CN111579683A - 超高效液相色谱串联质谱检测血浆中抗动脉粥样硬化药物的试剂盒 - Google Patents
超高效液相色谱串联质谱检测血浆中抗动脉粥样硬化药物的试剂盒 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种超高效液相色谱串联质谱技术检测血浆中抗动脉粥样硬化药物的试剂盒，属于血浆检测技术领域。针对常用的抗动脉粥样硬化药物，阿托伐他汀、邻羟基阿托伐他汀、对羟基阿托伐他汀、瑞舒伐他汀和地高辛，本发明的试剂盒采用LC‑MS/MS法，可以一次性对其进行检测，目标药物与代谢产物同时监测，灵敏度高、准确性好，可很好应用于临床，为血浆抗动脉粥样硬化药物联合用药研究提供可靠依据。
Description
技术领域
本发明属于药物检测技术领域，具体涉及一种利用超高效液相色谱串联质谱技术检测血浆中抗动脉粥样硬化药物的试剂盒。
背景技术
根据中国心血管疾病报告报告，心血管疾病(CVD)是中国居民疾病死亡的主要原因。高血压和高脂血症通常并存，是心血管疾病进展和发展的基础。高脂血症是动脉粥样硬化进展的主要危险因素，动脉粥样硬化又会导致一些心血管并发症，如冠心病、缺血性脑血管疾病、外周血管疾病、缺血性脑血管疾病和外周血管疾病。高脂血症是指包括脂肪、脂肪酸、胆固醇、胆固醇酯、磷脂和甘油三酸酯在内的脂质在血液中的升高，控制高脂血症对于预防动脉粥样硬化及其相关疾病很重要。
3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A(HMG–CoA)还原酶抑制剂，也就是他汀类药物，是最有效、耐受性最好、应用最广泛的降脂药物，被认为是高脂血症的一线治疗药物。其中，阿托伐他汀(ATO)是有效的3-羟基-3-甲基戊二烯基(HMG)-CoA还原酶的合成抑制剂，可降低总胆固醇和血浆甘油三酸酯；而对羟基阿托伐他汀(p-HATT)和邻羟基阿托伐他汀(o-HATT)是阿托伐他汀在体内经过肝药酶代谢，得到的两种活性代谢产物。这三种他汀类药物是目前最常用的降胆固醇药物，由于其高疗效和安全性，已在许多国家广泛用于治疗高脂血症。在全球范围内，阿托伐他汀(ATV)钙(纽约辉瑞制药公司的
)是最畅销的处方药。
在他汀类药物中，瑞舒伐他汀(ROS)为新型降血脂药，于2003年8月在美国批准用于治疗血脂异常，广泛应用于治疗高胆固醇血症和预防冠状动脉疾病。由于其独特的特性，例如选择性摄入肝细胞、优异的结合亲和力和在酶活性位点的紧密结合相互作用，它对胆固醇和甘油三酯的降低作用最大，是最有效和有效的他汀类药物之一。
然而，相当一部分接受他汀类药物治疗的患者未能达到目标。造成这种失败的原因包括患者依从性差、药物反应的变异性以及他汀类药物剂量方面问题。由于他汀类药物单一疗法的局限性，所以会联合地高辛联合治疗，进一步降低血脂水平。地高辛是一种广泛用于治疗充血性心力衰竭的强心苷，其药用用途1785年被Withering首次提出，但是其治疗范围较窄(0.8-2.0ng/mL)，增加了地高辛使用的复杂性，因此，地高辛药代动力学的微小变化可能导致治疗效果下降或潜在的严重毒性。
目前现有技术已经有针对血浆抗动脉粥样硬化药物体内浓度检测的报道，比如中国专利CN107102079A公开了一种检测人血浆中阿托伐他汀及代谢物的液相色谱-串联质谱方法及临床药学研究应用，可以同时检测3种药物，样本量需要100μL，且需要氮吹浓缩，前处理复杂；此外还有文献报告针对其中一种或几种他汀类药物进行检测，但是效率相对比较低，存在单个样品分析时间长、灵敏度低、线性范围不适宜、样品前处理复杂和进样量大，基质效应干扰等不足。
发明内容
针对上述现有技术的不足，本发明提供了一种超高效液相色谱串联质谱技术检测血浆中抗动脉粥样硬化药物的试剂盒及其应用。
为了实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案：
一种检测血浆中抗动脉粥样硬化药物的试剂盒，包括：液相色谱流动相、校准品溶液、混合内标溶液、质控品和蛋白质沉淀剂；
所述抗动脉粥样硬化药物包括阿托伐他汀、邻羟基阿托伐他汀、对羟基阿托伐他汀、瑞舒伐他汀和地高辛；
所述液相色谱流动相包括流动相A和流动相B，流动相A为甲酸-甲酸铵水溶液，流动相B为乙腈；
所述校准品溶液包括系列浓度已知的由空白血浆配制的阿托伐他汀、邻羟基阿托伐他汀、对羟基阿托伐他汀、瑞舒伐他汀和地高辛的混合溶液；
所述混合内标溶液包括浓度已知的由甲醇水溶液配制的阿托伐他汀-d5、邻羟基阿托伐他汀-d5、对羟基阿托伐他汀-d5、瑞舒伐他汀-d3和地高辛-d3的混合溶液；
所述质控品包括浓度已知的由空白血浆配制的阿托伐他汀、邻羟基阿托伐他汀、对羟基阿托伐他汀、瑞舒伐他汀和地高辛的混合溶液。
进一步地，所述蛋白沉淀剂为甲醇和异丙醇的混合溶液，甲醇和异丙醇的体积比1:1～5；优选地，甲醇与异丙醇的体积比1:2。
