CN113155992B - 一种同时检测人血浆中芳香化酶抑制剂和5型磷酸二酯酶抑制剂及其代谢产物浓度的方法 - Google Patents

一种同时检测人血浆中芳香化酶抑制剂和5型磷酸二酯酶抑制剂及其代谢产物浓度的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN113155992B
CN113155992B CN202110274933.XA CN202110274933A CN113155992B CN 113155992 B CN113155992 B CN 113155992B CN 202110274933 A CN202110274933 A CN 202110274933A CN 113155992 B CN113155992 B CN 113155992B
Authority
CN
China
Prior art keywords
inhibitor
solution
sample
aromatase
phosphodiesterase type
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202110274933.XA
Other languages
English (en)
Other versions
CN113155992A (zh
Inventor
范国荣
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Golden Olive Technology Shanghai Co ltd
Original Assignee
Golden Olive Technology Shanghai Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Golden Olive Technology Shanghai Co ltd filed Critical Golden Olive Technology Shanghai Co ltd
Priority to CN202110274933.XA priority Critical patent/CN113155992B/zh
Publication of CN113155992A publication Critical patent/CN113155992A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN113155992B publication Critical patent/CN113155992B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/04—Preparation or injection of sample to be analysed
    • G01N30/06—Preparation
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/26—Conditioning of the fluid carrier; Flow patterns
    • G01N30/28—Control of physical parameters of the fluid carrier
    • G01N30/34—Control of physical parameters of the fluid carrier of fluid composition, e.g. gradient
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/26—Conditioning of the fluid carrier; Flow patterns
    • G01N30/28—Control of physical parameters of the fluid carrier
    • G01N30/36—Control of physical parameters of the fluid carrier in high pressure liquid systems
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/62—Detectors specially adapted therefor
    • G01N30/72—Mass spectrometers
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/04—Preparation or injection of sample to be analysed
    • G01N2030/042—Standards
    • G01N2030/045—Standards internal

Landscapes

  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Other Investigation Or Analysis Of Materials By Electrical Means (AREA)

Abstract

本发明提供一种同时检测人血浆中芳香化酶抑制剂和5型磷酸二酯酶抑制剂药物浓度的方法，包括：在人血浆样品中加入蛋白沉淀剂沉淀人血浆样品中的蛋白，获得的样品溶液采用高效液相色谱质谱联用法进行测定，根据保留时间确定样品溶液中芳香化酶抑制剂、5型磷酸二酯酶抑制剂及其代谢产物，采用内标标准曲线法进行定量，确定样品溶液中芳香化酶抑制剂、5型磷酸二酯酶抑制剂及其代谢产物的浓度。该方法不仅简单快速、定量准确，同时还具有灵敏度高、选择性强、重复性好和回收率高等优点，满足操作简单、数据可靠以及条件可控的临床大批量生物样品分析需求。

