限浓度为1.293ng/mL（相当于供试品溶液浓度的0.0026%），3针检测限溶液色谱中L-丙氨酸甲酯峰的信噪比均大于3。
L-丙氨酸乙酯定量限浓度为5.11ng/mL（相当于供试品溶液浓度的0.01022%），6份定量限溶液色谱图中L-丙氨酸乙酯峰的信噪比均大于10，保留时间RSD为0.09%，不大于1.0%；峰面积RSD为5%，不大于10%；检测限浓度为1.533ng/mL（相当于供试品溶液浓度的0.0031%），3针检测限溶液色谱中L-丙氨酸乙酯峰的信噪比均大于3。
4、该方法有良好的线性关系：
L-丙氨酸在浓度163.81ng/mL～3276.14ng/mL范围内，响应因子的RSD为4%，小于10%，线性方程为y =1560.1x -17965，回归曲线的回归系数R为1.000，不低于0.990；Y轴截距占100%响应值的百分比的0.77%，在25%以内；说明该方法检测L-丙氨酸在163.81ng/mL～3276.14ng/mL浓度范围内具有良好的线性关系。
L-丙氨酸甲酯在浓度4.31ng/mL～86.26ng/mL范围内，响应因子的RSD为7%，小于10%，线性方程为y=3238.8x+2088，回归曲线的回归系数R为0.9981，不低于0.990；Y轴截距占100%响应值的百分比的1.27%，在25%以内；说明该方法检测L-丙氨酸甲酯L在4.31ng/mL～86.26ng/mL浓度范围内具有良好的线性关系。
L-丙氨酸乙酯在浓度5.11ng/mL～102.30ng/mL范围内，响应因子的RSD为8%，小于10%，线性方程为y=4989.7x+3508.5，回归曲线的回归系数R为0.9981，不低于0.990；Y轴截距占100%响应值的百分比的1.39%，在25%以内；说明该方法检测L-丙氨酸乙酯在5.11ng/mL～102.30ng/mL浓度范围内具有良好的线性关系。
5、该方法准确度良好：
供试品溶液中L-丙氨酸的检出量为165.34ng/mL，往供试品中加入163.81ng/mL～2457.11ng/mL浓度范围内的L-丙氨酸，回收率在93.9%~95.9%之间，回收率的RSD为0.8%，小于10%；说明该方法检测L-丙氨酸准确度良好。
供试品溶液中L-丙氨酸甲酯的检出量为10.39ng/mL，往供试品中加入4.31ng/mL～64.70ng/mL浓度范围内的L-丙氨酸甲酯，回收率在91.4%~107.6%之间，回收率的RSD为6%，小于10%；说明该方法检测L-丙氨酸甲酯准确度良好。
往供试品中加入5.11ng/mL～76.72ng/mL浓度范围内的L-丙氨酸乙酯，回收率在89.8%~96.7%之间，回收率的RSD为2.8%，小于10%；说明该方法检测L-丙氨酸乙酯准确度良好。
6、该方法重复性良好：
6份重复性溶液中L-丙氨酸含量的RSD为1.2%，不大于6%；L-丙氨酸甲酯含量的RSD为2.2%，不大于6%；L-丙氨酸乙酯含量的RSD为1.7%，不大于6%；说明该分析方法检测L-丙氨酸异丙酯中各杂质（L-丙氨酸、L-丙氨酸甲酯和L-丙氨酸乙酯）重复性良好。
7、供试品溶液和对照品溶液在10℃下稳定性好：
对照品溶液在10℃下放置24h，L-丙氨酸、L-丙氨酸甲酯、L-丙氨酸乙酯峰面积RSD均为7%，小于10%；说明对照品溶液10℃放置24h是稳定的；供试品溶液在10℃下放置24h内，L-丙氨酸、L-丙氨酸甲酯、L-丙氨酸乙酯峰面积RSD均为8%，小于10%；说明供试品溶液10℃放置24h是稳定的。
为解决上述第二个技术问题，本发明提供的技术方案为：一种L-丙氨酸异丙酯原料的质量控制方法。
根据本发明的一些实施方式，质量控制方法包括通过上述的检测方法对L-丙氨酸异丙酯原料中的杂质进行检测。
根据本发明的一些实施方式，L-丙氨酸异丙酯原料中杂质包括L-丙氨酸、L-丙氨酸甲酯和L-丙氨酸乙酯中的至少一种。
根据本发明实施方式的质量控制方法，至少具备如下有益效果：该质量控制方法通过液相色谱-质谱联用法对L-丙氨酸异丙酯原料中杂质进行了检测；实现了L-丙氨酸异丙酯原料的质量控制。
附图说明
图1为本发明实施例1中空白溶液的液质联用质谱检测图谱（L-丙氨酸）；
图2为本发明实施例1中空白溶液的液质联用质谱检测图谱（L-丙氨酸甲酯）；
图3为本发明实施例1中空白溶液的液质联用质谱检测图谱（L-丙氨酸乙酯）；