进一步地，所述流动相A为0.005％～0.1％甲酸1～5mM甲酸铵水溶液；优选地，所述流动相A为0.05％甲酸2mM甲酸铵水溶液。
进一步地，所述校准品溶液包括七种浓度配比的混合溶液。
进一步地，所述混合内标溶液中，阿托伐他汀-d5、邻羟基阿托伐他汀-d5、对羟基阿托伐他汀-d5、瑞舒伐他汀-d3和地高辛-d3的浓度分别为：阿托伐他汀-d5 200ng/mL、邻羟基阿托伐他汀-d5 40ng/mL、对羟基阿托伐他汀-d5 40ng/mL、瑞舒伐他汀-d3 200ng/mL、地高辛-d3 50ng/mL。
进一步地，所述血浆为人血浆或动物血浆。
进一步地，所述质控品包括低、中、高三个浓度配比的混合溶液。
上述试剂盒在利用超高效液相色谱串联质谱技术检测血浆中抗动脉粥样硬化药物中的应用。
有益效果：采用本发明的试剂盒检测血浆中抗动脉粥样硬化药物时，前处理过程简单，成本低，且灵敏度高、特异性强，5min之内完成抗动脉粥样硬化药物的分离和检测，准确度与精密度基本满足要求，可用于临床上抗动脉粥样硬化药物的定量分析，为临床上抗动脉粥样硬化药物的治疗浓度监测提供一种可靠的检测方法。
附图说明
图1为实施例1中抗动脉粥样硬化药物标准品的提取离子流谱图。
图2为实施例1中血浆中抗动脉粥样硬化药物提取离子流谱图。
具体实施方式
本发明提供了一种超高效液相色谱串联质谱技术检测血浆中抗动脉粥样硬化药物的试剂盒，特别地，所述抗动脉粥样硬化药物包括：阿托伐他汀(ATT)、邻羟基阿托伐他汀(o-HATT)、对羟基阿托伐他汀(p-HATT)、瑞舒伐他汀(ROS)和地高辛(DGX)。
上述抗动脉粥样硬化药物对应的同位素内标物分别为：阿托伐他汀-d5(ATT-d5)、邻羟基阿托伐他汀-d5(o-HATT-d5)、对羟基阿托伐他汀-d5(p-HATT-d5)、瑞舒伐他汀-d3(ROS-d3)、地高辛-d3(DGX-d3)。
所述的试剂盒包含如下试剂：
(1)流动相：
流动相A：0.005％～0.1％甲酸1～5mM甲酸铵水溶液；流动相B：乙腈。
(2)校准品溶液：
将抗动脉粥样硬化药物母液，浓度分别为ATT 500μg/mL、o-HATT 100μg/mL、p-HATT100μg/mL、ROS 500μg/mL、DGX 100μg/mL，配制成含ATT 5000ng/mL、o-HATT 1000ng/mL、p-HATT 1000ng/mL、ROS 5000ng/mL、DGX 1000ng/mL的混合标准品溶液。
将上述混合标准品溶液以空白血浆配制成七个不同浓度点的校准品溶液，所述校准品溶液的七个浓度点为：
ATT/ROS：0.5ng/mL、1.25ng/mL、2.5ng/mL、12.5ng/mL、25ng/mL、125ng/mL、250ng/mL；
o-HATT/p-HATT/DGX：0.1ng/mL、0.25ng/mL、0.5ng/mL、2.5ng/mL、5ng/mL、25ng/mL、50ng/mL。
(3)混合内标溶液：
包含有ATT-d5 200ng/mL、o-HATT-d5 40ng/mL、p-HATT-d5 40ng/mL、ROS-d3200ng/mL、DGX-d3 50ng/mL的甲醇水溶液。
(4)蛋白沉淀剂：
甲醇与异丙醇的混合溶液。
(5)质控品：
含有抗动脉粥样硬化药物的空白血浆，分为低、中、高三个浓度，分别为QC(L)、QC(M)、QC(H)，其中，
QC(L)为QC(M)用空白血浆稀释至10倍；
QC(M)为上述混合标准溶液用空白血浆稀释至500倍；
QC(H)为上述混合标准溶液用空白血浆稀释至50倍。
在一种优选方案中，上述流动相A为0.005％～0.1％甲酸1～5mM甲酸铵水溶液，优选为0.05％甲酸水溶液。
在一种方案中，蛋白质沉淀剂中甲醇与异丙醇的体积比1:1～5；优选地，蛋白质沉淀剂中甲醇与异丙醇的体积比1:2。
本发明提及的混合标准溶液按照如下方法制备：分别将抗动脉粥样硬化药物ATT500μg/mL、o-HATT 100μg/mL、p-HATT 100μg/mL、ROS 500μg/mL、DGX 100μg/mL，用甲醇配制成含ATT 5000ng/mL、o-HATT 1000ng/mL、p-HATT 1000ng/mL、ROS 5000ng/mL、DGX1000ng/mL的混合标准品溶液。
本发明提及的混合内标溶液按照如下方法制备：将ATT-d5 20μg/mL、o-HATT-d5 4μg/mL、p-HATT-d5 4μg/mL、ROS-d3 20μg/mL、DGX-d3 5μg/mL母液用甲醇水溶液配制成包含ATT-d5 200ng/mL、o-HATT-d5 40ng/mL、p-HATT-d5 40ng/mL、ROS-d3 200ng/mL、DGX-d350ng/mL的同位素混合内标溶液；
在制备混合标准溶液和混合内标溶液时，采用的甲醇水溶液为50％～95％甲醇水溶液；优选为70％～90％甲醇水溶液；更优选为80％甲醇水溶液。
在制备校准品溶液和质控品时，空白血浆为无抗动脉粥样硬化药物的空白血浆。