Description

一种同时检测人血浆中芳香化酶抑制剂和5型磷酸二酯酶抑 制剂及其代谢产物浓度的方法
技术领域
本发明属于临床血药浓度监测的技术领域，涉及一种同时检测人血浆中芳香化酶抑制剂和5型磷酸二酯酶抑制剂药物浓度的方法，具体涉及一种同时检测人血浆中芳香化酶抑制剂、5型磷酸二酯酶抑制剂及其代谢产物浓度的高效液相色谱质谱联用(HPLC-MS/MS)方法。
背景技术
世界卫生组织(WHO)规定，夫妻双方未采用任何避孕措施同居生活1年以上，由于男方因素造成女方不孕者，称为男性不育症。男性不育是一个世界性的难题，其治疗方法受到限制，尤其是目前尚无明确有效治疗的药物。近年来，临床医生使用芳香化酶抑制剂(Aromatase inhibitors，AIs)和5型磷酸二酯酶抑制剂(Phosphodiesterase-5inhibitors，PDE5is)联合用药治疗男性不育症。AIs通过阻断睾酮(T)转化为雌二醇(E2)所需的芳香化酶作用来抑制T转化为E2，从而增加T水平，降低E2水平，以促进精子成熟和精子数量的增加；PDE5is通过抑制降解cGMP的5型磷酸二酯酶活性而增高细胞内cGMP浓度，是勃起功能障碍的首选治疗药物，但越来越多的研究表明PDE5is可以改善精子质量，从而对男性不育症也有一定的治疗作用。临床上常用的AIs有阿那曲唑和来曲唑，PDE5is有西地那非和他达拉非，其中西地那非在体内代谢迅速，起效快，其主要代谢产物N-去甲基西地那非同时也具有药理活性。
值得注意的是，除常见的不良反应外，有文献报道阿那曲唑易引起高甘油三酯血症和高胆固醇血症，也有病例提示来曲唑可能会导致重度脂肪肝，并且虽然有指南表明AIs可用于治疗男性不育症，疗效显著，但缺乏相关临床研究，其药效、毒副作用、个体差异是否与血药浓度有关，还有待商榷(参见：中华医学会男科学分会中国男科疾病诊断治疗指南与专家共识[J].人民卫生出版社,2016；李娜,杜扬帆,李凯等.依西美坦和阿那曲唑在乳腺癌内分泌治疗中不良反应差异的分析[J].现代肿瘤医学,2019；杨香瑜,张韶辉,陈露,等.来曲唑致重度脂肪肝1例并文献复习[J].中国新药与临床杂志,2020)。
另外，PDE5is的不良反应可能涉及心血管、消化、神经系统等，这可能与用药剂量、频率及个体差异有关(参见：Yu,Z.J.,et al.,Efficacy and Side Effects ofDrugsCommonly Used for the Treatment of Lower Urinary Tract Symptoms AssociatedWith Benign Prostatic Hyperplasia.Front Pharmacol,2020.)；同时，有报道称PDE5is对芳香化酶也存在着抑制作用，猜测PDE5is与AIs可能会存在协同的相互作用，这是否会影响治疗效果或者产生新的毒副作用，也不得而知(参见：Baravalle R,Valetti F,CatucciG,et al.Effect of sildenafil on human aromatase activity:From in vitrostructural analysis to catalysis and inhibition in cells[J].The Journal ofSteroid Biochemistry and Molecular Biology,2017.)。
因此，对使用AIs和PDE5is的患者，有必要对其血药浓度进行监测，探究血药浓度、药效和毒副反应三者关系，为男性不育症患者的合理用药提供参考，实现真正的个体化治疗。
迄今为止，对于AIs或PDE5is及其代谢产物在人血浆中药物浓度的测定方法，国外报道较多(参见：Yoshinari Yokoyama，et al,Simultaneous microdeterminationofbosentan,ambrisentan,sildenafil,and tadalafil in plasma using liquidchromatography/tandem mass spectrometry for pediatric patients with pulmonaryarterial hypertension[J]Journal of Pharmaceutical and BiomedicalAnalysis,2014)，国内报道比较少见，并且同时检测AIs和PDE5is及其代谢产物的方法还未见报道。
目前已有报道关于AIs或PDE5is及其代谢产物在人血浆中药物浓度的测定方法中液相色谱-串联质谱法应用最多，但是这些方法或多或少存在一些不足：如样品前处理较复杂或者耗时、灵敏度较低、检测时间较长、线性范围窄、血浆或有机试剂用量大等，导致工作量大、检测成本较高或者不能满足临床需求等；并且这些方法检测标准不一致，致使不能同时检测同一患者血浆样品的不同药物浓度，从而增加了工作量与患者等待时长，并且浪费了大量患者血浆。因此，有必要开发一种能够同时检测人血浆中AIs和PDE5is及其代谢产物药物浓度的方法，以此统一检测标准，不仅节省了工作量和患者血浆，减少了患者等待时长，还可避免需针对不同检测药物开发不同检测方法的麻烦，同时也有利于不同实验室或检测点数据的相互参考和使用。
发明内容
鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种同时检测人血浆中芳香化酶抑制剂和5型磷酸二酯酶抑制剂药物浓度的方法，能够同时对人血浆中芳香化酶抑制剂、5型磷酸二酯酶抑制剂及其代谢产物进行检测，具有分析速度快、灵敏度高、准确可靠等优点。
