CN113917007A - 检测人尿液儿茶酚胺及其中间代谢物的试剂盒及测试方法 - Google Patents

检测人尿液儿茶酚胺及其中间代谢物的试剂盒及测试方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种检测人尿液儿茶酚胺及其中间代谢物的试剂盒，包含如下试剂：(1)校准品溶液：分为六种浓度的校准品，每种浓度的校准品中均含有六种儿茶酚胺及其代谢物：肾上腺素、去甲肾上腺素、多巴胺、甲氧基肾上腺素、甲氧基去甲肾上腺素、3‑甲氧基酪胺，校准品的浓度范围为1ng/mL～3000ng/mL；(2)质控品：包括质控品QCL，质控品QCM和质控品QCH；(3)内标液：包含6种儿茶酚胺及其代谢物的甲醇溶液混合液；(4)缓冲液I；(5)缓冲液II；(6)衍生液。通过衍生反应处理样品，解决了样品中儿茶酚胺及其中间代谢物容易降解的难题，样品衍生后室温状态稳定。

Description

检测人尿液儿茶酚胺及其中间代谢物的试剂盒及测试方法
技术领域
本发明涉及分析检测技术领域，具体地，涉及一种检测人尿液儿茶酚胺及其中间代谢物的试剂盒及测试方法。
背景技术
儿茶酚胺(Catecholamine，CA)又称邻苯二酚胺，主要包括肾上腺素(Epinephrine，简称E)、去甲肾上腺素(Norepinephrine，简称NE)和多巴胺(Dopamine，简称DA)。儿茶酚胺是由肾上腺髓质、肾上腺神经元以及肾上腺外嗜铬体合成与分泌的单胺类神经递质，是具有较强的生理学活性的内源性物质，在大脑和神经信号传导中起着重要的作用，不仅对人体的心血管系统、神经系统、内分泌系统、肾脏、平滑肌组织等的生理活动起着广泛的调节作用，还同时影响人体的代谢。NE、E和DA的中间代谢产物分别是甲氧基肾上腺素(Metanephrine，简称MN)、甲氧基去甲肾上腺素(Normetanephrine，简称NMN)和3-甲氧基酪胺(3-methoxytyramine，简称3-MT)。血液中儿茶酚胺及其中间代谢产物都由尿排出[1]。
尿液儿茶酚胺及其中间代谢物是正常生理过程中重要的信号介质，在24小时尿液中的含量变化与许多病理过程息息相关。肾上腺嗜铬细胞瘤和肾上腺外交感副神经节瘤(PPGLs)是嗜铬细胞引起的肿瘤，80-85％的病人起源于肾上腺髓质(约有5％的肾上腺素偶发瘤为嗜铭细胞瘤)，10-20％则起源于腹部、骨盆和胸等肾上腺外交感神经组织，通常会分泌大量儿茶酚胺类物质，并随着分泌物质的数量、种类和形式不同而表现为不同的临床症状。该病与副交感神经性头颈副神经节瘤(PGL)的不同在于后者分泌儿茶酚胺类物质并不活跃。PPGLs的发病率为每年100万人中仅2-5例，而高血压患者中的比例为0.1-0.6％，但尸检报告中检出率却有0.05％，说明仍可能有许多人未检出。由于PPGLs的漏诊易导致严重的心血管事件，因此，该病的早期诊断尤为重要。儿茶酚胺类物质的分泌是间断性的，而其代谢物则是连续分泌的。少数PPGLs患者仅产生多巴胺，主要存在于肾上腺外组织，可检测血浆或尿液中的多巴胺代谢物3-甲氧酪胺(3-MT)水平。对于MN和NMN结果高于上限3-4倍的患者几乎可确诊为PPGLs。
此外体外定量检测人24小时尿液中的儿茶酚胺及其中间代谢物，用作继发性和内分泌性高血压辅助诊断。尿液中儿茶酚胺类物质含量的增加会导致偶发性或持续性高血压，并经常导致心悸、心律失常、头痛、出汗、抑郁、焦虑、震颤和恶心的间歇性发作，同时会导致阻塞性睡眠呼吸暂停综合症。