本发明提及的甲醇水溶液其浓度一般指体积浓度。
本发明提及的血浆为人或动物的血浆。
在一种优选方案中，超高效液相色谱串联质谱技术检测血浆中抗动脉粥样硬化药物的试剂盒包含如下试剂：
(1)流动相：
流动相A：0.005％～0.1％甲酸1～5mM甲酸铵水溶液；流动相B：乙腈；
(2)校准品溶液：
分别将抗动脉粥样硬化药物母液，浓度分别为ATT 500μg/mL、o-HATT 100μg/mL、p-HATT 100μg/mL、ROS 500μg/mL、DGX 100μg/mL，用甲醇水溶液配制成包含ATT 5000ng/mL、o-HATT 1000ng/mL、p-HATT 1000ng/mL、ROS 5000ng/mL、DGX 1000ng/mL的混合标准品溶液，将所述混合标准溶液以无抗动脉粥样硬化药物的空白血浆配制成七个不同浓度点的校准品溶液；
(3)混合内标溶液：
将ATT-d5 20μg/mL、o-HATT-d5 4μg/mL、p-HATT-d5 4μg/mL、ROS-d3 20μg/mL、DGX-d35μg/mL母液用甲醇水溶液配制成包含ATT-d5 200ng/mL、o-HATT-d5 40ng/mL、p-HATT-d5 40ng/mL、ROS-d3 200ng/mL、DGX-d3 50ng/mL的同位素混合内标溶液；
(4)蛋白质沉淀剂：
甲醇与异丙醇的体积比1:1～5；
(5)质控品：
取上述混合标准溶液以无抗动脉粥样硬化药物的空白血浆配制成三个不同浓度QC(L)、QC(M)、QC(H)。
在一种更优选方案中，超高效液相色谱串联质谱技术检测血浆中抗动脉粥样硬化药物的试剂盒包含如下试剂：
(1)流动相：
流动相A：0.05％甲酸2mM甲酸铵水溶液；流动相B：乙腈；
(2)校准品溶液：
分别将抗动脉粥样硬化药物母液，浓度分别为：ATT 500μg/mL、o-HATT 100μg/mL、p-HATT 100μg/mL、ROS 500μg/mL、DGX 100μg/mL，用80％甲醇水溶液配制成包含有ATT5000ng/mL、o-HATT 1000ng/mL、p-HATT 1000ng/mL、ROS 5000ng/mL、DGX 1000ng/mL标准品溶液，将所述混合标准溶液以无抗动脉粥样硬化药物的空白血浆配制成七个不同浓度点的校准品溶液；
(3)混合内标溶液：
将ATT-d5 20μg/mL、o-HATT-d5 4μg/mL、p-HATT-d5 4μg/mL、ROS-d3 20μg/mL、DGX-d35μg/mL母液用80％甲醇水溶液配制成包含ATT-d5 200ng/mL、o-HATT-d5 40ng/mL、p-HATT-d5 40ng/mL、ROS-d3 200ng/mL、DGX-d3 50ng/mL的同位素混合内标溶液；
(4)蛋白质沉淀剂：
甲醇与异丙醇的体积比1:2；
(5)质控品：
取上述混合标准溶液以无抗动脉粥样硬化药物的空白血浆配制成三个不同浓度QC(L)、QC(M)、QC(H)，其中，QC(L)，QC(M)，QC(H)中抗动脉粥样硬化药物质控品对应浓度见表1；
表1抗动脉粥样硬化药物质控品对应浓度(单位:ng/mL)
| 编号 | 组分 | QC(L) | QC(M) | QC(H) |
| 1 | ATT | 1 | 10 | 100 |
| 2 | o-HATT | 0.2 | 2 | 20 |
| 3 | p-HATT | 0.2 | 2 | 20 |
| 4 | ROS | 1 | 10 | 100 |
| 5 | DGX | 0.2 | 2 | 20 |
QC(L)中包含：ATT 1ng/mL、o-HATT 0.2ng/mL、p-HATT 0.2ng/mL、ROS 1ng/mL、DGX0.2ng/mL；
QC(M)中包含：ATT 10ng/mL、o-HATT 2ng/mL、p-HATT 2ng/mL、ROS 10ng/mL、DGX2ng/mL；
QC(H)中包含：ATT 100ng/mL、o-HATT 20ng/mL、p-HATT 20ng/mL、ROS 100ng/mL、DGX 20ng/mL。
在一种更优选方案中，混合内标溶液按照如下方法制备：
分别准确移取一定体积的抗动脉粥样硬化药物同位素内标母液，加入80％甲醇水溶液950μL，混匀得到1mL同位素混合内标溶液；浓度参下表2。建议分装冻存在-80℃冰箱，即取即用。
表2混合内标溶液的配制
在一种更优选方案中，校准品溶液按照如下方法制备：
分别准确移取一定体积的抗动脉粥样硬化药物标准母液，加入80％甲醇水溶液950μL，充分混匀得到1mL混合标准品溶液，浓度参下表3。
表3混合标准品溶液
| 编号 | 组分 | 母液浓度(μg/mL) | 移取体积(μL) | 总体积(μL) | 浓度(ng/mL) |
| 1 | ATT | 500 | 10 | 1000 | 5000 |
| 2 | o-HATT | 100 | 10 | 1000 | 1000 |