为实现上述目的及其他相关目的，本发明第一方面提供一种同时检测人血浆中芳香化酶抑制剂和5型磷酸二酯酶抑制剂药物浓度的方法，包括如下两个步骤：
A、样品预处理
将含有内标的蛋白沉淀剂加入至待检人血浆样品中，涡旋震荡、离心后取上清液；
B、样品检测
步骤A中获得的样品溶液采用高效液相色谱质谱联用法进行测定，根据保留时间确定样品溶液中芳香化酶抑制剂、5型磷酸二酯酶抑制剂及其代谢产物；采用内标标准曲线法进行定量，确定样品溶液中芳香化酶抑制剂、5型磷酸二酯酶抑制剂及其代谢产物的浓度。
优选地，所述芳香化酶抑制剂包括阿那曲唑(CAS号为120511-73-1)和来曲唑(CAS号为112809-51-5)。
所述5型磷酸二酯酶抑制剂包括西地那非(CAS号为139755-83-2)和他达拉非(CAS号为171596-29-5)。
所述5型磷酸二酯酶抑制剂的代谢产物为西地那非的活性代谢产物：N-去甲基西地那非(CAS号为139755-82-1)。
优选地，步骤A中：内标为联苯苄唑(CAS号为60628-96-8)或其类似物；含有内标的蛋白沉淀剂为联苯苄唑的甲醇水溶液与乙腈的混合溶液，加入体积为人血浆样品的1～3倍，优选为2倍体积；
更优选地，所述联苯苄唑的甲醇水溶液与乙腈的体积比为1:15-25，优选为1:20。所述联苯苄唑的甲醇水溶液中联苯苄唑的浓度为0.20-0.30μg/mL，优选为0.25μg/mL。所述联苯苄唑的甲醇水溶液中，甲醇与水的体积比为1:0.95-1.05，优选为1:1。
血浆样品的预处理条中，涡旋震荡的时间为2-4min，优选为3min，用于沉淀蛋白；离心的时间为9-11分钟，离心的温度为3-5℃，离心的转速为10000-15000g/min。进一步优选地，离心的时间为10分钟，离心的温度为4℃，离心的转速为12000g/min。
步骤B中，上清液的取液量为90-110μL，优选为100μL，包括如下步骤：
B1、配制标准溶液：在空白血浆样品中加入不同浓度药物标准品溶液，获得的混合液加入步骤A所述的含有内标的蛋白沉淀剂，并采用相同的条件沉淀空白血浆样品中的蛋白，获得标准溶液；
B2、样品检测及分析：采用高效液相色谱质谱联用法分别检测样品溶液和标准溶液；将获得的样品溶液的液相色谱图与标准溶液的液相色谱图进行比较，根据相对保留时间指认出共有特征峰定性；再根据共有特征峰的色谱峰面积通过内标标准曲线法进行定量，确定样品溶液中芳香化酶抑制剂、5型磷酸二酯酶抑制剂及其代谢产物的浓度。
优选地，步骤B1中，所述药物标准品溶液为芳香化酶抑制剂、5型磷酸二酯酶抑制剂及其代谢产物标准品的储备液经稀释后的溶液。
进一步优选地，所述芳香化酶抑制剂、5型磷酸二酯酶抑制剂及其代谢产物标准品的储备液中采用的溶剂为甲醇。
进一步优选地，所述稀释用的溶剂为甲醇水溶液，所述水溶液中甲醇与水的体积比为1:0.95-1.05，优选为1:1。
进一步优选地，所述芳香化酶抑制剂、5型磷酸二酯酶抑制剂及其代谢产物标准品的储备液中，所述芳香化酶抑制剂、5型磷酸二酯酶抑制剂及其代谢产物的浓度均为1mg/mL。
所述空白血浆样品与药物溶液加入的体积之比为85-95:10，优选为90:10。
配置的标准溶液中芳香化酶抑制剂、5型磷酸二酯酶抑制剂及其代谢产物的浓度范围为：阿那曲唑0.5-1000ng/mL；来曲唑1-1000ng/mL；西地那非5-1000ng/mL；N-去甲基西地那非1-1000ng/mL；他达拉非2-1000ng/mL。
优选的，B2中，高效液相色谱(HPLC)的检测条件如下：
色谱柱：Agilent ZORBAX SB-Aq柱，内径4.6×柱长150mm、粒径5μm；柱温：40-50℃；进样量：5-15μL；流速：0.5-2.0mL/min；柱后2-4:6-8分流，2-4/10流入质谱分析；流动相A相为乙腈；流动相B相为9-11mmol/L乙酸铵水溶液并用甲酸调pH至3.1-3.3；分析时间为5min；
梯度洗脱的具体程序为：
0.30min， A相：B相体积比为40：60-80：20；
0.3-3.00min， A相：B相体积比为80：20-80：20；
3.00-3.01min，A相：B相体积比为80：20-100：0；
3.01-3.50min，A相：B相体积比为100：0-100：0；
3.50-3.51min，A相：B相体积比为100：0-40：60；
3.51-5.00min，A相：B相体积比为40：60-40：60。具体参见表1：
表1高效液相色谱(HPLC)梯度洗脱程序
时间(min) A(％) B(％) 流速(mL·min<sup>-1</sup>)
0.00 40 60 1.0
0.30 80 20 1.0
3.00 80 20 1.0
3.01 100 0 1.0
3.50 100 0 1.0
3.51 40 60 1.0
5.00 40 60 1.0
优选地，B2中，所述质谱(MS/MS)的测定条件为：
电离方式：电喷雾离子源(ESI)，正离子检测模式；喷雾电压为5500V；雾化温度为550.0℃；雾化气为50units；辅助加热气为50units；气帘气为30units；碰撞气为10units；入口电压(Entrance potential，EP)为10.0V；碰撞室出口电压(Collision ExitPotential，CXP)为15.0V；监测方式为多反应监测(MRM)模式进行一/二级质谱分析；
芳香化酶抑制剂、5型磷酸二酯酶抑制剂及其代谢产物和内标的母离子质荷比、定量子离子质荷比、定性子离子质荷比、去簇电压(Declustering Potential，DP)、碰撞电压(Collision Energy，CE)见表2：
表2质谱质荷比、去簇电压、碰撞电压条件
Figure BDA0002976232950000051