儿茶酚胺及代谢产物的检测经历了多种方法,这些传统方法都有其固有的缺点：生物分析法、比色法，灵敏度较低；荧光法，易受其他内源性化合物干扰；放射酶法，操作繁琐；化学发光法，检测灵敏度不能满足临床检验需要；而液相色谱与电化学联用(LC-ECD)，虽然灵敏度和选择性高，但耗时较长，而且易受到多种物质干扰。随着现代质谱技术的快速发展，色谱串联质谱因其灵敏度高，特异度强，能进行大量样本的快速测试，目前已成为检测儿茶酚胺及其代谢产物的主要方法并被最新的指南和共识所推荐。现有基于LC-MS/MS技术开发用于尿液中儿茶酚胺及其中间代谢物的专利或者产品各有各的优点，但仍然具有如下一些缺点。1.低通量，检测目标物少，如专利CN 109959738只针对儿茶酚胺去甲肾上腺素(NE),多巴胺(DA),肾上腺素(E)，而没有选择儿茶酚胺的中间代谢物MN，NMN等比E,NE和DA更稳定的目标检测对象。MN，NMN其特异度和灵敏度高，因而被中华医学会内分泌分会推荐为诊断嗜铬细胞瘤和副神经节瘤的特异标志物；2.检测范围窄，如专利CN 111398448其检测肾上腺素的线性范围为0.5-50ng/mL，而变肾上腺素和去甲变肾上腺素的线性范围为1-100ng/mL；3.样品前处理复杂，制备成本高。如专利CN109709255提供的方法在样品准备过程中需要固相萃取和氮吹等这样必要的步骤，从而增加了样品前处理的时间和繁琐步骤。本专利提供的试剂盒及方法对人24小时尿液中儿茶酚胺的测量样品前处理极其简单而又具有检测范围宽、特异性强和灵敏度高等优点。
发明内容
针对现有技术中的缺陷，本发明的目的是提供一种检测人尿液儿茶酚胺及其中间代谢物的试剂盒及测试方法。
本发明的目的是通过以下方案实现的：
本发明的第一方面提供一种检测人尿液儿茶酚胺及其中间代谢物的试剂盒，包含如下试剂：
(1)校准品溶液：分为六种浓度的校准品，每种浓度的校准品中均含有六种儿茶酚胺及其代谢物：肾上腺素、去甲肾上腺素、多巴胺、甲氧基肾上腺素、甲氧基去甲肾上腺素、3-甲氧基酪胺，校准品的浓度范围为1ng/mL～3000ng/mL；
(2)质控品：包括质控品QCL，质控品QCM和质控品QCH；
(3)内标液：包含6种儿茶酚胺及其代谢物的甲醇溶液混合液，内标液中6种儿茶酚胺及其代谢物的浓度为，20ng/mL的去甲肾上腺素-D6·HCl、20ng/mL的甲氧基肾上腺素-D3·HCl和20ng/mL的3-甲氧基酪胺-D4·HCl，100ng/mL的肾上腺素-D6·HCl、100ng/mL的多巴胺-D4·HCl、50ng/mL的甲氧基去甲肾上腺素-D3·HCl；
(4)缓冲液I；
(5)缓冲液II；
(6)衍生液。
优选地，所述试剂盒还包括流动相A：0.1-0.5％甲酸水溶液；流动相B：80-90％甲醇水溶液或纯甲醇。
优选地，六种儿茶酚胺及其代谢物在六种校准品中的浓度分别为，校准品1中浓度均为1ng/mL；校准品2中浓度均为3ng/mL；校准品3中浓度均为12ng/mL；校准品4中浓度均为60ng/mL；校准品5中浓度均为400ng/mL；校准品6中浓度均为3000ng/mL。。
优选地，所述缓冲液I包括0.02M磷酸钠、0.2M氯化钠、3g/L氰基硼氢化钠，pH 7-9；所述缓冲液II为1M醋酸钠溶液，pH 5-7。
优选地，所述衍生液为80％的乙醛溶液。所述试剂盒中还包括进样器洗涤液和反应瓶，所述进样器洗涤液为50-80％甲醇水溶液。
优选地，所述质控品QCL的浓度为4ng/mL，质控品QCM的浓度为1250ng/mL，质控品QCH的浓度为2500ng/mL。
优选地，校准品溶液的制备方法如下：校准品溶液的制备方法如下：使用含1mg/mL抗坏血酸人工尿液，配制含3000ng/mL的肾上腺素、去甲肾上腺素、多巴胺、3-甲氧基酪胺、甲氧基肾上腺素和甲氧基去甲肾上腺素溶液，得到校准品6，后面使用含1mg/mL抗坏血酸人工尿液依次稀释得到400ng/mL的校准品5，60ng/mL的校准品4，12ng/mL的校准品3，3ng/mL校准品2以及1ng/mL的校准品1。
