CN117890516A - 一种检测苯磺顺阿曲库铵药物中苯磺酸酯类基因毒性杂质的方法 - Google Patents

一种检测苯磺顺阿曲库铵药物中苯磺酸酯类基因毒性杂质的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种检测苯磺顺阿曲库铵药物中苯磺酸酯类基因毒性杂质的方法，属于药物分析检测技术领域。本发明建立了液相色谱‑质谱联用同时测定苯磺顺阿曲库铵中的苯磺酸甲酯、苯磺酸乙酯、苯磺酸丙酯、苯磺酸异丙酯、对甲苯磺酸甲酯、对甲苯磺酸丙酯、对甲苯磺酸异丙酯、对甲苯磺酸异丁酯、对甲苯磺酸仲丁酯共9种苯磺酸酯类基因毒性杂质含量的方法，该方法不仅灵敏度高、准确性强、精密度高、线性关系与专属性良好，符合检测要求，适用于苯磺顺阿曲库铵原料药、注射液和注射用粉针剂中基因毒性杂质的日常检测，同时为苯磺顺阿曲库铵原料药、注射液和粉针剂中基因毒性杂质检查项的修订提供参考和依据，可有效提高药物质量，降低临床用药风险。

Description

一种检测苯磺顺阿曲库铵药物中苯磺酸酯类基因毒性杂质的 方法
技术领域
本发明属于药物分析检测技术领域，具体而言，本发明涉及一种利用LC-SM(液相色谱-质谱联用法)测定苯磺顺阿曲库铵药物中苯磺酸酯类基因毒性杂质的方法，更具体地说，公开了一种同时适用于分析检测苯磺顺阿曲库铵原料药、注射液和粉针剂中苯磺酸甲酯、苯磺酸乙酯、苯磺酸丙酯、苯磺酸异丙酯、对甲苯磺酸甲酯、对甲苯磺酸丙酯、对甲苯磺酸异丙酯、对甲苯磺酸异丁酯、和对甲苯磺酸仲丁酯或含上述9种苯磺酸酯类基因毒性杂质的药物的方法。
背景技术
基因毒性杂质(或遗传毒性杂质，Genotoxic Impurity，GTI)，是指本身直接或间接损伤细胞DNA从而产生基因突变或体内诱变的具有致癌可能或者倾向的化合物。基因毒性杂质主要来源为原料药合成过程中的起始物料、中间体、试剂和反应副产物，此外，药物在合成、储存或者制剂过程中也可能因为降解而产生基因毒性杂质，因其毒性极强的特点，在很低浓度(微量或痕量)时即可造成人体遗传物质的损伤，进而导致基因突变并可能促使肿瘤的发生，对用药的安全性产生了强烈的威胁，因此，建立灵敏度高，分析快速的检测方法尤为重要。
苯磺顺阿曲库铵(Cisatracuriumbesylate)是最新一代肌松剂，其在临床中适用于各种外科手术中全身麻醉期间的骨骼肌松弛，也适用于气管插管时所需的肌肉松弛。苯磺顺阿曲库铵中合成工艺中采用对甲苯磺酸作为催化剂来提供离子进行中间体酯化反应，苯磺酸在注射液中作为辅料存在，生产工艺中还用到甲醇、乙醇等作为反应溶剂、重结晶溶剂或者生产设备清洗溶剂。而当苯磺酸或对甲苯磺酸与低级醇共存时，容易发生反应生成苯磺酸烷基酯或对甲苯磺酸烷基酯等基因毒性杂质，因此，生产企业和检查机构均有必要对此进行研究与控制。
目前，在检测苯磺顺阿曲库铵中苯磺酸酯类基因毒性杂质方面，202210741815.X公开了使用色谱-质谱联用检测苯磺顺阿曲库铵注射液中苯磺酸甲酯、苯磺酸乙酯、苯磺酸丙酯、苯磺酸异丙酯这4种苯磺酸酯类基因毒性杂质的方法，检测的苯磺酸酯类基因毒性杂质种类较少，在扩大苯磺酸酯类基因毒性杂质种类的检测范围时，还有很多技术难题，例如苯磺酸酯类成分较难离子化，影响苯磺酸酯类成分在LC-MS中的灵敏度；对于各组分的分子量相近的保留时间也与苯磺顺阿曲库铵的保留时间相近的苯磺酸酯类基因毒性杂质，在检测时，由于各组分不能进行良好的分离进而影响着各成分的检测灵敏度。此外苯磺顺阿曲库铵药物剂型除了注射液外还有原料药、注射用粉针剂，目前还没有适用于苯磺顺阿曲库铵原料药、注射液和注射用粉针剂统一的测定方法。