上述多反应监测(MRM)模式，通过质谱仪中的三重四级杆先对母离子进行选择性筛选，而后母离子进入碰撞池被碰撞碎裂，对所产生的碎片离子进行高分辨率扫描并选择具有特征性的二级碎片离子进行定量。
优选地，步骤B2中，所述内标标准曲线法包括以下步骤：
1)将含有一系列不同浓度的芳香化酶抑制剂、5型磷酸二酯酶抑制剂及其代谢产物的标准溶液，分别进行高效液相色谱质谱联用法分析，对5种芳香化酶抑制剂、5型磷酸二酯酶抑制剂及其代谢产物成分及内标的特征性二级碎片离子进行提取，获得5种芳香化酶抑制剂、5型磷酸二酯酶抑制剂及其代谢产物成分在不同浓度下的色谱峰面积/内标的色谱峰面积的比值与相应成分的不同浓度/内标的浓度的比值的线性关系，绘制相应的标准曲线，用加权最小二乘法进行回归运算，得到5种芳香化酶抑制剂、5型磷酸二酯酶抑制剂及其代谢产物成分的标准曲线的回归方程；
2)将样品溶液进行高效液相色谱质谱联用法分析，将获得的各种芳香化酶抑制剂、5型磷酸二酯酶抑制剂及其代谢产物成分与内标的色谱峰面积比，代入步骤A1)中相应成分的标准工作曲线的回归方程，并根据内标的已知浓度，计算得到样品溶液中相应芳香化酶抑制剂、5型磷酸二酯酶抑制剂及其代谢产物成分的浓度。
更优选地，上述步骤1)或2)中，所述标准工作曲线中，以5种芳香化酶抑制剂、5型磷酸二酯酶抑制剂及其代谢产物成分在不同浓度下的色谱峰面积/内标的色谱峰面积的比值为纵坐标(Y轴)，其相应成分的不同浓度/内标的浓度的比值为横坐标(X轴)。
本发明第二方面，提供一种同时检测人血浆中芳香化酶抑制剂和5型磷酸二酯酶抑制剂药物浓度的方法在临床样本血药浓度监测中的用途。
优选地，所述血药为芳香化酶抑制剂(AIs)和/或5型磷酸二酯酶抑制剂(PDE5is)及其代谢产物。
如上所述，本发明提供的一种同时检测人血浆中多种抑制剂及其代谢产物药物浓度的方法，以联苯苄唑为内标，采用乙腈蛋白沉淀法前处理后进样，经高效液相色谱进行分离，然后采用质谱中电喷雾离子源(ESI)正离子多反应离子监测(MRM)扫描模式对药物进行靶向性检测并定量，从而实现药物浓度的分析测定，具有以下有益效果：
(1)本发明提供的一种同时检测人血浆中多种抑制剂及其代谢产物药物浓度的方法，选择性强，空白血浆中的内源性物质和相应的代谢产物、降解产物均不干扰样品检测。
(2)本发明提供的一种同时检测人血浆中多种抑制剂及其代谢产物药物浓度的方法，高通量、灵敏度高、精密度和准确度良好、稳定性好、提取回收率高、，本发明方法对于人血浆中各药物的定量下限可低至：阿那曲唑0.5ng/mL、来曲唑1ng/mL、西地那非5ng/mL、N-去甲基西地那非1ng/mL、他达拉非2ng/mL。
(3)本发明提供的一种同时检测人血浆中多种抑制剂及其代谢产物药物浓度的方法，检测快速，在5min内就可完成一次血浆样品的检测。
(4)本发明提供的一种同时检测人血浆中多种抑制剂及其代谢产物药物浓度的方法，无明显基质效应，通过对色谱柱、流动相的合理选择及洗脱梯度、前处理方法的优化，基本消除了基质在质谱中所产生的干扰效应。
(5)本发明提供的一种同时检测人血浆中多种抑制剂及其代谢产物药物浓度的方法，血浆样品前处理采用2倍体积的蛋白沉淀剂进行沉淀蛋白，操作简单快速，不仅沉淀较完全，并且提取回收率也较高，与液液萃取繁琐的操作和试剂消耗相比，本法极大的缩短了实验操作时长和有机试剂消耗。
(6)本发明提供的一种同时检测人血浆中多种抑制剂及其代谢产物药物浓度的方法，不仅节省了工作量和患者血浆，减少了患者等待时长，还可避免需针对不同检测药物开发不同检测方法的麻烦，同时也有利于不同实验室或检测点数据的相互参考和使用。
(7)本发明提供的一种同时检测人血浆中多种抑制剂及其代谢产物药物浓度的方法，满足操作简单、数据可靠以及条件可控的临床大批量生物样品分析需求，已成功应用于临床上常用的芳香化酶抑制剂和5型磷酸二酯酶抑制剂及其代谢产物的血药浓度监测。
附图说明
图1为本发明中阿那曲唑的二级质谱图。
图2为本发明中来曲唑的二级质谱图。
图3为本发明中西地那非的二级质谱图。
图4为本发明中N-去甲基西地那非的二级质谱图。
图5为本发明中他达拉非的二级质谱图。
图6为本发明中作为内标的联苯苄唑的二级质谱图。
具体实施方式
下面结合具体实施例进一步阐述本发明，应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的保护范围。
以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
以下实施例中英文缩写名词的具体解释，见下表3：
表3本发明实施例所涉及英文缩写名词的具体解释
缩写 全称 中文说明
LLOQ lower limit of quantitation 定量下限
LQC low quality control 低质控
MQC medium quality control 中质控
HQC high quality control 高质控
RSD relative standard deviation 相对标准偏差
RE relative error 相对偏差
以下实施例中所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市场购得的常规产品。
1、仪器
仪器：液质联用仪包括LC-20AD液相色谱仪(日本岛津公司)和API-4000型三重四级杆质谱仪(美国AB SCIEX公司)、MX-S涡旋混合器(美国SCILOGEX公司)、Sorvall LegendMicro21R微量离心机(美国Thermo Fisher公司)、SK7200H超声仪(上海科导超声仪器有限公司)。
2、试剂与药品