优选地，质控品的制备方法如下：用健康人尿液或人工合成尿液配制浓度为2500ng/mL肾上腺素、去甲肾上腺素、多巴胺、3-甲氧基酪胺、甲氧基肾上腺素和甲氧基去甲肾上腺素溶液为质控品QCH；将QCH用健康人尿液或人工合成尿液稀释得到1250ng/mL的质控品QCM；再将质控品QCM稀释得到4ng/mL的QCL。
优选地，内标液的配制方法如下：
使用15％的1M盐酸甲醇溶液稀释盐酸肾上腺素-D6、盐酸多巴胺-D4、盐酸甲氧基去甲肾上腺-D3、盐酸去甲肾上腺素-D6、盐酸甲氧基肾上腺素-D3和盐酸3-甲氧基酪胺-D4内标母液，然后混合得到内标液，其中6种儿茶酚胺及其代谢物的浓度为，20ng/mL的盐酸甲氧基肾上腺素-D3、20ng/mL盐酸3-甲氧基酪胺-D4、20ng/mL盐酸去甲肾上腺素-D6，50ng/mL盐酸甲氧基去甲肾上腺-D3，100ng/mL肾上腺素-D6和100ng/mL盐酸多巴胺-D4。
本发明的第二方面提供一种采用上述所述的试剂盒进行人尿液儿茶酚胺及其中间代谢物的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)处理试剂；
将试剂盒中六种浓度的校准品冻干粉、质控品QC冻干粉L、质控品QCM冻干粉和质控品QCH冻干粉中分别加入超纯水，室温静置待冻干材料溶解，轻轻涡旋振荡并倒置校准品瓶、质控品瓶，直到混匀；
(2)衍生反应；
将待测样本溶液、校准品溶液、质控品分别加入对应的进样瓶中；然后在每个进样瓶中加入内标溶液，涡旋震荡混匀；最后加入缓冲液I、缓冲液II和衍生液，涡旋震荡混匀，置于37-60℃温浴5-40分钟；
(3)超高效液相色谱分离；
流动相A为0.1-0.5％V/V甲酸水溶液，流动相B为80-90％甲醇水溶液；
采用梯度淋洗的方式进行分离；
(4)质谱检测
在电喷雾电离正电子检测模式下，采用多重反应监测的质谱扫描模式，监测各个目标物的保留时间，MRM监测离子对、碰撞电压和射频聚焦的电压参数。
(5)建立校准曲线：以标准物的浓度为x轴，以标准品与内标物峰面积比为y轴，建立校准曲线，得到线性拟合方程；
(6)计算待测样本中儿茶酚胺及其中间代谢物的浓度：将待测样本与内标物峰面积的比值带入对应的线性拟合方程中，计算得到待测样本中儿茶酚胺及其中间代谢物的浓度。
优选地，步骤(3)中，分离流速及梯度如下：在0-2.7分钟内，流动相A和流动相B的体积比为65:35；在2.7-4.0分钟内，流动相A和流动相B的体积比由65:35匀速渐变至30:70；在4-5分钟内，流动相A和流动相B的体积比为30:70；在5-5.1分钟内，流动相A和流动相B的体积比由30:70匀速渐变至65:35；在5-6分钟内，流动相A和流动相B的体积比为65:35。。
与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：
1、通过衍生反应处理样品，解决了样品中儿茶酚胺及其中间代谢物容易降解的难题，样品衍生后室温状态稳定。通过对尿液样品中的儿茶酚胺及其中间代谢物衍生从而将分析物的氨基还原成乙基，有利于分析物离子化而提高了离子检测的灵敏度。使得肾上腺素和3-甲氧基酪胺最低定量限达到0.1ng/mL，甲氧基去甲肾上腺素最低定量限在0.2ng/mL。去甲肾上腺素、多巴胺和甲氧基肾上腺素最低定量限达到0.4ng/mL。
2、采用超高效液相色谱-串联质谱方法检测儿茶酚胺及其中间代谢物，该方法同时针对目标物的出峰时间和离子对进行检测。(1)特异性高，可以极大的避免交叉反应的干扰，从而提高准确度。(2)采用同位素内标法定量，可以极大的消除基质效应，能够达到准确定量。(3)超高效液相色谱-串联质谱可以直接检测儿茶酚胺及其中间代谢物，测试结果可比性强。(4)高通量，可同时检测儿茶酚胺及其中间代谢物共6种物质。(5)样品制备简单快速。