因此，如何提供一种可同时适用于检测苯磺顺阿曲库铵原料药、注射液和注射用粉针剂种的多种苯磺酸酯类基因毒性杂质的方法，是本领域技术人员亟待解决的问题。
发明内容
针对上述问题，本发明提供了一种检测苯磺顺阿曲库铵药物中苯磺酸酯类基因毒性杂质的方法，可适用于苯磺顺阿曲库铵的原料药、注射液及注射用粉针剂中的苯磺酸甲酯、苯磺酸乙酯、苯磺酸丙酯、苯磺酸异丙酯、对甲苯磺酸甲酯、对甲苯磺酸丙酯、对甲苯磺酸异丙酯、对甲苯磺酸异丁酯、对甲苯磺酸仲丁酯共9种苯磺酸酯类基因毒性杂质的测定。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种检测苯磺顺阿曲库铵药物中苯磺酸酯类基因毒性杂质的方法，采用液相色谱-质谱联用法进行检测，具体包括以下步骤：
分别取混合对照品溶液、空白溶液和供试品溶液各分别注入液相色谱-质谱联用仪，记录色谱图，按外标法以峰面积分别计算苯磺顺阿曲库铵药物中苯磺酸甲酯、苯磺酸乙酯、苯磺酸丙酯、苯磺酸异丙酯、对甲苯磺酸甲酯、对甲苯磺酸丙酯、对甲苯磺酸异丙酯、对甲苯磺酸异丁酯及对甲苯磺酸仲丁酯的含量。
优选的，所述苯磺顺阿曲库铵药物为苯磺顺阿曲库铵原料药、苯磺顺阿曲库铵粉针剂和苯磺顺阿曲库铵注射液中的任一种。
优选的，所述色谱的条件为：
色谱柱：ACQUITYBEH Phenyl规格为100mm×3.0mm，1.7μm；流动相：采用A相-B相，其中A相为0.1％甲酸+5mM乙酸铵水溶液，B相为甲醇；洗脱方式：梯度洗脱；柱温：30℃；流速：0.2ml/min；进样量：5μL；PDA检测器检测波长190-800nm。
优选的，所述梯度洗脱的程序为：
0-5min，25％B；5-10min，25％-40％B；10min-15min，40％-60％B；15-18min，60％B；18-25min，60％-80％B；25-30min，80％B；30-32min，80％-25％B；32-40min，25％B。
优选的，所述质谱条件为：
离子源及电离方式：HESI+，正离子模式；毛细管电压：4500V；鞘气流速：50Arb；离子传输管温度：200℃；蒸发温度：200℃；辅助气流速：10Arb；MS分辨率：60000；质量扫描范围：m/z＝150-260Da。
优选的，所述空白溶液为：100％的甲醇。
优选的，所述混合对照品溶液由以下步骤制备得到：
(1)称取苯磺酸甲酯13.37mg、苯磺酸乙酯10.97mg、苯磺酸丙酯12.70mg、苯磺酸异丙酯9.71mg、对甲苯磺酸甲酯12.70mg、对甲苯磺酸丙酯11.82mg、对甲苯磺酸异丙酯11.46mg、对甲苯磺酸异丁酯10.28mg和对甲苯磺酸仲丁酯10.80mg，分别置于10ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，分别制成苯磺酸甲酯、苯磺酸乙酯、苯磺酸丙酯、苯磺酸异丙酯、对甲苯磺酸甲酯、对甲苯磺酸丙酯、对甲苯磺酸异丙酯、对甲苯磺酸异丁酯和对甲苯磺酸仲丁酯的对照品溶液储备液；
(2)分别取步骤(1)中制得的各对照品储备液1.0ml置于同一50ml量瓶中，使用甲醇稀释至刻度，摇匀，即得混合对照品储备液；
(3)取步骤(2)中制得的混合对照品储备液0.5ml置于100ml量瓶中，使用甲醇稀释至刻度，摇匀，即得混合对照品溶液。
优选的，所述供试品溶液为用甲醇调整浓度为2mg/ml的苯磺顺阿曲库铵溶液，根据药物剂型进行配制，具体为：
当苯磺顺阿曲库铵药物为苯磺顺阿曲库铵原料药时，量取苯磺顺阿曲库铵原料药10mg，置5ml量瓶中，加入甲醇溶解并定容至刻度，配制成苯磺顺阿曲库铵含量为2mg/ml的溶液，即为供试品溶液；