图4为本发明实施例1中L-丙氨酸对照品溶液的液质联用质谱检测图谱；
图5为本发明实施例1中L-丙氨酸甲酯对照品溶液的液质联用质谱检测图谱；
图6为本发明实施例1中L-丙氨酸乙酯对照品溶液的液质联用质谱检测图谱；
图7为本发明实施例1中供试品溶液的液质联用质谱检测图谱（L-丙氨酸）；
图8为本发明实施例1中供试品溶液的液质联用质谱检测图谱（L-丙氨酸甲酯）；
图9为本发明实施例1中供试品溶液的液质联用质谱检测图谱（L-丙氨酸乙酯）；
图10为本发明实施例1中专属性混合溶液的液质联用色谱检测图谱（L-丙氨酸）；
图11为本发明实施例1中专属性混合溶液的液质联用色谱检测图谱（L-丙氨酸甲酯）；
图12为本发明实施例1中专属性混合溶液的液质联用色谱检测图谱（L-丙氨酸乙酯）；
图13为本发明实施方式中L-丙氨酸的标准曲线；
图14为本发明实施方式中L-丙氨酸甲酯的标准曲线；
图15为本发明实施方式中L-丙氨酸乙酯的标准曲线；
图16为本发明实施例4中色谱图；
图17为本发明实施例5中色谱图；
图18为本发明实施例6中L-丙氨酸色谱图；
图19为本发明实施例6中L-丙氨酸甲酯色谱图；
图20为本发明实施例6中L-丙氨酸乙酯色谱图；
图21为本发明实施例7中色谱图。
标记说明：
RT：保留时间；SN：信噪比。
具体实施方式
以下将结合实施例对本发明的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本发明的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本发明的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本发明保护的范围。
本发明实施方式中所用试剂均为色谱纯。
实施例1
本实施例为：一种富马酸丙酚替诺福韦中L-丙氨酸异丙酯的检测方法，包括以下步骤：
S1、配制溶液：
稀释剂：将乙腈和水按体积比为20：80混合，即得稀释剂。
空白溶液：稀释剂。
L-丙氨酸对照品贮备溶液：取L-丙氨酸（CAS号：56-41-7）对照品约30mg，精密称定，置20mL量瓶中，用稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀，即得L-丙氨酸对照品贮备溶液（浓度1500μg/mL）。
L-丙氨酸甲酯对照品贮备溶液：取杂质L-丙氨酸甲酯（CAS号：114041-77-9）对照品约5mg，精密称定，置100mL量瓶中，用稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀，即得L-丙氨酸甲酯对照品贮备溶液（浓度50μg/mL）。
L-丙氨酸乙酯对照品贮备溶液：取杂质L-丙氨酸乙酯（CAS号：1115-59-9）对照品约5mg，精密称定，置100mL量瓶中，用稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀，即得L-丙氨酸乙酯对照品贮备溶液（浓度50μg/mL）。
20倍限度对照品贮备溶液：分别精密量取上述L-丙氨酸对照品贮备溶液、L-丙氨酸甲酯对照品贮备溶液和L-丙氨酸乙酯对照品贮备溶液各1mL置同一50mL量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得20倍限度对照品贮备溶液（溶液中L-丙氨酸浓度30μg/mL、L-丙氨酸甲酯浓度1μg/mL、L-丙氨酸乙酯浓度1μg/mL）。
对照品溶液：精密量取20倍对照品贮备溶液1.0mL，置20mL量瓶，加稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得对照品溶液。（L-丙氨酸浓度1500ng/mL、L-丙氨酸甲酯浓度50ng/mL、L-丙氨酸乙酯浓度50ng/mL）。
供试品溶液：取L-丙氨酸异丙酯原料药约5mg，精密称定，置100mL量瓶中，加稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀，即得供试品溶液（约50μg/mL）。平行配制2份。
S2、液相质谱联用色谱检测