| 3 | p-HATT | 100 | 10 | 1000 | 1000 |
| 4 | ROS | 500 | 10 | 1000 | 5000 |
| 5 | DGX | 100 | 10 | 1000 | 1000 |
采用梯度稀释法进行标曲配制，从-20℃冰箱取出混合标准溶液后，涡旋10s，2min内使用标准溶液配制标曲最高浓度点，配制好后-80℃保存。具体过程如下表4(单位：ng/mL)：
表4标曲配制
| 标曲 | 移取溶液(μL) | 空白血浆(μL) | ATT/ROS | o-HATT/p-HATT/DGX |
| S7 | 混合标准溶液10 | 190 | 250 | 50 |
| S6 | S7 100 | 100 | 125 | 25 |
| S5 | S7 20 | 180 | 25 | 5 |
| S4 | S6 20 | 180 | 12.5 | 2.5 |
| S3 | S5 20 | 180 | 2.5 | 0.5 |
| S2 | S4 20 | 180 | 1.25 | 0.25 |
| S1 | S350 | 200 | 0.5 | 0.1 |
上述试剂盒在利用超高效液相色谱串联质谱技术检测血浆中抗动脉粥样硬化药物的应用也在本发明的保护范围之内。
具体检测方法如下：
超高效液相色谱串联质谱技术检测血浆中抗动脉粥样硬化药物的方法，
所述抗动脉粥样硬化药物分别为：阿托伐他汀(ATT)、邻羟基阿托伐他汀(o-HATT)、对羟基阿托伐他汀(p-HATT)、瑞舒伐他汀(ROS)、地高辛(DGX)。
上述抗动脉粥样硬化药物对应的同位素内标物分别为：阿托伐他汀-d5(ATT-d5)、邻羟基阿托伐他汀-d5(o-HATT-d5)、对羟基阿托伐他汀-d5(p-HATT-d5)、瑞舒伐他汀-d3(ROS-d3)、地高辛-d3(DGX-d3)。
采用超高效液相色谱串联质谱技术检测经过预处理的血浆中的上述抗动脉粥样硬化药物，先利用超高效液相色谱将目标待测物与血浆基质中的干扰组分进行分离，再利用质谱同位素内标定量法，以标准品与内标物的浓度比为X轴，标准品与内标物的峰面积比为Y轴，建立校准曲线，计算血浆中抗动脉粥样硬化药物的含量，具体色谱条件为：
(1)超高效液相色谱条件：
流动相A：0.005％～0.1％甲酸1～5mM甲酸铵水溶液；流动相B：乙腈；
色谱柱型号：Agilent Zorbax Eclipse XDB-C18(2.1×50mm，1.8μm)；
采用流动相A和流动相B为混合流动相进行梯度洗脱的方式，流动相A和流动相B的初始比例为90：10，在0-1.0分钟内，流动相A和流动相B的体积比由90：10匀速渐变至40:60；在1.0-3.0分钟内，流动相A和流动相B的体积比由40:60匀速渐变至2:98；在3.0-5.0分钟内，流动相A和流动相B的体积比由2:98变至90：10，流速为0.3mL/min，每个样品采集时间为5.0min，柱温为40℃，进样体积为1μL；
(2)质谱条件：
在电喷雾电离(ESI)模式下，采用多反应监测(MRM)进行正离子扫描；喷雾电压为3.0kV(ESI+)；源温度为120℃；雾化气温度为500℃，雾化气流速为800L/h，锥孔气流速为150L/h；同时监测了各目标物及其对应同位素内标。
为了改善色谱分离选择性，可以考虑调节流动相的极性。本发明在流动相A中添加了甲酸和甲酸铵，可有效提高某些目标化合物的离子化效率，在其他条件的配合下，较现有技术中采用LC-MS/MS方法检测血浆中抗动脉粥样硬化药物的灵敏度更高，前处理过程简单，成本低，且灵敏度高、特异性强，5min之内完成抗动脉粥样硬化药物的分离和检测。在不影响本发明效果的情况下，在一种优选方案中，流动相A为0.005％～0.1％甲酸1～5mM甲酸铵水溶液。在一种更优选方案中，流动相A为0.05％甲酸2mM甲酸铵水溶液。
在色谱法中，色谱柱的选择十分重要，对色谱柱的要求：柱效高、选择性好，分析速度快等。本发明采用0.005％～0.1％甲酸1～5mM甲酸铵水溶液和乙腈作为流动相，色谱柱型号：Agilent Zorbax Eclipse XDB-C18(2.1×50mm，1.8μm)，在其他条件的配合下，内源性物质不干扰样品的测定，灵敏度高、特异性强、成本低且前处理过程简单，5.0min之内可完成分离和检测，精密度及准确度均满足要求。
在采用内标法时，内标物的选择是一项十分重要的工作。理想的内标物应当能以准确、已知的量加到样品中去，和被分析的样品有基本相同或尽可能一致的物理化学性质、色谱行为和响应特征；在色谱分析条件下，内标物必须能与样品中各组分充分分离。本发明分别采用：阿托伐他汀-d5(ATT-d5)、邻羟基阿托伐他汀-d5(o-HATT-d5)、对羟基阿托伐他汀-d5(p-HATT-d5)、瑞舒伐他汀-d3(ROS-d3)、地高辛-d3(DGX-d3)作为内标，氘代内标和待测物具有相同的保留时间、化学性质和基质效应，测定血浆中抗动脉粥样硬化药物时的重现性、准确度均较好。