当苯磺顺阿曲库铵药物为苯磺顺阿曲库铵粉针剂时，根据规格，用甲醇调整苯磺顺阿曲库铵含量为2mg/ml，例如苯磺酸阿曲库铵粉针有(1)5mg/支、(2)10mg/支、(3)20mg/支三种规格，对于5mg/支规格的精密加入2.5ml甲醇溶解，对于10mg/支规格的精密加入5ml甲醇使溶解，对于20mg/支规格的精密加入甲醇10ml甲醇使溶解，即为供试品溶液；
当苯磺顺阿曲库铵药物为苯磺顺阿曲库铵注射液时，根据规格，例如苯磺酸阿曲库铵注射液有(1)2.5ml∶5mg与(2)5ml∶10mg两种规格，经计算其苯磺顺阿曲库铵含量均为2mg/ml，可直接作为供试品溶液。
经由上述的技术方案可知，本发明公开提供了一种检测苯磺顺阿曲库铵药物中苯磺酸酯类基因毒性杂质的方法，本发明采用的液相色谱-质谱联用法，通过特定的色谱柱和流动相的选择以及洗脱梯度的调整，可在同一色谱-质谱条件下对苯磺顺阿曲库铵中的苯磺酸甲酯、苯磺酸乙酯、苯磺酸丙酯、苯磺酸异丙酯、对甲苯磺酸甲酯、对甲苯磺酸丙酯、对甲苯磺酸异丙酯、对甲苯磺酸异丁酯、对甲苯磺酸仲丁酯共9种苯磺酸酯类基因毒性杂质进行测定，不仅灵敏度高、准确性强、精密度高、线性关系与专属性良好；而且本发明方法的检测结果不受苯磺酸、甘露醇、枸橼酸和活性碳等企业制备苯磺顺阿曲库铵工艺中常用辅料的影响，因此，可适用于苯磺顺阿曲库铵原料药、注射液和注射于粉针剂中的测定，适用范围更广；同时为苯磺顺阿曲库铵原料药、注射液和注射用粉针剂的质量标准中基因毒性杂质检查项的修订提供参考和依据，可有效提高药物质量，降低临床用药风险。
附图说明
图1：系统适用性色谱图；其中1：苯磺酸甲酯；2：苯磺酸乙酯；3：对甲苯磺酸甲酯；4：苯磺酸异丙酯；5：苯磺酸丙酯；6：对甲苯磺酸异丙酯；7：对甲苯磺酸丙酯；8：对甲苯磺酸仲丁酯；9：对甲苯磺酸异丁酯；
图2：空白溶液色谱图；
图3A：供试品为苯磺顺阿曲库铵原料药时的溶液色谱图；
图3B：供试品为苯磺顺阿曲库铵原料药粉针剂时的溶液色谱图；
图3C：供试品为苯磺顺阿曲库铵原料药注射液时的溶液色谱图；
图4A：注射液辅料溶液色谱图；
图4B：粉针剂辅料溶液色谱图；
图5：苯磺酸甲酯线性关系图；
图6：苯磺酸乙酯线性关系图；
图7：苯磺酸丙酯线性关系图；
图8：苯磺酸异丙酯线性关系图；
图9：对甲苯磺酸甲酯线性关系图；
图10：对甲苯磺酸丙酯线性关系图；
图11：对甲苯磺酸异丙酯线性关系图；
图12：对甲苯磺酸异丁酯线性关系图；
图13：对甲苯磺酸仲丁酯线性关系图；
图14：流动相为乙腈-水时，9种苯磺酸脂类物质的MS-Basepeak图；
图15：流动相为乙腈-0.1％甲酸+5mM乙酸铵水溶液时，9种苯磺酸脂类物质浓度为1μg/ml的MS-Basepeak图；
图16：色谱柱为Thermo Scientific hypersil GOLD(100×2.1mm,1.9μm)C18色谱柱时，苯磺顺阿曲库铵与9种苯磺酸脂类物质的MS-Basepeak图；
图17：色谱柱为Thermo Scientific hypersil GOLD(100×2.1mm,1.9μm)C18色谱柱时，测定苯磺酸甲脂的MS-Basepeak图；
图18：色谱柱为YMC-UltraHT(100×3.0mm,S-2μm)C18色谱柱时，苯磺顺阿曲库铵与9种苯磺酸脂类物质的MS-Basepeak图；
图19：色谱柱为ACQUITYBEH Phenyl(100mm×3.0mm，1.7μm)时，测定苯磺酸甲脂的MS-Basepeak图。
具体实施方式