乙腈(美国TEDIA公司)、乙酸胺(美国ACS公司)、甲酸(美国ACS公司)、甲醇(德国Merck公司)、阿那曲唑(批号：100770-201302，购自中国食品药品检定研究院)、来曲唑(批号：A0610AS，购自大连美仑生物技术有限公司)、西地那非(批号：X23A8Y42189，上海源叶生物科技有限公司)、N-去甲基西地那非(批号：J16A10H95420，上海源叶生物科技有限公司)、他达拉非(批号：Y20F8C29468，上海源叶生物科技有限公司)、联苯苄唑(中国食品药品检定研究院)、纯水(屈臣氏)。
实施例1血浆中芳香化酶抑制剂和5型磷酸二酯酶抑制剂及其代谢产物浓度检测
1、样品前处理
用甲醇作为溶剂配制联苯苄唑的储备液，联苯苄唑的储备液中，联苯苄唑的浓度为1mg/mL，密封于4℃冰箱保存备用。
取联苯苄唑的储备液加入体积比为1:1的甲醇水溶液稀释，配制联苯苄唑的甲醇水溶液，其中联苯苄唑的浓度为0.25μg/mL。将联苯苄唑的甲醇水溶液与乙腈按体积比为1:20混合，获得蛋白沉淀剂。
取人血浆样品，加入2倍体积的蛋白沉淀剂，涡旋震荡3min，进行沉淀蛋白，在4℃下以12000g/min转速离心10min，取100μL上清液置于进样管中，获得样品溶液待用。
2、标准溶液
采用甲醇作为溶剂配制芳香化酶抑制剂、5型磷酸二酯酶抑制剂及其代谢产物标准品的储备液，其中，芳香化酶抑制剂、5型磷酸二酯酶抑制剂及其代谢产物的浓度均为1mg/mL，密封于4℃冰箱保存备用。
取芳香化酶抑制剂、5型磷酸二酯酶抑制剂及其代谢产物标准品的储备液，加入体积比为1:1的甲醇水溶液稀释，配制药物溶液。
在一系列空白血浆样品中分别加入1/10倍体积含有一系列不同浓度的芳香化酶抑制剂、5型磷酸二酯酶抑制剂及其代谢产物的药物溶液，获得的混合液加入蛋白沉淀剂沉淀空白血浆样品中的蛋白，涡旋震荡3min，进行沉淀蛋白，在4℃下以12000g/min转速离心10min，取100μL上清液置于进样管中，获得一系列含有不同浓度的5种芳香化酶抑制剂、5型磷酸二酯酶抑制剂及其代谢产物的标准溶液待用。标准溶液中所含的5种芳香化酶抑制剂、5型磷酸二酯酶抑制剂及其代谢产物的一系列浓度见表4。
表4标准溶液中五种物质的不同浓度汇总
Figure BDA0002976232950000091
3、检测
采用高效液相色谱质谱联用法分别检测一系列含有不同浓度的芳香化酶抑制剂、5型磷酸二酯酶抑制剂及其代谢产物的标准溶液，将获得的样品溶液的液相色谱图，与标准溶液的液相色谱图进行比较，根据相对保留时间指认出共有特征峰定性，确定样品溶液中5种芳香化酶抑制剂、5型磷酸二酯酶抑制剂及其代谢产物。
再对5种芳香化酶抑制剂、5型磷酸二酯酶抑制剂及其代谢产物成分及内标的特征性二级碎片离子进行提取，获得5种芳香化酶抑制剂、5型磷酸二酯酶抑制剂及其代谢产物成分在不同浓度下的色谱峰面积/内标的色谱峰面积的比值与相应成分的不同浓度/内标的浓度的比值的线性关系，绘制相应的标准曲线，用加权最小二乘法进行回归运算，得到5种芳香化酶抑制剂、5型磷酸二酯酶抑制剂及其代谢产物成分的标准曲线的回归方程。
将样品溶液进行高效液相色谱质谱联用法分析，将获得的各种芳香化酶抑制剂、5型磷酸二酯酶抑制剂及其代谢产物成分与内标的色谱峰面积比，代入相应成分的标准工作曲线的回归方程，并根据内标的已知浓度，计算得到样品溶液中相应芳香化酶抑制剂、5型磷酸二酯酶抑制剂及其代谢产物成分的含量。
其中，高效液相色谱(HPLC)的测定条件为：Agilent ZORBAX SB-Aq柱(内径4.6×柱长150mm，粒径5μm)；柱温：45℃；进样量：10μL；流速：1mL/min；柱后3:7分流，3/10流入质谱分析；流动相A相为乙腈；流动相B相为10mmol/L乙酸铵水溶液并用甲酸调pH至3.2；分析时间为5min；梯度洗脱。
如表1所示，梯度洗脱的具体程序为：
0-0.30min，A相：B相体积比为40：60-80：20；
0.3-3.00min，A相：B相体积比为80：20-80：20；
3.00-3.01min，A相：B相体积比为80：20-100：0；
3.01-3.50min，A相：B相体积比为100：0-100：0；
3.50-3.51min，A相：B相体积比为100：0-40：60；
3.51-5.00min，A相：B相体积比为40：60-40：60。
电离方式：电喷雾离子源(ESI)，正离子检测模式；喷雾电压为5500V；雾化温度为550.0℃；雾化气为50units；辅助加热气为50units；气帘气为30units；碰撞气为10units；入口电压(Entrance potential，EP)为10.0V；碰撞室出口电压(Collision ExitPotential，CXP)为15.0V；监测方式为多反应监测(MRM)模式进行一/二级质谱分析；芳香化酶抑制剂、5型磷酸二酯酶抑制剂及其代谢产物和内标的母离子质荷比、定量子离子质荷比、定性子离子质荷比、去簇电压(Declustering Potential，DP)、碰撞电压(CollisionEnergy，CE)见表2。各芳香化酶抑制剂、5型磷酸二酯酶抑制剂及其代谢产物、内标的二级质谱图见图1-6。
实施例2质控溶液
采用体积比为1:1的甲醇水溶液稀释上述实施例1的步骤1、2中芳香化酶抑制剂、5型磷酸二酯酶抑制剂及其代谢产物标准品的储备液和联苯苄唑的储备液，分别得到各个成分和内标的不同浓度质控溶液，将不同浓度质控溶液按每一浓度梯度对应混合，得到混合质控溶液。
取一系列90μL空白血浆样品，分别加入10μL某一浓度梯度的混合质控溶液，采用上述实施例1的步骤2进行处理，依次制得不同浓度的质控血浆溶液，质控血浆溶液分别为定量下限LLOQ、低质控LQC、中质控MQC、高质控HQC溶液，具体浓度见表5。