在一种方案中，流速为0.1～0.4mL/min，优选为0.3mL/min。
进一步地，柱温为35～50℃，优选为40℃。
更进一步地，进样体积为1～5μL，优选为1μL。
在一种优选方案中，采用超高效液相色谱串联质谱技术检测血浆中抗动脉粥样硬化药物时，具体色谱条件为：
(1)高效液相色谱条件：
流动相A：0.05％甲酸2mM甲酸铵-水溶液；
流动相B：乙腈；
色谱柱型号：Agilent Zorbax Eclipse XDB-C18(2.1×50mm，1.8μm)；
采用梯度洗脱的方式，见表5；流速为0.3mL/min，柱温为40℃，进样体积为1μL。
表5流动相梯度洗脱参数
| 时间(min) | 流速(mL/min) | ％A | ％B | Curve |
| 0.0 | 0.3 | 90 | 10 | - |
| 1.0 | 0.3 | 30 | 70 | 6 |
| 3.0 | 0.3 | 2 | 98 | 6 |
| 5.0 | 0.3 | 90 | 10 | 1 |
(2)质谱条件：
在电喷雾电离(ESI)模式下，采用多反应监测(MRM)进行正离子模式扫描；喷雾电压为3.0kV(ESI+)；源温度为120℃；雾化气温度为500℃，雾化气流速为800L/h，锥孔气流速为150L/h；同时监测了抗动脉粥样硬化药物及其对应同位素内标，各目标待测物的质谱采集参数见表6。
表6抗动脉粥样硬化药物质谱参数
| 化合物 | 母离子 | 子离子 | 去簇电压(V) | 碰撞电压(V) |
| ATT | 559.3 | 440.2 | 32 | 20 |
| ATT-d5 | 564.3 | 445.3 | 58 | 18 |
| p-HATT | 575.3 | 440.2 | 36 | 20 |
| p-HATT-d5 | 580.3 | 445.2 | 58 | 20 |
| o-HATT | 575.3 | 440.2 | 36 | 20 |
| o-HATT-d5 | 580.3 | 445.2 | 58 | 20 |
| ROS | 482.2 | 258.1 | 10 | 32 |
| ROS-d3 | 485.2 | 261.1 | 40 | 34 |
| DGX | 651.4 | 96.9 | 58 | 18 |
| DGX-d3 | 654.5 | 96.9 | 22 | 20 |
本发明提及的血浆为人或动物血浆。
在一种方案中，经过预处理的血浆按照如下方法制备：向血浆中加入含内标的蛋白沉淀剂，振荡离心后取上清液；其中，含内标的蛋白沉淀剂是由混合内标溶液与蛋白沉淀剂混合配制而成，蛋白质沉淀剂为甲醇与异丙醇混合溶液。
优选地，蛋白质沉淀剂中甲醇与异丙醇的体积比1:1～5，在不影响本发明效果的情况下，例如，蛋白质沉淀剂中甲醇与异丙醇的体积比1:2。
在一种优选方案中，经过预处理的血浆按照如下方法制备：取50μL血浆于1.5mL离心管中，向其中加入200μL含有内标的蛋白沉淀剂(甲醇与异丙醇的体积比1:1～5)，在12000～15000r/min，1～5℃离心4～10min后，取60μL上清液。其中含内标的蛋白沉淀剂是由混合内标溶液与蛋白沉淀剂混合配制而成，内标与蛋白沉淀剂体积比为0.1-0.3:19.7-19.9。
在一种更优选方案中，经过预处理的血浆按照如下方法制备：取50μL血浆于1.5mL离心管中，向其中加入200μL含有内标的蛋白沉淀剂(甲醇与异丙醇的体积比1:2),高速振荡(最大振速)5min；在14000r/min，4℃离心5min；转移EP管中的上清液60μL至塑料内衬管中，进样量1μL。其中含内标的蛋白沉淀剂是由混合内标溶液与蛋白沉淀剂混合配制而成，内标与蛋白沉淀剂体积比为0.2:19.8，下同。
标准品溶液按每个浓度点样品取50μL于1.5mL离心管中，向其中加入200μL含有内标的蛋白沉淀剂(甲醇与异丙醇的体积比1:2)，高速振荡(最大振速)5min；在14000r/min，4℃离心5min；转移EP管中的上清液60μL至塑料内衬管中，进样量1μL。
以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法及未说明配方的试剂均为按照本领域常规条件。
实施例1
一、实验材料与仪器
1.材料
本实施例实验的样本来自于北京301医院2019年11月份门诊收集的血浆样本。
(1)仪器：Xevo TQ-S三重四级杆质谱仪(Waters Corporation)；UPLC I-Class超高效液相色谱系统(配自动进样器，Waters Corporation)；SCILOGEX D2012高速台式离心机(美国)；超纯水仪(ELGA LabWater，英国)；多管涡旋混合仪(Vortex genie2，美国)；可调移液器(Eppendorf 0.5～10μL，10～100μL，100～1000μL)；玻璃仪器、量筒等。