下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明实施例所涉及的试剂均为市售渠道采购，未提及的方法为常规实验方法，在此不再一一赘述。
实施例1检测方法
1.仪器与试剂
仪器：Vanquish超高效液相色谱仪(美国Thermo Fisher公司)，OrbitrapExploris 120质谱仪(美国Thermo Fisher公司)；
Thermo Scientific Xcalibur工作站(美国Thermo Fisher公司)；
电子分析天平。
试剂：
苯磺顺阿曲库铵原料药(上药东英药业有限公司，批号DY-CAB-2022001)；
苯磺顺阿曲库粉针剂(上药东英药业有限公司，批号A11220601，规格5mg/瓶)；
苯磺顺阿曲库铵注射液(江苏恒瑞医药股份有限公司，批号221218XA，规格2.5mg：5ml)；
苯磺酸甲酯对照品(来源：中国食品药品检定研究院，批号：510193-202001，含量：99.9％)；
苯磺酸乙酯对照品(来源：中国食品药品检定研究院，批号：510194-202001，含量：99.3％)；
苯磺酸丙酯对照品(来源：中国食品药品检定研究院，批号：510195-202001，含量：99.4％)；
苯磺酸异丙酯对照品(来源：中国食品药品检定研究院，批号：510178-202001，含量：99.6％)；
对甲苯磺酸甲酯对照品(来源：中国食品药品检定研究院，批号：510175-202001，含量：99.5％)；
对甲苯磺酸丙酯对照品(来源：中国食品药品检定研究院，批号：510215-202001，含量：100％)；
对甲苯磺酸异丙酯对照品(来源：中国食品药品检定研究院，批号：510177-202001，含量：99.3％)；
对甲苯磺酸异丁酯对照品(来源：中国食品药品检定研究院，批号：510196-202001，含量：99.8％)；
甲苯磺酸仲丁对照品(来源：中国食品药品检定研究院，批号：510197-202001，含量：99.4％)；
苯磺酸试剂(来源：南京健友生化制药股份有限公司，批号：37555B416DV)；
甲醇、水、甲酸均为LC-MS级。
2.色谱及质谱条件
2.1色谱条件
色谱柱：ACQUITYBEH Phenyl规格为100mm×3.0mm，1.7μm；
流动相：采用A相-B相，其中A相为0.1％甲酸+5mM乙酸铵水溶液，B相为甲醇；
洗脱方式：梯度洗脱，0-5min，25％B；5-10min，25％-40％B；10min-15min，40％-60％B；15-18min，60％B；18-25min，60％-80％B；25-30min，80％B；30-32min，80％-25％B；32-40min，25％B；
柱温：30℃；
流速：0.2ml/min；
进样量：5μL；
PDA检测器检测波长190-800nm。
2.2质朴条件
离子源及电离方式：HESI+，正离子模式；
毛细管电压：4500V；
鞘气流速：50Arb；
离子传输管温度：200℃；
蒸发温度：200℃；
辅助气流速：10Arb；
MS分辨率：60000；
质量扫描范围：m/z＝150-260Da。在0-17.5min时待测物质切出质谱，在17.5-18.8min时待测物质切入质谱，在18.8-19.5min时待测物质切出质谱，在19.5-40min时待测物质切入质谱。
表1质谱参数
3.溶液配制
空白溶液：100％甲醇。