精密移取对照品溶液2.0μL注入液相色谱仪，L-丙氨酸、L-丙氨酸甲酯、L-丙氨酸乙酯依次流出；再精密量取供试品溶液2.0μL注入液相质谱仪，记录色谱图，供试品溶液色谱图中如有与各杂质峰出峰位置一致的杂质峰，按外标法以峰面积计算。
计算公式：
杂质含量=（AS/AR）×CR/CS×100%
式中，AS为供试品溶液中单个杂质的峰面积；
AR为对照品溶液中单个杂质的峰面积；
CR为对照品溶液中单个杂质浓度（mg/mL）；
CS为供试品溶液浓度（mg/mL）。
上述液质联用色谱条件如下：
固定相：十八烷基硅烷键合硅胶（ACE Excel 3 C18 4.6*150mm 3μm）；
流动相A：质量分数为0.1%甲酸；
流动相B：乙腈；
稀释剂：乙腈水溶液（乙腈和水的体积比为20：80）；
进样量：2.0μL；
流速：0.4mL/min；
柱温：40℃；
样品室温度：10℃；
运行时间：15min。
上述梯度洗脱的程序方式为：
0min~4min，所述流动相A的体积分数为90%；
4min~7min，所述流动相A的体积分数由90%下降至2%；
7min~9min，所述流动相A的体积分数保持为2%；
9min~9.1min，所述流动相A的体积分数由2%升高至90%；
9.1min~15min，所述流动相A的体积分数保持为90%。
质谱法测定包括如下条件：
离子源：ESI；离子传输管温度：320℃；雾化气温度：350℃；毛细管电压：3500V；鞘气流量：40Arb；辅气流量：10Arb；循环时间：0.4s；电离模式：正离子；信号采集模式：SRM；
检测离子对：
L-丙氨酸：90amu→44amu；开始时间：0min；结束时间：5min；碰撞能：10.77V：源内裂解能0%；
L-丙氨酸甲酯：104amu→44amu；开始时间：0min；结束时间：5min；碰撞能：11.99V：源内裂解能0%；
L-丙氨酸乙酯：118amu→44amu；开始时间：0min；结束时间：5min；碰撞能：12.2V：源内裂解能0%；
质谱切换阀设置：
0min~5min，扫描模式：SRM；进入质谱；
5min~15min，扫描模式：SRM；不进入质谱；
上述L-丙氨酸、L-丙氨酸甲酯、L-丙氨酸乙酯的结构如下式所示：
Figure 529075DEST_PATH_IMAGE010
。
上述L-丙氨酸甲酯的结构如下式所示：
Figure 882696DEST_PATH_IMAGE012
。
上述L-丙氨酸乙酯的结构如下式所示：
Figure 680888DEST_PATH_IMAGE014
。
本发明实施例1中检测方法的系统适用性和专属性检测结果分析：
专属性混合溶液：取L-丙氨酸异丙酯原料药约5mg，精密称定，置100mL量瓶中，精密加入20倍限度对照品贮备溶液5mL置同一100mL量瓶中，加稀释剂适量使供试品溶解并稀释至刻度，摇匀，即得专属性混合溶液。
本发明实施例1中空白溶液、对照品溶液、供试品溶液和专属性混合对照品溶液的液质联用色谱检测图谱如图1~12所示；从图1至3中得出：空白溶液色谱图中L-丙氨酸、L-丙氨酸甲酯和L-丙氨酸乙酯相应位置处的峰面积分别为：1630、795和950。
而6份定量限溶液在L-丙氨酸、L-丙氨酸甲酯和L-丙氨酸乙酯相应峰的平均峰面积分别为253805、21255和34273：由上述数据，计算的得知空白溶液占定量限溶液相应峰峰面积的百分比分别为0.64%、3.7%和2.8%，均小于20%；说明空白溶液对供试品中有关物质检测无干扰。
从图4~6中得知对照品溶液所得色谱图中得知L-丙氨酸的保留时间为3.57min（L-丙氨酸的出峰位置）、L-丙氨酸甲酯峰的保留时间为3.83min（L-丙氨酸甲酯的出峰位置）和L-丙氨酸乙酯峰的保留时间为4.73min（L-丙氨酸乙酯的出峰位置）。
在色谱检测过程中，对照品溶液中L-丙氨酸峰的信噪比为46374，不低于20；L-丙氨酸甲酯峰的信噪比为5093，不低于20；L-丙氨酸乙酯峰的信噪比为6891，不低于20，6针对照品溶液色谱图中L-丙氨酸的保留时间RSD为0.0%，峰面积的RSD为1.8%；L-丙氨酸甲酯的保留时间RSD为0.15%，峰面积的RSD为2.2%；L-丙氨酸乙酯的保留时间RSD为0.21%，峰面积的RSD为2.1%。L-丙氨酸、L-丙氨酸甲酯和L-丙氨酸乙酯保留时间RSD均小于1.0%，L-丙氨酸、L-丙氨酸甲酯和L-丙氨酸乙酯峰面积RSD均小于10%，说明该方法的系统适用性良好。