表5不同质控溶液浓度汇总
Figure BDA0002976232950000101
实施例3方法学验证
对本发明中方法进行方法学验证，主要包括选择性、线性、精密度和准确度、基质效应和回收率、稳定性。
1、选择性
取人空白血浆样品100μL按实施例1的步骤1进行处理，其中，蛋白沉淀剂不添加联苯苄唑的甲醇水溶液。取LLOQ血浆样品100μL，按实施例1的步骤1进行处理。然后，将人空白血浆样品和LLOQ血浆样品按实施例1的步骤3进行检测。可以发现阿那曲唑、来曲唑、西地那非、N-去甲基西地那非、他达拉非和联苯苄唑在上述色谱条件下峰形良好，分别考察6份不同来源的空白血浆，将空白血浆中干扰信号的峰面积与LLOQ中待测物和内标峰面积的进行比较，发现空白血浆中内源性物质和相应的代谢产物、降解产物均不干扰样品测定。
2、线性
按实施例1的步骤2中表4，配制一系列含有不同浓度的5种芳香化酶抑制剂、5型磷酸二酯酶抑制剂及其代谢产物的标准溶液，按实施例1的步骤3进行检测，以5种芳香化酶抑制剂、5型磷酸二酯酶抑制剂及其代谢产物成分在不同浓度下的色谱峰面积/内标的色谱峰面积的比值为纵坐标(Y轴)，其相应成分的不同浓度/内标的浓度的比值为横坐标(X轴)，用加权(W＝1/x2)最小二乘法进行回归运算，得到5种芳香化酶抑制剂、5型磷酸二酯酶抑制剂及其代谢产物成分的标准曲线的回归方程，结果如表6所示。5种芳香化酶抑制剂、5型磷酸二酯酶抑制剂及其代谢产物成分的线性范围、定量下限、回归方程及相关系数的结果如表6所示。
由表6可知，5种芳香化酶抑制剂、5型磷酸二酯酶抑制剂及其代谢产物成分具有良好的线性关系，相关系数(R2)均大于0.999。
表6五种组分的线性范围、定量下限、回归方程及相关系数
Figure BDA0002976232950000111
3、精密度和准确度
取上述实施例2中表5制备的每一浓度的质控溶液，每个浓度各制备6份，按实施例1的步骤3进行检测，连续测定3天，计算批内和批间精密度和准确度。批内和批间精密度应小于15％(其中LLOQ应小于20％)，批内和批间准确度应在85-115％之间(其中LLOQ应在80-120％之间)，具体结果如表7所示。
由表7可知，质控溶液样品中各芳香化酶抑制剂、5型磷酸二酯酶抑制剂及其代谢产物成分的各测试浓度的准确度均在85-115％的区间内，质控溶液样品中各芳香化酶抑制剂、5型磷酸二酯酶抑制剂及其代谢产物成分的各测试浓度的批内和批间精密度绝对值均小于15％。由此证明本发明方法对血浆中5种芳香化酶抑制剂、5型磷酸二酯酶抑制剂及其代谢产物成分的检测具有良好的精密度和准确度。
表7质控溶液样品的批内和批间检测精密度和准确度
Figure BDA0002976232950000121
4、基质效应和回收率
取6份不同来源的人空白血浆样品，按实施例1的步骤1进行处理，其中，蛋白沉淀剂不添加联苯苄唑的甲醇水溶液，处理获得血浆的空白基质。取空白基质90μL，加入10μL某一浓度梯度的混合质控溶液，按上述实施例2配制已知低、高浓度上述5种芳香化酶抑制剂、5型磷酸二酯酶抑制剂及其代谢产物成分的质控溶液各6份，按实施例1的步骤3进行LC-MS/MS检测。其中，所得成分峰面积与相应标准溶液(用水代替空白血浆)峰面积百分比即为基质效应，结果见表8。
按上述实施例2配制已知低、中、高浓度上述5种芳香化酶抑制剂、5型磷酸二酯酶抑制剂及其代谢产物成分的质控溶液各6份，按实施例1的步骤3进行LC-MS/MS检测，所得成分峰面积与相应采用空白基质配制的低、中、高质控浓度样品所得峰面积百分比即为回收率，结果见表8。
由表8可知，本发明中人血浆基质对上述5个药物及内标的影响程度基本一致，可忽略基质给样本测定带来的干扰效应，且各成分及内标的回收率也均较高。由此证明本发明的方法对人血浆中上述5个成分的检测无明显基质效应及具有良好的回收率。
表8人血浆内基质效应和回收率试验(n＝6)
Figure BDA0002976232950000131
5、稳定性
考察不同条件下的血浆样品，不同条件包括血浆样品56℃加热30min、室温放置12h、-20℃～25℃3次冻融循环、-40℃冰箱放置60d以及血浆样品处理后进样盘放置12h。分别取低、中、高质控溶液，按实施例1的步骤1进行前处理，按实施例1的步骤3进行检测后，计算得到稳定性的RE％和RSD％(RE％应在85-115％之间，RSD％应小于15％)。结果如表9所示。
由表9可知，血浆样品中5种芳香化酶抑制剂、5型磷酸二酯酶抑制剂及其代谢产物成分在上述考察条件下检测得出的RE％均在85-115％之间，RSD％也均小于15％，可见，本发明方法对血浆中上述5种芳香化酶抑制剂、5型磷酸二酯酶抑制剂及其代谢产物成分的检测具有良好稳定性。
表9稳定性实验结果
Figure BDA0002976232950000141
Figure BDA0002976232950000151
Figure BDA0002976232950000161
以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明任何形式上和实质上的限制，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还将可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，当可利用以上所揭示的技术内容而做出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对上述实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。