混合对照品储备液：称取苯磺酸甲酯13.37mg、苯磺酸乙酯10.97mg、苯磺酸丙酯12.70mg、苯磺酸异丙酯9.71mg、对甲苯磺酸甲酯12.70mg、对甲苯磺酸丙酯11.82mg、对甲苯磺酸异丙酯11.46mg、对甲苯磺酸异丁酯10.28mg和对甲苯磺酸仲丁酯10.80mg，分别置于10ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，分别制成用甲醇稀释至刻度，摇匀，分别制成苯磺酸甲酯、苯磺酸乙酯、苯磺酸丙酯、苯磺酸异丙酯、对甲苯磺酸甲酯、对甲苯磺酸丙酯、对甲苯磺酸异丙酯、对甲苯磺酸异丁酯和对甲苯磺酸仲丁酯的对照品溶液储备液；分别取制得的各对照品储备液1.0ml置于同一50ml量瓶中，使用甲醇稀释至刻度，摇匀，即得混合对照品储备液。
混合对照品溶液:取混合对照品储备液0.5ml置于100ml量瓶中，使用甲醇稀释至刻度，摇匀，即得混合对照品溶液。
供试品溶液：为苯磺顺阿曲库铵含量为2mg/ml，根据药物剂型进行配制，具体为：
当苯磺顺阿曲库铵药物为苯磺顺阿曲库铵原料药时，量取苯磺顺阿曲库铵原料药10mg，置5ml量瓶中，加入甲醇溶解并定容至刻度，配制成苯磺顺阿曲库铵含量为2mg/ml的溶液，即为供试品溶液；
当苯磺顺阿曲库铵药物为苯磺顺阿曲库铵粉针剂时，根据规格，用甲醇调整苯磺顺阿曲库铵含量为2mg/ml，例如苯磺酸阿曲库铵粉针有(1)5mg/支、(2)10mg/支、(3)20mg/支三种规格，对于5mg/支规格的精密加入甲醇2.5ml甲醇使溶解，对于10mg/支规格的精密加入5ml甲醇使溶解，对于20mg/支规格的精密加入甲醇10ml甲醇使溶解，即为供试品溶液；
当苯磺顺阿曲库铵药物为苯磺顺阿曲库铵注射液时，根据规格，例如苯磺酸阿曲库铵注射液有(1)2.5ml∶5mg与(2)5ml∶10mg两种规格，经计算其苯磺顺阿曲库铵含量均为2mg/ml，可直接作为供试品溶液。
实施例2方法学验证
1.专属性试验
取混合对照品溶液、空白溶液和供试品溶液(原料药、注射液和粉针剂)各分别按照实施例1中的色谱及质谱条件进行检测，记录色谱图。结果分别如图1、2和3A-3C所示。
结果表明，在该实验条件下，出峰顺序依次为：苯磺酸甲酯、苯磺酸乙酯、对甲苯磺酸甲酯、苯磺酸异丙酯、苯磺酸丙酯、对甲苯磺酸异丙酯、对甲苯磺酸丙酯、对甲苯磺酸仲丁酯、对甲苯磺酸异丁酯，各成分峰均能达到基线分离。
2.辅料干扰试验
按各企业提供的处方工艺，注射液所涉及的辅料种类为苯磺酸，按照各处方中最大比例配制辅料溶液，具体为：称取苯磺酸0.6mg，精密加入注射用水2ml，即得注射液辅料溶液。
粉针剂所涉及的辅料种类分别为苯磺酸、甘露醇、枸橼酸、活性碳，按照各处方中最大比例配制辅料溶液，具体为：称取苯磺酸0.8mg、甘露醇250mg、枸橼酸1.3mg、活性碳10mg，依次置于5ml量瓶中，加入甲醇溶解并定容至刻度，即得粉针剂辅料溶液，精密吸取上述注射液辅料溶液和粉针剂辅料溶液各5μl，分别按照实施例1的色谱及质谱条件进行进行检测，记录色谱图，结果分别见图4A和4B。
由图4A和图4B可知，在9种磺酸酯类成分的对应出峰时间并没有峰，因此苯磺酸、甘露醇、枸橼酸、活性碳对9中苯磺酸酯类成分的测定无干扰。
3.线性关系考察
精密吸取混合对照品储备液各0.05ml，0.1ml，0.2ml，0.25ml，0.5ml，1ml分别置于10mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，制成系列混合对照品溶液(1)(2)(3)(4)(5)(6)。
按实施例1的实验条件进样测定，记录峰面积，结果见表2-表10。
表2苯磺酸甲酯线性关系试验
以峰面积为纵坐标，以浓度为横坐标进行线性回归，苯磺酸甲酯线性关系图如图5所示，苯磺酸甲酯在6.68ng/ml～133.57ng/ml范围内，线性方程为y＝5625x-18576；相关系数R2＝0.9955，峰面积A与浓度C(ng/ml)呈显著线性关系。