3、校准品和质控品采用冻干工艺制成干粉，有利保证保存有效期内校准品和质控品性能稳定，保证结果准确性。
附图说明
通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：
图1为肾上腺素和去甲肾上腺素的校准品与内标的离子流色谱图；
图2为多巴胺和3-甲氧基酪胺校准品与内标的离子流色谱图；
图3为甲氧基肾上腺素和甲氧基去甲肾上腺素校准品与内标的离子流色谱图；
图4为肾上腺素的校准曲线；
图5为去甲肾上腺素的校准曲线；
图6为多巴胺的校准曲线；
图7为甲氧基肾上腺素的校准曲线；
图8为甲氧基去甲肾上腺素的校准曲线；
图9为3-甲氧基酪胺的校准曲线；
图10为衍生后和未衍生的去甲肾上腺素的离子流色谱图；
图11为衍生后和未衍生的肾上腺素的离子流色谱图；
图12为衍生后和未衍生的多巴胺的离子流色谱图；
图13为衍生后和未衍生的3-甲氧基酪胺的离子流色谱图；
图14为衍生后和未衍生的甲氧基肾上腺素的离子流色谱图；
图15为衍生后和未衍生的甲氧基去甲肾上腺素的离子流色谱图；
图16为校准品和质控品冻干品生产工艺流程图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变化和改进。这些都属于本发明的保护范围。
实施例
一种超高效液相色谱串联质谱检测人尿液儿茶酚胺及其中间代谢物的试剂盒，包含如下试剂(以96份测试样为例)：
(1)流动相A：180mL 0.1％甲酸水溶液
(2)流动相B：160mL 85％甲醇水溶液；
(3)校准品溶液：6瓶，分别为6种浓度的100μL校准品溶液。使用含1mg/mL抗坏血酸人工尿液配制的校准品1(6种儿茶酚胺及其中间代谢物即肾上腺素，去甲肾上腺素，多巴胺，甲氧基肾上腺素，甲氧基去甲肾上腺素，3-甲氧基酪胺浓度均为1ng/mL)，校准品2(6种儿茶酚胺及其代谢物浓度为3ng/mL)，校准品3(6种儿茶酚胺及其代谢物浓度为12ng/mL)，校准品4(6种儿茶酚胺及其代谢物浓度为60ng/mL)，校准品5(6种儿茶酚胺及其代谢物浓度为400ng/mL)，校准品6(6种儿茶酚胺及其代谢物浓度为3000ng/mL)；在储存过程中，可以将校准品溶液冻干成冻干粉，使用时加0.1mL超纯水配置。
(4)质控品：3瓶，分别为100μL的质控品QCL(4ng/mL)，质控品QCM(1500ng/mL)和质控品QCH(2500ng/mL)冻干粉；均包含儿茶酚胺及其代谢物基质溶液冻干粉。
(5)内标液：1瓶，包含6种儿茶酚胺及其代谢物的甲醇溶液混合液，内标液中6种儿茶酚胺及其代谢物的浓度为，20ng/mL的NE-D6·HCl、20ng/mL的MN-D3·HCl和20ng/mL的3-MT-D4·HCl，100ng/mL的E-D6、100ng/mL的DA-D4·HCl、50ng/mL的NMN-D3·HCl。
(6)缓冲液I：1瓶，包括0.02M磷酸钠、0.2M氯化钠、3g/L氰基硼氢化钠，pH 7；
(7)缓冲液II：1瓶，包括1M醋酸钠溶液(pH 6)；
(8)衍生液：1瓶，80％的乙醛溶液(加20％的水到纯乙醛得到80％的乙醛溶液)，
(9)进样器洗涤液：1瓶，为50％甲醇水溶液
(10)反应瓶：1包，为体积300μL棕色进样瓶。
校准品溶液的制备方法如下：使用含1mg/mL抗坏血酸人工尿液，配制含3000ng/mL的肾上腺素、去甲肾上腺素、多巴胺、甲氧基酪胺、甲氧基肾上腺素和甲氧基去甲肾上腺素溶液，得到校准品6，后面使用含1mg/mL抗坏血酸人工尿液依次稀释得到400ng/mL的校准品5，60ng/mL的校准品4，12ng/mL的校准品3，3ng/mL校准品2以及1ng/mL的校准品1。