Claims (7)

1.一种同时检测人血浆中芳香化酶抑制剂和5型磷酸二酯酶抑制剂药物浓度的方法，其特征在于，包括如下步骤：
A、样品预处理
将含有内标的蛋白沉淀剂加入至待检人血浆样品中，涡旋震荡、离心后取上清液；该含有内标的蛋白沉淀剂为联苯苄唑的甲醇水溶液与乙腈的混合溶液；
B、样品检测
步骤A中获得的样品溶液采用高效液相色谱质谱联用法进行测定，根据保留时间确定样品溶液中芳香化酶抑制剂、5型磷酸二酯酶抑制剂及其代谢产物；采用内标标准曲线法进行定量，确定样品溶液中芳香化酶抑制剂、5型磷酸二酯酶抑制剂及其代谢产物的浓度，
其中，所述芳香化酶抑制剂包括阿那曲唑和来曲唑；所述5型磷酸二酯酶抑制剂包括西地那非和他达拉非，所述5型磷酸二酯酶抑制剂的代谢产物为西地那非的活性代谢产物：N-去甲基西地那非，
高效液相色谱的检测条件如下：
色谱柱：Agilent ZORBAX SB-Aq柱，内径4.6×柱长150mm、粒径5μm；柱温：40-50℃；
进样量：5-15μL；流速：0.5-2.0mL/min；柱后2-4:6-8分流，2-4/10流入质谱分析；流动相A相为乙腈；流动相B相为9-11mmol/L乙酸铵水溶液并用甲酸调pH至3.1-3.3；分析时间为5min；
梯度洗脱的具体程序为：
0-0.3min，A相：B相体积比为40：60-80：20；
0.3-3.00min，A相：B相体积比为80：20-80：20；
3.00-3.01min，A相：B相体积比为80：20-100：0；
3.01-3.50min，A相：B相体积比为100：0-100：0；
3.50-3.51min，A相：B相体积比为100：0-40：60；
3.51-5.00min，A相：B相体积比为40：60-40：60，
质谱的检测条件如下：
电喷雾离子源，正离子检测模式，喷雾电压为5500V，雾化温度为550.0℃，雾化气为50units；辅助加热气为50units；气帘气为30units；碰撞气为10units；入口电压为10.0V；碰撞室出口电压为15.0V；监测方式为多反应监测模式进行一/二级质谱分析；
芳香化酶抑制剂、5型磷酸二酯酶抑制剂及其代谢产物和内标的母离子质荷比、定量子离子质荷比、定性子离子质荷比、去簇电压、碰撞电压见下表：
Figure FDA0003854003410000021
2.根据权利要求1所述的同时检测人血浆中芳香化酶抑制剂和5型磷酸二酯酶抑制剂药物浓度的方法，其特征在于：
其中，步骤A中，所述含有内标的蛋白沉淀剂的加入体积为人血浆样品的1～3倍；
样品预处理条件为：涡旋震荡2-4min后，3-5℃、10000-15000g/min条件下离心9-11分钟。
3.根据权利要求2所述的同时检测人血浆中芳香化酶抑制剂和5型磷酸二酯酶抑制剂药物浓度的方法，其特征在于：
其中，联苯苄唑的甲醇水溶液与乙腈的体积比为1:15-25；
所述联苯苄唑的甲醇水溶液中，联苯苄唑的浓度为0.20-0.30μg/mL，甲醇与水的体积比为1:0.95～1.05。
4.根据权利要求1所述的同时检测人血浆中芳香化酶抑制剂和5型磷酸二酯酶抑制剂药物浓度的方法，其特征在于：
其中，步骤B中，包括如下步骤：
B1、配制标准溶液：在空白血浆样品中加入不同浓度药物标准品溶液，获得的混合液加入步骤A所述的含有内标的蛋白沉淀剂，并采用相同的条件沉淀空白血浆样品中的蛋白，获得标准溶液；
B2、样品检测及分析：采用高效液相色谱质谱联用法分别检测样品溶液和标准溶液；将获得的样品溶液的液相色谱图与标准溶液的液相色谱图进行比较，根据相对保留时间指认出共有特征峰定性；再根据共有特征峰的色谱峰面积通过内标标准曲线法进行定量，确定样品溶液中芳香化酶抑制剂、5型磷酸二酯酶抑制剂及其代谢产物的浓度。
5.根据权利要求4所述的同时检测人血浆中芳香化酶抑制剂和5型磷酸二酯酶抑制剂药物浓度的方法，其特征在于：
其中，B1中，药物标准品溶液为阿那曲唑、来曲唑、西地那非、他达拉非以及N-去甲基西地那非的标准品储备液，该储备液采用的溶剂为甲醇；
配置的标准溶液中芳香化酶抑制剂、5型磷酸二酯酶抑制剂及其代谢产物的浓度范围为：阿那曲唑0.5-1000ng/mL；来曲唑1-1000ng/mL；西地那非5-1000ng/mL；N-去甲基西地那非1-1000ng/mL；他达拉非2-1000ng/mL。
6.根据权利要求4所述的同时检测人血浆中芳香化酶抑制剂和5型磷酸二酯酶抑制剂药物浓度的方法，其特征在于：
其中，B2中，所述内标标准曲线法包括以下步骤：
1)将含有一系列不同浓度的芳香化酶抑制剂、5型磷酸二酯酶抑制剂及其代谢产物的标准溶液，分别进行高效液相色谱质谱联用法分析后，对上述物质及内标的特征性二级碎片离子进行提取，获得芳香化酶抑制剂、5型磷酸二酯酶抑制剂及其代谢产物成分在不同浓度下与内标的色谱峰面积比值以及浓度比值；然后根据两个比值间的线性关系，绘制相应的标准曲线，用加权最小二乘法进行回归运算，得到芳香化酶抑制剂、5型磷酸二酯酶抑制剂及其代谢产物成分的标准曲线的回归方程；
2)样品溶液进行高效液相色谱质谱联用法分析后，将获得的各种芳香化酶抑制剂、5型磷酸二酯酶抑制剂及其代谢产物成分与内标的色谱峰面积比，代入上步骤中相应成分的标准工作曲线的回归方程，并根据内标的已知浓度，计算得到样品溶液中相应芳香化酶抑制剂、5型磷酸二酯酶抑制剂及其代谢产物成分的浓度。
7.根据权利要求6所述的同时检测人血浆中芳香化酶抑制剂和5型磷酸二酯酶抑制剂药物浓度的方法，其特征在于：
其中，所述标准曲线绘制时，以芳香化酶抑制剂、5型磷酸二酯酶抑制剂及其代谢产物成分在不同浓度下的色谱峰面积与内标的色谱峰面积的比值为纵坐标，其相应成分的不同浓度与内标浓度的比值为横坐标。
CN202110274933.XA 2021-03-15 2021-03-15 一种同时检测人血浆中芳香化酶抑制剂和5型磷酸二酯酶抑制剂及其代谢产物浓度的方法 Active CN113155992B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110274933.XA CN113155992B (zh) 2021-03-15 2021-03-15 一种同时检测人血浆中芳香化酶抑制剂和5型磷酸二酯酶抑制剂及其代谢产物浓度的方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110274933.XA CN113155992B (zh) 2021-03-15 2021-03-15 一种同时检测人血浆中芳香化酶抑制剂和5型磷酸二酯酶抑制剂及其代谢产物浓度的方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN113155992A CN113155992A (zh) 2021-07-23
CN113155992B true CN113155992B (zh) 2022-11-29