(2)试剂耗材：MS级甲醇(Fisher，美国)；MS级乙腈(Fisher，美国)；HPLC级异丙醇(Honeywell，美国)；MS级甲酸(Fisher，美国)；HPLC级甲醇(Honeywell，美国)；色谱柱Agilent Zorbax Eclipse XDB-C18(2.1×50mm，1.8μm)。
(3)标准品：标准品及其对应的内标物，见表7。
表7标准品和内标
| 序号 | 中文名称 | 厂家 |
| 1 | 阿托伐他汀 | TRC |
| 2 | 阿托伐他汀-d5 | TRC |
| 3 | 邻羟基阿托伐他汀 | clearsynth |
| 4 | 邻羟基阿托伐他汀-d5 | TRC |
| 5 | 对羟基阿托伐他汀 | TRC |
| 6 | 对羟基阿托伐他汀-d5 | isoreag |
| 7 | 瑞舒伐他汀 | TRC |
| 8 | 瑞舒伐他汀-d3 | TRC |
| 9 | 地高辛 | TRC |
| 10 | 地高辛-d3 | TRC |
(4)质控品：含有抗动脉粥样硬化药物的空白血浆，分为低、中、高三个浓度，分别为QC(L)、QC(M)、QC(H)，如表1所示。
试剂盒上下四周加膜，防震保温，左上方放置流动相A和B，左下方分别放置11个安瓿瓶，分别为标准液、质控品和内标溶液；右边放置25mL蛋白沉淀剂。
二、液质条件
(1)色谱条件：流动相A：0.05％甲酸2mM甲酸铵-水溶液；流动相B：乙腈。色谱柱型号：Agilent Zorbax Eclipse XDB-C18(2.1×50mm，1.8μm)，采用梯度洗脱的方式，详见表5。流速为0.3mL/min，柱温为40℃，进样体积为1μL。
(2)质谱条件：在电喷雾电离检测模式下，采用多反应监测的质谱扫描模式；喷雾电压为3.0kV(ESI+)；源温度为120℃；雾化气温度为500℃，雾化气流速为800L/h，锥孔气流速为150L/h；同时监测各目标物以及同位素内标。各目标待测物的质谱采集参数见表6。
三、实验过程
(1)标准品配制：
分别将抗动脉粥样硬化药物母液，浓度分别为：ATT 500μg/mL、o-HATT 100μg/mL、p-HATT 100μg/mL、ROS 500μg/mL、DGX 100μg/mL，用80％甲醇水溶液配制成包含有配制成含ATT 5000ng/mL、o-HATT 1000ng/mL、p-HATT 1000ng/mL、ROS 5000ng/mL、DGX1000ng/mL混合标准溶液(详见表3)。
将上述混合标准品溶液以空白血浆配制成七个不同浓度点的校准品溶液(详见表4)，各标曲点的浓度如表4中所列，所述校准品溶液的七个浓度点为：
ATT/ROS：0.5ng/mL、1.25ng/mL、2.5ng/mL、12.5ng/mL、25ng/mL、125ng/mL、250ng/mL；
o-HATT/p-HATT/DGX：0.1ng/mL、0.25ng/mL、0.5ng/mL、2.5ng/mL、5ng/mL、25ng/mL、50ng/mL。
(2)混合内标溶液配制
将ATT-d5 20μg/mL、o-HATT-d5 4μg/mL、p-HATT-d5 4μg/mL、ROS-d3 20μg/mL、DGX-d35μg/mL母液用80％甲醇水溶液配制成包含ATT-d5 200ng/mL、o-HATT-d5 40ng/mL、p-HATT-d5 40ng/mL、ROS-d3 200ng/mL、DGX-d3 50ng/mL的同位素内标溶液(详见表2)。
(3)质控品配制：
取上述混合标准溶液以无抗动脉粥样硬化药物的空白血浆配制成三个不同浓度QC(L)、QC(M)、QC(H)，详见表1。
QC(L)中包含：ATT 1ng/mL、o-HATT 0.2ng/mL、p-HATT 0.2ng/mL、ROS 1ng/mL、DGX0.2ng/mL；
QC(M)中包含：ATT 10ng/mL、o-HATT 2ng/mL、p-HATT 2ng/mL、ROS 10ng/mL、DGX2ng/mL；
QC(H)中包含：ATT 100ng/mL、o-HATT 20ng/mL、p-HATT 20ng/mL、ROS 100ng/mL、DGX 20ng/mL。
(4)样品处理
1)标准品前处理：每个浓度点样品取50μL于1.5mL离心管中，向其中加入200μL含内标的蛋白沉淀剂(甲醇与异丙醇的体积比1：2)，高速振荡(最大振速)5min；在14000r/min，4℃离心5min；转移EP管中的上清液60μL至塑料内衬管中，进样量1μL。
2)血浆样品前处理：取50μL血浆于1.5mL离心管中，向其中加入200μL含内标蛋白沉淀剂(甲醇与异丙醇的体积比1：2)，高速振荡(最大振速)5min；在14000r/min，4℃离心5min；转移EP管中的上清液60μL至塑料内衬管中，进样量1μL。
3)质控品前处理：分别取质控品溶液QC(L)、QC(M)、QC(H)各50μL于1.5mL离心管中，然后与血浆样品前处理一致，此处不再赘述。