从图7~12中得知供试品溶液中与专属性混合溶液中L-丙氨酸、L-丙氨酸甲酯、L-丙氨酸乙酯峰与对照品溶液中L-丙氨酸、L-丙氨酸甲酯、L-丙氨酸乙酯峰的保留时间一致，说明该方法专属性良好。
本发明实施例1中检测方法的线性与范围：
线性溶液：分别取L-丙氨酸、L-丙氨酸甲酯、L-丙氨酸乙酯对照品适量，分别配制成一系列浓度的溶液，依照实施例中的检测方法测定，测定结果见表1~3和图13~15。
表1不同浓度L-丙氨酸的峰面积测试结果及标准曲线
Figure 410946DEST_PATH_IMAGE016
从表1中得知，L-丙氨酸在163.81ng/mL～3276.14ng/mL浓度范围内，线性方程为y=1560.1x -17965；回归曲线的回归系数R为1.000，不低于0.990。
响应因子（峰面积/样品浓度）的RSD为4%，小于10%，Y轴截距占100%响应值的0.77%，在25%以内（杂质的响应因子的RSD控制标准），说明该方法在163.81ng/mL～3276.14ng/mL浓度范围内测定杂质L-丙氨酸具有良好的线性关系。
表2 L-丙氨酸定量限与检测限实验结果
Figure 627295DEST_PATH_IMAGE018
由表2中数据得知，L-丙氨酸定量限浓度为163.81ng/mL（相当于供试品溶液浓度的0.3276%），6份定量限溶液色谱图中L-丙氨酸峰S/N均大于10，保留时间RSD为0.0%，不大于1.0%；峰面积RSD为0.5%，不大于10%；；检测限浓度为49.413ng/mL（相当于供试品溶液浓度的0.0983%），3针检测限溶液色谱中L-丙氨酸峰的S/N均大于3；由此说明本实施例的检测方法对L-丙氨酸检出限低且灵敏度好。
表3 不同浓度L-丙氨酸甲酯的峰面积测试结果及标准曲线
Figure 151817DEST_PATH_IMAGE020
从表3中得知，L-丙氨酸甲酯在4.31ng/mL～86.26ng/mL浓度范围内，线性方程为y=3238.8x+2088；回归曲线的回归系数R为0.9981，不低于0.990。
响应因子的RSD为7%，小于10%，Y轴截距占100%响应值的1.27%，在25%以内，说明该方法在4.31ng/mL～86.26ng/mL浓度范围内测定杂质L-丙氨酸甲酯具有良好的线性关系。
表4 L-丙氨酸甲酯定量限与检测限实验结果
Figure 722126DEST_PATH_IMAGE022
从表4中得知，L-丙氨酸甲酯的定量限溶液浓度为4.31ng/mL，相当于供试品溶液浓度的0.00862%。6份定量限溶液中L-丙氨酸甲酯的S/N均大于10，保留时间的RSD为0.0%，不大于1.0%，峰面积的RSD为5%，不大于10%；检测限溶液浓度为1.293ng/mL，相当于供试品溶液浓度的0.0026%；3针检测限溶液中L-丙氨酸甲酯的的S/N均大于3；由此说明本实施例的检测方法对L-丙氨酸甲酯的检出限低且灵敏度好。
表5 不同浓度L-丙氨酸乙酯的峰面积测试结果及标准曲线
Figure 990296DEST_PATH_IMAGE024
从表5中得知，L-丙氨酸乙酯在5.11ng/mL～102.30ng/mL浓度范围内，线性方程为y=4989.7x+3508.5；回归曲线的回归系数R为0.9981，不低于0.990。
响应因子的RSD为8%，小于10%，Y轴截距占100%响应值的1.39%，在25%以内，说明该方法在5.11ng/mL～102.30ng/mL浓度范围内测定杂质L-丙氨酸具有良好的线性关系。
表6 L-丙氨酸乙酯定量限与检测限实验结果
Figure 44840DEST_PATH_IMAGE026
从表6中得知，L-丙氨酸乙酯的定量限溶液浓度为5.11ng/mL，相当于供试品溶液浓度的0.01022%。6份定量限溶液中L-丙氨酸乙酯的S/N均大于10，保留时间的RSD为0.09%，不大于1.0%，峰面积的RSD为5%，不大于10%；检测限溶液浓度为1.533ng/mL，相当于供试品溶液浓度的0.0031%；3针检测限溶液中L-丙氨酸乙酯的S/N均大于3；由此说明本实施例的检测方法对L-丙氨酸乙酯的检出限低且灵敏度好。
本发明实施例1中检测方法的回收率试验：
配制如下溶液：