Family

ID=76887374

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202110274933.XA Active CN113155992B (zh) 2021-03-15 2021-03-15 一种同时检测人血浆中芳香化酶抑制剂和5型磷酸二酯酶抑制剂及其代谢产物浓度的方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN113155992B (zh)

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113884607A (zh) * 2021-11-17 2022-01-04 南京西默思博检测技术有限公司 一种检测药物西地那非和n-去甲基西地那非的方法
CN114487230A (zh) * 2022-02-10 2022-05-13 上海观合医药科技有限公司 一种高效液相色谱-串联质谱检测人血浆中来曲唑的方法
CN115718160B (zh) * 2022-11-24 2023-07-28 健尔圣(珠海)医药科技有限公司 一种lc-ms/ms检测血浆中gmdtc及其代谢产物的方法
CN117665174B (zh) * 2024-02-01 2024-04-23 巴中市产品质量检验检测中心 一种检测pde5和ssri的方法及其应用

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112394124A (zh) * 2020-11-05 2021-02-23 广州白云山医药集团股份有限公司白云山制药总厂 一种血浆中西地那非、n-去甲基西地那非及n1,n4-去二甲基西地那非含量分析方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN113155992A (zh) 2021-07-23

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN113155992B (zh) 一种同时检测人血浆中芳香化酶抑制剂和5型磷酸二酯酶抑制剂及其代谢产物浓度的方法
CN106990185B (zh) 一种同时测定血浆中六种酪氨酸激酶抑制剂浓度的方法
Zhao et al. Development and comparison of HPLC-MS/MS and UPLC-MS/MS methods for determining eight coccidiostats in beef
Liu et al. Quantification of the major metabolites of bromhexine in human plasma using RRLC–MS/MS and its application to pharmacokinetics
CN114166987A (zh) 一种同时测定人血浆中十二种酪氨酸激酶抑制剂浓度的方法
CN111579685A (zh) 一种检测血浆中抗凝血药物的试剂盒及其应用
CN113917049A (zh) 临床研究血浆样本中氯丙嗪及代谢物浓度的生物分析方法
CN114460188A (zh) 检测人血浆儿茶酚胺中间代谢物的试剂盒及测试方法
CN111579679A (zh) 一种抗肿瘤药物检测试剂盒及其应用
CN109900841B (zh) 一种同时测定血浆中氨基糖苷类抗生素药物浓度的hplc-ms/ms方法
CN113917007A (zh) 检测人尿液儿茶酚胺及其中间代谢物的试剂盒及测试方法
CN111812217B (zh) 一种检测血浆中抗动脉粥样硬化药物浓度的方法
CN111579683A (zh) 超高效液相色谱串联质谱检测血浆中抗动脉粥样硬化药物的试剂盒
Zanfini et al. Quantification of psychosine in the serum of twitcher mouse by LC–ESI-tandem-MS analysis
CN114720580A (zh) 一种生物样品中西格列汀和二甲双胍的检测方法
WO2023123309A1 (zh) 一种注射用丁二磺酸腺苷蛋氨酸专用溶剂中氨基酸类杂质的检测方法
CN115932118A (zh) 一种利用维生素c提升儿茶酚胺质谱定量检测灵敏度的方法
CN114994213A (zh) 一种测定人血浆中抗肿瘤药物酪氨酸激酶抑制血药浓度的试剂盒及测定方法
CN115166125A (zh) 一种采用超高效液相色谱-串联质谱快速测定人血浆中艾曲泊帕浓度的方法
CN112557568B (zh) 一种雌二醇和雌酮的检测方法
Zhao et al. Simultaneous analysis of twelve bile acids by UPLC-MS and exploration of the processing mechanism of bile arisaema by fermentation
CN114609265A (zh) 一种液相色谱串联质谱技术检测血清中八种甲状腺激素类标志物的方法
Xu et al. Quantitative analysis of cimetidine in human plasma using LC/APCI/SRM/MS
CN111413439A (zh) 一种快速亲水相互作用色谱-串联质谱法测定血浆中二甲双胍的方法
CN109187832B (zh) Lc-ms/ms测定去氧肾上腺素浓度的方法及样品的前处理方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
TA01 Transfer of patent application right
TA01 Transfer of patent application right

Effective date of registration: 20211119

Address after: Room 303, building 3, No. 4, Tongxin lane, Chengqiao Town, Chongming District, Shanghai 202150

Applicant after: Golden Olive Technology (Shanghai) Co.,Ltd.

Address before: 200438 room 318, building 10, No. 135, Guowei Road, Yangpu District, Shanghai

Applicant before: Shanghai Rongsheng Life Technology Co.,Ltd.

GR01 Patent grant
GR01 Patent grant