分析试剂盒中各组分见表8。
表8抗动脉粥样硬化药物分析试剂盒组分的制备(100人份)
备注：所述含内标的蛋白沉淀剂按照如下方法制备，取200μL上述混合内标溶液加入至19.8mL蛋白沉淀剂中，即得含内标的蛋白沉淀剂。
四、方法验证
1.提取离子流色谱图：抗动脉粥样硬化药物的标准品和血浆样品的峰形比较对称，且没有杂峰干扰，说明在此条件下能够得到良好的检测，图1为抗动脉粥样硬化药物标准品的提取离子流谱图；图2为血浆样本中抗动脉粥样硬化药物的提取离子流谱图。
2.校准曲线：采用同位素内标定量法，利用TargetLynx软件以标准物与内标物的浓度比为X轴，标准物与内标物峰面积比为Y轴，建立校准曲线，并计算出血浆中待测物的浓度。抗动脉粥样硬化药物在各自浓度范围内的线性拟合方程，线性良好，相关系数在0.99以上，满足定量要求，见表9。
表9抗动脉粥样硬化药物线性回归方程及线性相关系数
| 序号 | 化合物 | 保留时间(min) | 线性范围(ng/mL) | 线性方程 | 相关系数(r) |
| 1 | ATT | 2.62 | 0.5-250 | Y＝0.16763*X+0.0197352 | 0.9978 |
| 2 | OHATT | 2.54 | 0.1-50 | Y＝0.236757*X-0.000428069 | 0.9959 |
| 3 | PHATT | 2.2 | 0.1-50 | Y＝0.797576*X-0.00289765 | 0.9975 |
| 4 | ROS | 2.2 | 0.5-250 | Y＝0.229518*X+0.00373923 | 0.9990 |
| 1 | DGX | 1.91 | 0.1-50 | Y＝0.207176*X+0.040288 | 0.995 |
3.准确度考察：采用加标回收率试验评估方法的准确性。准备一混合空白血浆样品，分别加入低、中、高3个浓度的标准品，以相同步骤重复处理并测定5次，结果显示，抗动脉粥样硬化药物的加标回收率在97.0％-110.0％之间，5次重复试验的RSD在2.11％-9.71％范围，统计结果见表10。
表10抗动脉粥样硬化药物加标回收率结果
4.精密度试验：取无干扰空白血浆样本，加入不同浓度抗动脉粥样硬化药物标准品，得到低、中、高三个浓度血浆样本，一天内重复处理6批，连续处理三天，以同位素内标法定量测定抗动脉粥样硬化药物的浓度，批内精密度为1.11-14.09％，三日内分3批处理，计算批间精密度为3.51-10.04％，结果见表11。
表11批内及批间精密度测试结果
由以上结果可知，采用本发明的试剂盒测定人体血浆中抗动脉粥样硬化药物，血浆用量少(仅需50μL)且前处理简单，一针分析多种物质只需5min，简单快速。
采用同位素内标法定量不仅可以极大消除基质干扰，而且结果不受前处理过程、仪器响应波动等条件的影响，能够达到准确定量。以加标回收率试验评估方法的准确性，结果显示，抗动脉粥样硬化药物的加标回收率为97.0％-110.0％之间，5次重复试验的RSD为2.11％-9.71％，准确度良好。
方法的重现性结果表明，抗动脉粥样硬化药物批内精密度为1.11-14.09％，批间精密度为3.51-10.04％，方法的重现性良好。
总之，该方法灵敏度高、特异性强、准确且前处理过程简单，5min之内完成化合物的分离和检测，准确度及精密度满足要求，可用于临床上血浆抗动脉粥样硬化药物的定量分析，为相关的药物浓度监测提供一种可靠的检测方法。
Claims (10)
1.一种检测血浆中抗动脉粥样硬化药物的试剂盒，其特征在于：包括液相色谱流动相、校准品溶液、混合内标溶液、质控品和蛋白质沉淀剂；
所述抗动脉粥样硬化药物包括阿托伐他汀、邻羟基阿托伐他汀、对羟基阿托伐他汀、瑞舒伐他汀和地高辛；
所述液相色谱流动相包括流动相A和流动相B，流动相A为甲酸-甲酸铵水溶液，流动相B为乙腈；
所述校准品溶液包括系列浓度已知的由空白血浆配制的阿托伐他汀、邻羟基阿托伐他汀、对羟基阿托伐他汀、瑞舒伐他汀和地高辛的混合溶液；
所述混合内标溶液包括浓度已知的由甲醇水溶液配制的阿托伐他汀-d5、邻羟基阿托伐他汀-d5、对羟基阿托伐他汀-d5、瑞舒伐他汀-d3和地高辛-d3的混合溶液；
所述质控品包括浓度已知的由空白血浆配制的阿托伐他汀、邻羟基阿托伐他汀、对羟基阿托伐他汀、瑞舒伐他汀和地高辛的混合溶液；
所述蛋白沉淀剂为甲醇和异丙醇的混合溶液。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述蛋白沉淀剂中甲醇和异丙醇的体积比1: 1~5。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：所述蛋白质沉淀剂中甲醇与异丙醇的体积比1:2。