质控品的制备方法如下：用人尿液配制浓度为2500ng/mL肾上腺素、去甲肾上腺素、多巴胺、甲氧基酪胺、甲氧基肾上腺素和甲氧基去甲肾上腺素溶液为质控品QCH。将QCH用人尿液稀释得到1250ng/mL的质控品QCM。再将质控品QCM稀释得到4ng/mL的QCL。
内标液的配制方法如下：使用15％的1M盐酸甲醇溶液稀释盐酸肾上腺素-D6、盐酸多巴胺-D4、盐酸甲氧基去甲肾上腺-D3、盐酸去甲肾上腺素-D6、盐酸甲氧基肾上腺素-D3、和盐酸3-甲氧基酪胺-D4内标母液，然后混合得到内标液，其中6种儿茶酚胺及其代谢物的浓度为，20ng/mL的盐酸甲氧基肾上腺素-D3、20ng/mL盐酸3-甲氧基酪胺-D4、20ng/mL盐酸去甲肾上腺素-D6，50ng/mL盐酸甲氧基去甲肾上腺-D3，100ng/mL肾上腺素-D6和100ng/mL盐酸多巴胺-D4。
采用上述试剂盒进行人尿液儿茶酚胺及其中间代谢物的检测方法，包括如下步骤：
(1)从冰箱中取出试剂盒中所有的试剂，开始处理试剂；
将试剂盒中六种浓度的校准品冻干粉、质控品QCL、质控品QCM和质控品QCH冻干粉中分别用容量吸管或精密吸管添加0.1mL超纯水，室温静置10min，待冻干材料溶解，轻轻涡旋振荡并倒置校准品瓶、质控品瓶，直到混匀；校准品和质控品冻干品生产工艺如图16所示。
(2)衍生反应；
将8份人尿液各20μL样本溶液、20μL校准品溶液、20μL质控品溶液分别加入对应的300μL棕色进样瓶中；然后在每个进样瓶中加入20μL内标溶液，涡旋震荡混匀10秒；最后加入50μL缓冲液I、50μL缓冲液II和50μL衍生液，涡旋震荡10秒混匀，将300μL棕色进样瓶置于37℃温浴5分钟；
(3)超高效液相色谱分离；
超高效液相色谱条件：
流动相A为0.1％V/V甲酸水溶液，流动相B为85％甲醇溶液；
色谱柱型号：ResteckPFPP 3μm 150x 2.1mm
采用梯度淋洗的方式，流速及梯度见表1。
表1，高效液相色谱分离流速及梯度
时间(分钟) 流速(mL/min) A％ B％
0 0.4 65 35
2.7 0.4 65 35
4 0.4 30 70
5 0.4 30 70
5.1 0.4 65 35
6 0.4 65 35
(4)质谱检测
质谱条件：在电喷雾电离正电子检测模式下，采用多重反应监测(MRM)的质谱扫描模式，监测各个目标物的保留时间，MRM监测离子对、碰撞电压和射频聚焦的电压参数。参数条件是：喷雾电压为1500V，碰撞气为1.5mTorr，离子源温度为325℃，离子转移管的温度为400℃，鞘气60Arb，辅助气3Arb，反吹气0Arb。
表2、各个目标物的保留时间，MRM检测离子对、碰撞电压和射频聚焦的电压参数*
Figure BDA0003252751280000081
Figure BDA0003252751280000091
*除MRM监测离子对(m/z)是固定的以外，保留时间(min)、碰撞能(V)和射频聚焦电压(V)根据选用的色谱柱和不同的质谱仪需要优化调整。
(5)建立校准曲线：采用同位素内标定量法，以标准物的浓度为x轴，以标准物与内标物峰面积比为y轴，建立校准曲线。儿茶酚胺及其中间代谢物(图4至图9)在各自浓度范围内的线性拟合方程线性良好，相关系数在0.99以上。
(6)计算待测样本中儿茶酚胺及其中间代谢物的浓度：将待测样本与内标物峰面积的比值带入对应的线性拟合方程中，计算得到待测样本中儿茶酚胺及其中间代谢物的浓度。
采用本试剂盒方法测定8个健康人尿液样品，得到6种儿茶酚胺及其代谢物测量结果如表3所示。
表3：8个人尿液样品儿茶酚胺及其中间代谢物测量值(ng/mL)
人尿液 3-MT DA E MN NE NMN
样品1 29.08 195.40 5.19 9.74 17.68 13.74
样品2 34.78 174.93 5.98 23.48 51.32 51.33
样品3 24.01 91.04 3.90 5.83 10.17 13.77