表3苯磺酸乙酯线性关系试验
以峰面积为纵坐标，以浓度为横坐标进行线性回归，苯磺酸乙酯线性关系图如图6所示，苯磺酸乙酯在5.45ng/ml～108.93ng/ml范围内，线性方程为y＝66403x-57878；相关系数R2＝0.9981，峰面积A与浓度C(ng/ml)呈显著线性关系。
表4苯磺酸丙酯线性关系试验
以峰面积为纵坐标，以浓度为横坐标进行线性回归，苯磺酸丙酯线性关系图如图7所示，苯磺酸丙酯在6.31ng/ml～126.24ng/ml范围内，线性方程为y＝183605x-208273；相关系数R2＝0.9973，峰面积A与浓度C(ng/ml)呈显著线性关系。
表5苯磺酸异丙酯线性关系试验
以峰面积为纵坐标，以浓度为横坐标进行线性回归，苯磺酸异丙酯线性关系图如图8所示，苯磺酸异丙酯在4.84ng/ml～96.71ng/ml范围内，线性方程为y＝293340x-281994；相关系数R2＝0.9967，峰面积A与浓度C(ng/ml)呈显著线性关系。
表6对甲苯磺酸甲酯线性关系试验
以峰面积为纵坐标，以浓度为横坐标进行线性回归，对甲苯磺酸甲酯线性关系图如图9所示，对甲苯磺酸甲酯在6.32ng/ml～126.36ng/ml范围内，线性方程为y＝94822x-207745；相关系数R2＝0.9958，峰面积A与浓度C(ng/ml)呈显著线性关系。
表7对甲苯磺酸丙酯线性关系试验
以峰面积为纵坐标，以浓度为横坐标进行线性回归，对甲苯磺酸丙酯线性关系图如图10所示，对甲苯磺酸丙酯在5.91ng/ml～118.20ng/ml范围内，线性方程为y＝775089.0836x-1158952.5556；相关系数R2＝0.9966，峰面积A与浓度C(ng/ml)呈显著线性关系。
表8对甲苯磺酸异丙酯线性关系试验
以峰面积为纵坐标，以浓度为横坐标进行线性回归，对甲苯磺酸异丙酯线性关系图如图11所示，对甲苯磺酸异丙酯在5.69ng/ml～113.80ng/ml范围内，线性方程为y＝839715.1121x-1072531.6667；相关系数R2＝0.9970，峰面积A与浓度C(ng/ml)呈显著线性关系。
表9对甲苯磺酸异丁酯线性关系试验
以峰面积为纵坐标，以浓度为横坐标进行线性回归，对甲苯磺酸异丁酯线性关系图如图12所示，对甲苯磺酸异丁酯在5.13ng/ml～102.59ng/ml范围内，线性方程为y＝2E+06x-1E+06；相关系数R2＝0.9986，峰面积A与浓度C(ng/ml)呈显著线性关系。
表10对甲苯磺酸仲丁酯线性关系试验
以峰面积为纵坐标，以浓度为横坐标进行线性回归，对甲苯磺酸仲丁酯线性关系图如图13所示，对甲苯磺酸仲丁酯在5.37ng/ml～107.35ng/ml范围内，线性方程为y＝845713.3143x-1094787.5000；相关系数R2＝0.9971，峰面积A与浓度C(ng/ml)呈显著线性关系。
4.检测限试验
取表2-表10中的系列混合对照品溶液(1)各1.0ml分别置于10mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀。按实施例1的方法进行测定，记录色谱图，信噪比约为3：1时，即为最小检测限，各成分的检测限见表11。
表11苯磺酸酯类各成分检出限
由表11可知，9种苯磺酸酯类的检测限远小于检测报告限度。
5.回收率试验
①精密称取苯磺顺阿曲库铵原料药2.5mg，分别加入系列混合对照品溶液(3)5ml，超声使其溶解，平行配制6份。分别精密量取上述溶液5μl注入液相色谱仪，记录色谱图，按外标法计算测得浓度，测得浓度与加入浓度的比值即为回收率，结果见表12。