加样回收率贮备溶液：分别精密量取上述L-丙氨酸对照品贮备溶液、L-丙氨酸甲酯对照品贮备溶液和L-丙氨酸乙酯对照品贮备溶液各2mL置同一20mL量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得加样回收率贮备溶液（L-丙氨酸浓度150μg/mL、L-丙氨酸甲酯浓度5μg/mL、L-丙氨酸乙酯浓度5μg/mL）。
加样回收率对照品溶液：精密量取加样回收率贮备溶液1mL置100mL量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得加样回收率对照品溶液（L-丙氨酸浓度1500ng/mL、L-丙氨酸甲酯浓度50ng/mL、L-丙氨酸乙酯浓度50ng/mL）。
10%加样回收率溶液：取L-丙氨酸异丙酯原料药约5mg，置100mL量瓶中，精密加入加样回收率贮备溶液0.1mL，再加稀释剂5mL使L-丙氨酸异丙酯原料药溶解并稀释至刻度，摇匀，即得10%加样回收率溶液。平行配制3份。
100%加样回收率溶液：取L-丙氨酸异丙酯原料药约5mg，置100mL量瓶中，精密加入加样回收率贮备溶液1mL，再加稀释剂5mL使L-丙氨酸异丙酯原料药溶解并稀释至刻度，摇匀，即得100%加样回收率溶液。平行配制3份。
150%加样回收率溶液：取L-丙氨酸异丙酯原料药约5mg，置100mL量瓶中，精密加入加样回收率贮备溶液1.5mL，再加稀释剂5mL使L-丙氨酸异丙酯原料药溶解并稀释至刻度，摇匀，即得150%加样回收率溶液。平行配制3份。
精密量取上述10%加样回收率溶液（三份平行样）、100%加样回收率溶液（三份平行样）和150%加样回收率溶液（三份平行样）各2.0μL，分别注入液质联用仪，依照本实施例中的液质色谱方法检测，计算回收率，回收率测试结果如表4～6所示。
表7 本发明实施例1检测方法的L-丙氨酸回收率测试结果
Figure 5843DEST_PATH_IMAGE028
表8 本发明实施例1检测方法的L-丙氨酸甲酯回收率测试结果
Figure 529359DEST_PATH_IMAGE030
表9 本发明实施例1检测方法的L-丙氨酸乙酯回收率测试结果
Figure 335641DEST_PATH_IMAGE032
加样回收率对照品溶液所得色谱图中L-丙氨酸、L-丙氨酸甲酯和L-丙氨酸乙酯峰的信噪比均不低于20，系统适用性符合要求。供试品溶液中L-丙氨酸的检出量为165.34ng/mL，L-丙氨酸甲酯的检出量为10.39ng/mL。
从表7中得知，往L-丙氨酸异丙酯原料药中加入163.81ng/mL～2457.11ng/mL浓度范围内的L-丙氨酸（即10%加样回收率溶液（三份平行样）、100%加样回收率溶液（三份平行样）和150%加样回收率溶液（三份平行样）），回收率在93.9%~95.9%之间，回收率的RSD为0.8%，小于10%；说明该方法检测L-丙氨酸准确度良好。
从表8中得知：往L-丙氨酸异丙酯原料药中加入4.31ng/mL～64.70ng/mL浓度范围内的L-丙氨酸甲酯（即10%加样回收率溶液（三份平行样）、100%加样回收率溶液（三份平行样）和150%加样回收率溶液（三份平行样）），回收率在91.4%~107.6%之间，回收率的RSD为6%，小于10%；说明该方法检测L-丙氨酸甲酯准确度良好。
从表9中得知：往L-丙氨酸异丙酯原料药中加入5.11ng/mL～76.72ng/mL浓度范围内的L-丙氨酸乙酯（即10%加样回收率溶液（三份平行样）、100%加样回收率溶液（三份平行样）和150%加样回收率溶液（三份平行样）），回收率在89.8%~96.7%之间，回收率的RSD为2.8%，小于10%；说明该方法检测L-丙氨酸乙酯准确度良好。
各浓度下的L-丙氨酸、L-丙氨酸甲酯、L-丙氨酸乙酯的回收率均符合2020版中国药典第四部通则9101规定，回收率在80%～115%之间，说明该方法准确度良好。
本发明实施例1中检测方法的重复性试验：
重复性供试品溶液：取L-丙氨酸异丙酯原料药约5mg，精密称定，置100mL量瓶中，加稀释剂适量溶解并稀释至刻度，摇匀，即得重复性供试品溶液。平行配制6份。
精密量取上述重复性供试品溶液（六份平行样）各2.0μL，分别注入液质联用仪，依照本实施例中的液质色谱方法检测，计算重复性，重复性测试结果见表10。
表10本发明实施例1中检测方法的L-丙氨酸重复性试验测试结果