样品4 15.41 30.43 3.81 5.38 18.34 13.18
样品5 44.26 732.87 4.49 15.68 78.43 45.75
样品6 13.45 99.25 3.78 4.29 3.46 4.13
样品7 49.77 847.16 5.92 38.83 13.28 21.21
样品8 27.61 556.46 5.15 14.48 33.79 18.41
测定的8份健康人尿液中的6种儿茶酚胺及其代谢物的值都在临床范围内。
试剂盒的测试性能结果：
1、离子流色谱图：
Thermo Vanquish HPLC串联上海睿康生物RZ-500质谱仪。超高效液相色谱条件：流动相A为0.1％V/V甲酸水溶液，流动相B为85％甲醇溶液；色谱柱型号：Resteck PFPP3μm150x 2.1mm。质谱条件：在电喷雾电离正电子检测模式下，采用多重反应监测(MRM)的质谱扫描模式，监测各个目标物的保留时间，MRM监测离子对、碰撞电压和射频聚焦的电压参数。参数条件是：喷雾电压为1500V，碰撞气为1.5mTorr，离子源温度为325℃，离子转移管的温度为400℃,鞘气60Arb，辅助气3Arb，反吹气0Arb。
儿茶酚胺及其中间代谢物的标准品和尿液的峰型比较对称，没有杂峰干扰，说明在此条件下能够得到很好的检测。图1至图3为儿茶酚胺及其中间代谢物的校准品及其内标的离子流色谱图。
2、最低定量限
使用上海睿康生物科技有限公司超高效液相色谱串联质谱检测系统(RZ-500)时，试剂盒最低定量限为肾上腺素在0.1ng/mL，去甲肾上腺素在0.4ng/mL，多巴胺在0.4ng/mL，甲氧基肾上腺素在0.4ng/mL、甲氧基去甲肾上腺素在0.2ng/mL和3-甲氧基酪在0.1ng/mL时，质谱检测器信噪比(S/N)大于10。最低定量限说明本试剂盒的检测灵敏度高。
3、精密度试验：
用高浓度质控品QCH和低浓度质控品QCL测试试剂盒，重复测试10次(n＝10)，分别计算测量值的平均值
Figure BDA0003252751280000103
和标准差(S)。按公式(1)(2)计算变异系数(CV)，所得结果应符合临床化学体外诊断试剂(盒)国家标准(GB/T 26124—2011)的要求。
Figure BDA0003252751280000101
其中CV：变异系数；S：标准差；
Figure BDA0003252751280000102
测量值的平均值；n:测量次数。得到本试剂盒的重复性和批间紧密度如下：
重复性：CV≤15％；批间精密度：相对极差(R)≤20％。
4、准确度
选择肾上腺素，去甲肾上腺素，多巴胺，甲氧基肾上腺素、甲氧基去甲肾上腺素和3-甲氧基酪胺本底值为零的人工合成尿液为基础样本，在基础样中加入一定量体积的上海睿质科技有限公司公司儿茶酚胺及其代谢物一级校准品6(J6)(校准品体积与人工尿液体积比为1:9，以避免产生基质变化，加入校准品后样品总浓度必须在试剂检测范围内)，每个浓度样本重复检测3次，每次测试结果按公式(3)计算回收率。
Figure BDA0003252751280000111
R：回收率
V：加入标准溶液的体积
V0：加入合成尿液的体积
C：合成尿液与标准溶液混合后测定浓度
C1：标准溶液的浓度
C0：合成尿液的浓度
用回收率(％)表示测定结果的准确度，回收率在85％-115％范围内。
本发明利用衍生的方法使用乙醛在衍生缓冲液乙酸钠和氰基硼氢化钠中将人尿液中的儿茶酚胺及其中间代谢物生成稳定的衍生物，然后通过超高效液相色谱进行衍生后样品分离，进入质谱检测。利用6个系列已知浓度的6种儿茶酚胺标准品和内标，建立校准曲线，从而计算人尿液中6种儿茶酚胺及其代谢物的浓度。该检测方法通过精准检测尿液中的儿茶酚胺及其代谢物的水平，对诊断来源于神经嵴的神经内分泌肿瘤如嗜铬细胞瘤、神经母细胞瘤和副神经节瘤等患者的诊断和鉴别诊断，以及疾病的发展过程、疗效和预后评估具有十分重要的意义，从而为患者提供个性化的诊断治疗信息。