表12检测样品为苯磺顺阿曲库铵原料药时的9种磺酸酯类成分回收率试验结果
由表12可知，苯磺顺阿曲库铵原料药中苯磺酸甲酯平均回收率为97.92％，RSD为1.97％；苯磺顺阿曲库铵原料药中9种苯磺酸酯类的平均回收率在96.95％～100.45％之间，RSD在0.25％～2.16％之间，表明采用本发明的方法检测苯磺顺阿曲库铵原料药中的9种磺酸酯类成分的回收率良好。
②精密称取苯磺顺阿曲库铵粉针剂2.5mg，分别加入系列混合对照品溶液(3)5ml，超声使其溶解，平行配制6份。分别精密量取上述溶液5μl注入液相色谱仪，记录色谱图，按外标法计算测得浓度，测得浓度与加入浓度的比值即为回收率，结果见表13。
表13检测样品为苯磺顺阿曲库铵粉针剂时的9种磺酸酯类成分回收率试验结果
由表13可知，苯磺顺阿曲库铵注射液中苯磺酸甲酯平均回收率为97.11％，RSD为1.31％；苯磺顺阿曲库铵粉针剂中9种苯磺酸酯类的平均回收率在95.65％～101.63％之间，RSD在1.30％～2.94％之间，表明采用本发明的方法检测苯磺顺阿曲库铵粉针剂中的9种磺酸酯类成分的回收率良好。
③精密称取苯磺顺阿曲库铵注射液5ml加入混合对照品储备液5μl，摇匀，平行配制6份。分别精密量取上述溶液5μl注入液相色谱仪，记录色谱图，按外标法计算测得浓度，测得浓度与加入浓度的比值即为回收率，结果见表14。
表14检测样品为苯磺顺阿曲库铵注射液时的9种磺酸酯类成分回收率试验结果
6.精密度试验
精密取系列混合对照品溶液(2)5μl注入液相色谱仪，记录色谱图，重复进样6次，记录9种苯磺酸酯的峰面积并计算RSD，结果详见表15。
表15精密度试验结果
由表13可知，6份重复性样品中，9种苯磺酸酯的测定结果的RSD均小于4.1％，表明测定方法的精密度良好。
综上所述，本专利建立了液相色谱-质谱联用同时测定苯磺顺阿曲库铵中9种苯磺酸酯类基因毒性杂质含量的方法，方法简单、准确、灵敏度高，符合检测要求，适用于苯磺顺阿曲库铵原料药、粉针剂和注射液中基因毒性杂质的日常检测，同时为本品质量标准中基因毒性杂质检查项的修订提供参考和依据，有效提高药物质量，降低临床用药风险。
对比例1
1.当流动相的选择
考察不同流动相条件下9种基因毒性杂质的含量，在流动相为乙腈-水的条件下，测定结果见图14，由图14可知，因待测9种苯磺酸类成分未离子化，未检测出峰成分；当采用乙腈-0.1％甲酸+5mM乙酸铵水溶液为流动相进行测定浓度为1μg/ml时的9种苯磺酸类物质时，结果见图15，由图15的测定结果表明9种苯磺酸类物质较难离子化，测得的苯磺酸类物质的灵敏度达不到报告限度要求(10ppm)。
2.色谱柱的选择
因测定的9种苯磺酸类物质结构相似，保留时间均较为接近，除苯磺酸甲酯外的其余4对成分母离子均相同，除应注意质谱中母离子的测定外更应注意各峰的分离情况，苯磺顺阿曲库铵性质也与9种物质结构相似，如不切除影响临近待测物质的检测灵敏度，因此选择色谱柱与调整流动相梯度尤为重要。
发明人经过大量、繁杂的实验，考察了C18色谱柱，发现无论如何调整梯度都不能使苯磺顺阿曲库铵与其余9种物质分离，各成分距离较近如图16，采用C18色谱柱苯磺酸甲酯保留时间前移较多时会影响其峰形与灵敏度如图17。而本发明选择对含有苯基团并对保留时间更强的苯基柱进行测定，调整流动相梯度，使苯磺顺阿曲库铵峰与待测成分较好的分离如图18，苯磺酸甲酯的灵敏度与峰型更佳如图19。
本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims (8)