4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述流动相A为0.005%~0.1%甲酸1~5mM甲酸铵水溶液。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于：所述流动相A为0.05%甲酸2mM甲酸铵水溶液。
6.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述校准品溶液包括以下7种混合溶液：
混合溶液1：阿托伐他汀、邻羟基阿托伐他汀、对羟基阿托伐他汀、瑞舒伐他汀和地高辛的终浓度分别为：阿托伐他汀0.5 ng/mL、邻羟基阿托伐他汀0.1 ng/mL、对羟基阿托伐他汀0.1 ng/mL、瑞舒伐他汀0.5 ng/mL、地高辛0.1 ng/mL；
混合溶液2：阿托伐他汀、邻羟基阿托伐他汀、对羟基阿托伐他汀、瑞舒伐他汀和地高辛的终浓度分别为：阿托伐他汀1.25 ng/mL、邻羟基阿托伐他汀0.25 ng/mL、对羟基阿托伐他汀0.25 ng/mL、瑞舒伐他汀1.25 ng/mL、地高辛0.25 ng/mL；
混合溶液3：阿托伐他汀、邻羟基阿托伐他汀、对羟基阿托伐他汀、瑞舒伐他汀和地高辛的终浓度分别为：阿托伐他汀2.5 ng/mL、邻羟基阿托伐他汀0.5 ng/mL、对羟基阿托伐他汀0.5 ng/mL、瑞舒伐他汀2.5 ng/mL、地高辛0.5 ng/mL；
混合溶液4：阿托伐他汀、邻羟基阿托伐他汀、对羟基阿托伐他汀、瑞舒伐他汀和地高辛的终浓度分别为：阿托伐他汀12.5 ng/mL、邻羟基阿托伐他汀2.5 ng/mL、对羟基阿托伐他汀2.5 ng/mL、瑞舒伐他汀12.5 ng/mL、地高辛2.5 ng/mL；
混合溶液5：阿托伐他汀、邻羟基阿托伐他汀、对羟基阿托伐他汀、瑞舒伐他汀和地高辛的终浓度分别为：阿托伐他汀25 ng/mL、邻羟基阿托伐他汀5 ng/mL、对羟基阿托伐他汀5ng/mL、瑞舒伐他汀25ng/mL、地高辛5 ng/mL；
混合溶液6：阿托伐他汀、邻羟基阿托伐他汀、对羟基阿托伐他汀、瑞舒伐他汀和地高辛的终浓度分别为：阿托伐他汀125 ng/mL、邻羟基阿托伐他汀25 ng/mL、对羟基阿托伐他汀25 ng/mL、瑞舒伐他汀125ng/mL、地高辛25 ng/mL；
混合溶液7：阿托伐他汀、邻羟基阿托伐他汀、对羟基阿托伐他汀、瑞舒伐他汀和地高辛的终浓度分别为：阿托伐他汀250 ng/mL、邻羟基阿托伐他汀50 ng/mL、对羟基阿托伐他汀50 ng/mL、瑞舒伐他汀250 ng/mL、地高辛50 ng/mL。
7.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述混合内标溶液中，阿托伐他汀-d5、邻羟基阿托伐他汀-d5、对羟基阿托伐他汀-d5、瑞舒伐他汀-d3和地高辛-d3的浓度分别为：阿托伐他汀-d5 200 ng/mL、邻羟基阿托伐他汀-d5 40 ng/mL、对羟基阿托伐他汀-d5 40ng/mL、瑞舒伐他汀-d3 200 ng/mL、地高辛-d3 50 ng/mL。
8.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述质控品包括以下3种溶液：
低浓度质控品：阿托伐他汀、邻羟基阿托伐他汀、对羟基阿托伐他汀、瑞舒伐他汀和地高辛的浓度分别为：阿托伐他汀1 ng/mL、邻羟基阿托伐他汀0.2 ng/mL、对羟基阿托伐他汀0.2 ng/mL、瑞舒伐他汀1 ng/mL、地高辛0.2 ng/mL；
中浓度质控品：阿托伐他汀、邻羟基阿托伐他汀、对羟基阿托伐他汀、瑞舒伐他汀和地高辛的浓度分别为：阿托伐他汀10 ng/mL、邻羟基阿托伐他汀2 ng/mL、对羟基阿托伐他汀2ng/mL、瑞舒伐他汀10 ng/mL、地高辛2 ng/mL；
高浓度质控品：阿托伐他汀、邻羟基阿托伐他汀、对羟基阿托伐他汀、瑞舒伐他汀和地高辛的浓度分别为：阿托伐他汀100 ng/mL、邻羟基阿托伐他汀20 ng/mL、对羟基阿托伐他汀20 ng/mL、瑞舒伐他汀100 ng/mL、地高辛20 ng/mL。
9.权利要求1所述的试剂盒在利用超高效液相色谱串联质谱技术检测血浆中抗动脉粥样硬化药物中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：所述混合内标溶液先和蛋白沉淀剂混合而成含内标的蛋白沉淀剂后再用于检测，混合内标溶液和蛋白沉淀剂的体积比为0.1-0.3:19.7-19.9。
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Legal Events
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|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20200825 |
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