Figure 510270DEST_PATH_IMAGE034
空白溶液无干扰，对照品溶液中L-丙氨酸、L-丙氨酸甲酯、L-丙氨酸乙酯峰信噪比均大于20，系统适用性符合要求。从表7中得知，6份L-丙氨酸异丙酯的重复性供试品溶液中L-丙氨酸、L-丙氨酸甲酯、L-丙氨酸乙酯含量的RSD不大于6%，说明该方法检测L-丙氨酸异丙酯中各杂质（L-丙氨酸、L-丙氨酸甲酯和L-丙氨酸乙酯）重复性良好。
本发明实施例1中检测方法的稳定性试验：
10℃条件下，将L-丙氨酸、L-丙氨酸甲酯和L-丙氨酸乙酯对照品溶液放置24小时，分别于0h、2h、4h、6h、8h、10h、12h、24h进行测定，结果显示L-丙氨酸、L-丙氨酸甲酯、L-丙氨酸乙酯峰面积RSD均为7%，小于10%；说明对照品溶液10℃放置24h是稳定的。
10℃条件下，将供试品溶液放置24小时，分别于0h、2h、4h、6h、8h、10h、12h、24h进行测定，结果显示供试品溶液中，L-丙氨酸、L-丙氨酸甲酯和L-丙氨酸乙酯峰面积RSD均为8%，小于10%；说明供试品溶液10℃放置24h是稳定的。
通过对L-丙氨酸异丙酯的检测方法的系统适用性、专属性、定量限与检测限、线性与范围、准确度、溶液稳定性等六个方面进行了验证，试验结果表明该方法的适用性良好，可用于L-丙氨酸异丙酯杂质的测定。
实施例2
本实施例为：一种L-丙氨酸异丙酯的检测方法，与实施例1的差异在于：
流动相A为：纯水；
流动相B为：乙腈。
实施例3
本实施例为：一种L-丙氨酸异丙酯的检测方法，与实施例1的差异在于：
梯度洗脱采用如下方式：
0min~5min，所述流动相A的体积分数为60%；
5min~15min，所述流动相A的体积分数由60%下降至40%；
15min~18min，所述流动相A的体积分数由40%升高至60%；
18min~25min，所述流动相A的体积分数为60%。
实施例4
本实施例为：一种L-丙氨酸异丙酯的检测方法，与实施例1的差异在于：
色谱柱：CAPCELL PAK C18 MG II 250mm*4.6mm*5μm；
柱温：30℃；
流速：1.0mL/min；
进样量10μL；
波长260nm；
流动相A：10mmoL/L 醋酸铵溶液（用冰乙酸调至pH4.0）；
流动相B：甲醇；
稀释剂：体积分数为50% 乙腈水溶液；
衍生剂：1-奈异硫氰酸酯；
空白溶液：精密加入29.86mg衍生剂，精密加入40μL三乙胺置同一20mL量瓶中，衍生5小时后，用乙腈稀释至刻度，摇匀，即得空白溶液。
L-丙氨酸异丙酯溶液：精密称取20.67mgL-丙氨酸置25mL量瓶中，用稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀，即得L-丙氨酸异丙酯溶液。
L-丙氨酸母液：精密称取20.08mg L-丙氨酸置25mL量瓶中，用稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀，即得L-丙氨酸母液。
L-丙氨酸甲酯母液：精密称取20.35mg L-丙氨酸置25mL量瓶中，用稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀，即得L-丙氨酸甲酯母液。
L-丙氨酸乙酯母液：精密称取20.75mg L-丙氨酸置25mL量瓶中，用稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀，即得L-丙氨酸乙酯母液。
混合储备液：分别精密量取L-丙氨酸母液、L-丙氨酸甲酯母液、L-丙氨酸乙酯母液和L-丙氨酸异丙酯母液各1mL置50mL量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得混合储备液。
混合对照品溶液：精密量取1mL混合储备液，加入29.86mg衍生剂，精密加入40μL三乙胺置同一20mL量瓶中，用乙腈稀释至刻度，衍生反应5小时后，摇匀，即得混合对照品溶液。
L-丙氨酸定位溶液：精密量取1mL L-丙氨酸母液，加入29.71mg衍生剂，精密加入40μL三乙胺置同一20mL量瓶中，用乙腈稀释至刻度，衍生反应5小时后，摇匀，即得L-丙氨酸定位溶液。