1.一种检测苯磺顺阿曲库铵药物中苯磺酸酯类基因毒性杂质的方法，其特征在于，采用液相色谱-质谱联用法进行检测，具体包括以下步骤：
分别取混合对照品溶液、空白溶液和供试品溶液各分别注入液相色谱-质谱联用仪，记录色谱图，按外标法以峰面积分别计算苯磺顺阿曲库铵药物中苯磺酸甲酯、苯磺酸乙酯、苯磺酸丙酯、苯磺酸异丙酯、对甲苯磺酸甲酯、对甲苯磺酸丙酯、对甲苯磺酸异丙酯、对甲苯磺酸异丁酯及对甲苯磺酸仲丁酯的含量。
2.根据权利要求1所述的一种检测苯磺顺阿曲库铵药物中苯磺酸酯类基因毒性杂质的方法，其特征在于，所述苯磺顺阿曲库铵药物为苯磺顺阿曲库铵原料药、苯磺顺阿曲库铵粉针剂和苯磺顺阿曲库铵注射液中的任一种。
3.根据权利要求1所述的一种检测苯磺顺阿曲库铵药物中苯磺酸酯类基因毒性杂质的方法，其特征在于，所述色谱的条件为：
色谱柱：ACQUITY BEH Phenyl规格为100mm×3.0mm，1.7μm；
流动相：采用A相-B相，其中A相为0.1％甲酸+5mM乙酸铵水溶液，B相为甲醇；
洗脱方式：梯度洗脱；
柱温：30℃；
流速：0.2ml/min；
进样量：5μL；
PDA检测器检测波长190-800nm。
4.根据权利要求3所述的一种检测苯磺顺阿曲库铵药物中苯磺酸酯类基因毒性杂质的方法，其特征在于，所述梯度洗脱的程序为：
0-5min，25％B；5-10min，25％-40％B；10min-15min，40％-60％B；15-18min，60％B；18-25min，60％-80％B；25-30min，80％B；30-32min，80％-25％B；32-40min，25％B。
5.根据权利要求1所述的一种检测苯磺顺阿曲库铵药物中苯磺酸酯类基因毒性杂质的方法，其特征在于，所述质谱条件为：
离子源及电离方式：HESI+，正离子模式；
毛细管电压：4500V；
鞘气流速：50Arb；
离子传输管温度：200℃；
蒸发温度：200℃；
辅助气流速：10Arb；
MS分辨率：60000；
质量扫描范围：m/z＝150-260Da。
6.根据权利要求1所述的一种检测苯磺顺阿曲库铵药物中苯磺酸酯类基因毒性杂质的方法，其特征在于，所述空白溶液为：100％的甲醇。
7.根据权利要求1所述的一种检测苯磺顺阿曲库铵药物中苯磺酸酯类基因毒性杂质的方法，其特征在于，所述混合对照品溶液由以下步骤制备得到：
(1)称取苯磺酸甲酯13.37mg、苯磺酸乙酯10.97mg、苯磺酸丙酯12.70mg、苯磺酸异丙酯9.71mg、对甲苯磺酸甲酯12.70mg、对甲苯磺酸丙酯11.82mg、对甲苯磺酸异丙酯11.46mg、对甲苯磺酸异丁酯10.28mg和对甲苯磺酸仲丁酯10.80mg，分别置于10ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，分别制成苯磺酸甲酯、苯磺酸乙酯、苯磺酸丙酯、苯磺酸异丙酯、对甲苯磺酸甲酯、对甲苯磺酸丙酯、对甲苯磺酸异丙酯、对甲苯磺酸异丁酯和对甲苯磺酸仲丁酯的对照品溶液储备液；
(2)分别取步骤(1)中制得的各对照品储备液1.0ml置于同一50ml量瓶中，使用甲醇稀释至刻度，摇匀，即得混合对照品储备液；
(3)取步骤(2)中制得的混合对照品储备液0.5ml置于100ml量瓶中，使用甲醇稀释至刻度，摇匀，即得混合对照品溶液。
8.根据权利要求1所述的一种检测苯磺顺阿曲库铵药物中苯磺酸酯类基因毒性杂质的方法，其特征在于，所述供试品溶液为用甲醇调整浓度为2mg/ml的苯磺顺阿曲库铵溶液。
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