L-丙氨酸甲酯定位溶液：精密量取1mL L-丙氨酸甲酯母液，加入29.97mg衍生剂，精密加入40μL三乙胺置同一20mL量瓶中，用乙腈稀释至刻度，衍生反应5小时后，摇匀，即得L-丙氨酸甲酯定位溶液。
L-丙氨酸乙酯定位溶液：精密量取1mL L-丙氨酸乙酯母液，加入29.97mg衍生剂，精密加入40μL三乙胺置同一20mL量瓶中，用乙腈稀释至刻度，衍生反应5小时后，摇匀，即得L-丙氨酸乙酯定位溶液。
供试品溶液：精密称取16.60mg L-丙氨酸异丙酯置20mL量瓶中，加入29.97mg衍生试剂，精密加入40μL三乙胺置同一20mL量瓶中，用乙腈稀释至刻度，衍生5小时后，摇匀，即得供试品溶液。
混合对照品溶液2：精密量取混合储备溶液1mL置20mL量瓶中，用乙腈稀释至刻度，摇匀，即得混合对照品溶液2。
专属性混合溶液：精密称取15.79mgL-丙氨酸异丙酯置20mL量瓶中，加入29.97mg衍生剂，精密加入40μL三乙胺置同一20mL量瓶中，用混合对照品溶液2稀释至刻度，衍生反应5小时后，摇匀，即得专属性混合溶液。
实施例5
本实施例为：一种L-丙氨酸异丙酯的检测方法，与实施例1的差异在于：
色谱柱：DB-WAX 30m*0.32*0.25mm；
升温程序：100℃保持2min，以10℃/min升至250℃，保持40min；
进样口温度：250℃；
检测器温度：250℃；
分流比：10：1；
进样量：1mL；
顶空平衡温度：90℃；
平衡时间30min。
L-丙氨酸母液：精密称定L-丙氨酸74.528mg至25mL量瓶中，用50%乙腈水溶液（体积分数）溶解并稀释至刻度，摇匀，即得L-丙氨酸母液。
L-丙氨酸甲酯母液：精密称定L-丙氨酸甲酯74.613mg至25mL量瓶中，用50%乙腈水溶液（体积分数）溶解并稀释至刻度，摇匀，即得L-丙氨酸甲酯母液。
L-丙氨酸乙酯母液：精密称定L-丙氨酸乙酯76.076mg至25mL量瓶中，用50%乙腈水溶液（体积分数）溶解并稀释至刻度，摇匀，即得L-丙氨酸乙酯母液。
混合对照品溶液：分别精密量取L-丙氨酸母液、L-丙氨酸甲酯母液、L-丙氨酸乙酯母液各1mL置10mL量瓶中，用50%乙腈水溶液（体积分数）稀释至刻度，摇匀，即得混合对照品溶液。
精密量取5mL混合对照品溶液顶空进样，注入气相色谱仪，记录色谱图。
实施例6
本实施例为：一种L-丙氨酸异丙酯的检测方法，与实施例1的差异在于：
色谱柱：waters cortecs upLc hiLic（1.6μm*2.1*100mm）；
流动相A：乙腈；
流动相B：水；
等度洗脱：流动相A与流动相B体积比为75：25；
波长：205nm；
进样量：10μL。
实施例7
本实施例为：一种L-丙氨酸异丙酯的检测方法，与实施例1的差异在于：
流动相A：0.05mol/L磷酸氢二钠；
流动相B：甲醇；
色谱柱：SHIMADZU VP-ODS 150*4.6mm，5μm；
波长：210nm；
等度洗脱：流动相A与流动相B体积比为90：10；
L-丙氨酸母液：精密称定L-丙氨酸20.182mg至25mL量瓶中，用50%乙腈水溶液（体积分数）溶解并稀释至刻度，摇匀，即得L-丙氨酸母液。
L-丙氨酸甲酯母液：精密称定L-丙氨酸甲酯20.35mg至25mL量瓶中，用50%乙腈水溶液（体积分数）溶解并稀释至刻度，摇匀，即得L-丙氨酸甲酯母液。
L-丙氨酸乙酯母液：精密称定L-丙氨酸乙酯20.710mg至25mL量瓶中，用50%乙腈水溶液（体积分数）溶解并稀释至刻度，摇匀，即得L-丙氨酸乙酯母液。
混合对照品溶液：分别精密量取L-丙氨酸母液、L-丙氨酸甲酯母液、L-丙氨酸乙酯母液各1mL置10mL量瓶中，用50%乙腈水溶液（体积分数）稀释至刻度，摇匀，即得混合对照品溶液。
精密量取5μL混合对照品溶液，注入液相色谱仪，记录色谱图。
实验结论：
本发明实施例2中L-丙氨酸出峰，L-丙氨酸甲酯、L-丙氨酸乙酯均未出峰，说明流动相中必须要有酸的存在，否则无法检测到L-丙氨酸甲酯和L-丙氨酸乙酯。
本发明实施例3中L-丙氨酸、L-丙氨酸甲酯、L-丙氨酸乙酯均依次流出，但峰形不佳，均存在拖尾，且出峰时间较晚，与实施例一处相比峰形较差和时效略长。
本发明实施例4为对比衍生方法的检测稳定性，测试结果见图16；从图16得知，将衍生化后能够实现三者的分离。
但本发明实施例4中前处理时间较长，且供试品中有衍生试剂的干扰，供试品中L-丙氨酸甲酯和L-丙氨酸乙酯均不稳定，测试稳定性差。
本发明实施例5为对比气相色谱法与本发明实施例1中液质联用方法的差异；本发明实施例6的测试结果见17；由图17得知：本发明实施例6中L-丙氨酸、L-丙氨酸甲酯和L-丙氨酸乙酯均未出峰，不能有效检测杂质。
本发明实施例6为对比不同流动相及洗脱方式的差异；本发明实施例6的测试结果见18~20；由图18~20得知：本发明实施例6中L-丙氨酸3.509min出峰，L-丙氨酸甲酯4.102min出峰，L-丙氨酸乙酯4.102min出峰；两者出峰时间较为接近，不能将L-丙氨酸、L-丙氨酸甲酯和L-丙氨酸乙酯峰完全分离；不能实现有效检测。
本发明实施例7为对比等度洗脱与本发明实施例1中梯度洗脱的差异；本发明实施例7的测试结果见21；由图21得知：本发明实施例7中L-丙氨酸在3.260min出峰，且出峰较早，拖尾严重，L-丙氨酸甲酯和L-丙氨酸乙酯均未出峰，不能有效检测杂质。
综上所述，本发明通过液相色谱-质谱联用法实现了对L-丙氨酸异丙酯原料中杂质的质量控制；本发明的检测方法系统适用性好、专属性好、检测限度低、灵敏度高、线性关系好、准确度高、重复性好且稳定性好。
以上结合说明书及附图内容对本发明实施例作了详细说明，但是本发明不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

Claims (9)

1.一种富马酸丙酚替诺福韦合成原料中杂质的检测方法，其特征在于：包括以下步骤：
取供试品溶液，通过液相色谱-质谱联用仪进行检测；
所述液相色谱包括如下条件：
流动相A：甲酸溶液；
流动相B：乙腈；
洗脱方式：梯度洗脱；
所述梯度洗脱的程序方式为：
0min~4min，所述流动相A的体积分数为85%~95%；
4min~7min，所述流动相A的体积分数由85%~95%下降至1%~3%；
7min~9min，所述流动相A的体积分数保持为1%~3%；
9min~9.1min，所述流动相A的体积分数由1%~3%升高至85%~95%；
9.1min~15min，所述流动相A的体积分数保持为85%~95%；
所述液相色谱中的色谱柱包括十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱；
所述富马酸丙酚替诺福韦合成原料为L-丙氨酸异丙酯；
所述L-丙氨酸异丙酯中杂质包括L-丙氨酸、L-丙氨酸甲酯或L-丙氨酸乙酯中的至少一种。
2.根据权利要求1所述的一种富马酸丙酚替诺福韦合成原料中杂质的检测方法，其特征在于：所述质谱的检测条件为：
离子源为ESI；
离子传输管温度为300℃~320℃；
雾化器温度为350℃~400℃；
毛细管电压为3000V~4000V；
鞘气流量为30Arb~50Arb；
辅气流量为8Arb~12Arb。
3.根据权利要求1所述的一种富马酸丙酚替诺福韦合成原料中杂质的检测方法，其特征在于：所述甲酸溶液的质量浓度为0.05%~0.3%。
4.根据权利要求1所述的一种富马酸丙酚替诺福韦合成原料中杂质的检测方法，其特征在于：所述液相色谱的柱温为30℃~40℃；所述液相色谱，进样室的温度为5℃~10℃。
5.根据权利要求1所述的一种富马酸丙酚替诺福韦合成原料中杂质的检测方法，其特征在于：所述流动相A的流速为0.3mL/min~0.5mL/min；所述流动相B的流速为0.3mL/min~0.5mL/min。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的一种富马酸丙酚替诺福韦合成原料中杂质的检测方法，其特征在于：还包括以下步骤：
S1、配制所述供试品溶液：取供试品添加至稀释剂中，即得所述供试品溶液；
S2、配制对照品溶液：取对照品添加至稀释剂中，即得所述对照品溶液。
7.根据权利要求6所述的一种富马酸丙酚替诺福韦合成原料中杂质的检测方法，其特征在于：所述稀释剂包括乙腈水溶液。
8.根据权利要求6所述的一种富马酸丙酚替诺福韦合成原料中杂质的检测方法，其特征在于：所述供试品包括L-丙氨酸异丙酯原料。
9.一种L-丙氨酸异丙酯中杂质的质量控制方法，其特征在于：包括通过如权利要求1至8中任一项所述的检测方法对L-丙氨酸异丙酯原料中杂质进行检测。
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