对比例
与实施例不同的是，将标准品不进行衍生反应，其他操作步骤相同。比较衍生样品和非衍生样品两者在样品的起始浓度、样品准备的时间相同的情况下的信号强度。如图10至图15所示，儿茶酚胺及其中间代谢物，肾上腺素、去甲肾上腺素、多巴胺、甲氧基肾上腺素、甲氧基去甲肾上腺素和3-甲氧基酪胺的信号强度，通过NL值可以看出，衍生后的分析物离子强度都比未衍生的分析物离子强度高。
采用本发明的试剂盒及检测方法，不需要对分析样品进行固相萃取，简化了样品准备过程。虽然进行衍生反应，但反应试剂和反应条件简单，且衍生反应后样品可以直接进样分析，分析的灵敏度更高。
以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变化或修改，这并不影响本发明的实质内容。在不冲突的情况下，本申请的实施例和实施例中的特征可以任意相互组合。

Claims (10)

1.一种检测人尿液儿茶酚胺及其中间代谢物的试剂盒，其特征在于，包含如下试剂：
(1)校准品溶液：分为六种浓度的校准品，每种浓度的校准品中均含有六种儿茶酚胺及其代谢物：肾上腺素、去甲肾上腺素、多巴胺、甲氧基肾上腺素、甲氧基去甲肾上腺素、3-甲氧基酪胺，校准品的浓度范围为1ng/mL～3000ng/mL；
(2)质控品：包括质控品QCL，质控品QCM和质控品QCH；
(3)内标液：包含6种儿茶酚胺及其代谢物的甲醇溶液混合液，内标液中6种儿茶酚胺及其代谢物的浓度为，20ng/mL的去甲肾上腺素-D6·HCl、20ng/mL的甲氧基肾上腺素-D3·HCl和20ng/mL的3-甲氧基酪胺-D4·HCl，100ng/mL的肾上腺素-D6·HCl、100ng/mL的多巴胺-D4·HCl、50ng/mL的甲氧基去甲肾上腺素-D3·HCl；
(4)缓冲液I；
(5)缓冲液II；
(6)衍生液。
2.根据权利要求1所述的检测人尿液儿茶酚胺及其中间代谢物的试剂盒，其特征在于，六种儿茶酚胺及其代谢物在六种校准品中的浓度分别为，校准品1中浓度均为1ng/mL；校准品2中浓度均为3ng/mL；校准品3中浓度均为12ng/mL；校准品4中浓度均为60ng/mL；校准品5中浓度均为400ng/mL；校准品6中浓度均为3000ng/mL。
3.根据权利要求1所述的检测人尿液儿茶酚胺及其中间代谢物的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括流动相A：0.1-0.5％甲酸水溶液；流动相B：80-90％甲醇水溶液或纯甲醇。
4.根据权利要求1所述的检测人尿液儿茶酚胺及其中间代谢物的试剂盒，其特征在于，所述缓冲液I包括0.02M磷酸钠、0.2M氯化钠、3g/L氰基硼氢化钠，pH 7-9；所述缓冲液II为1M醋酸钠溶液，pH 5-7。
5.根据权利要求1所述的检测人尿液儿茶酚胺及其中间代谢物的试剂盒，其特征在于，所述衍生液为80％的乙醛溶液。
6.根据权利要求1所述的检测人尿液儿茶酚胺及其中间代谢物的试剂盒，其特征在于，所述质控品QCL的浓度为4ng/mL，质控品QCM的浓度为1250ng/mL，质控品QCH的浓度为2500ng/mL。
7.根据权利要求1或2所述的检测人尿液儿茶酚胺及其中间代谢物的试剂盒，其特征在于，校准品溶液的制备方法如下：使用含1mg/mL抗坏血酸人工尿液，配制含3000ng/mL的肾上腺素、去甲肾上腺素、多巴胺、3-甲氧基酪胺、甲氧基肾上腺素和甲氧基去甲肾上腺素溶液，得到校准品6，后面使用含1mg/mL抗坏血酸人工尿液依次稀释得到400ng/mL的校准品5，60ng/mL的校准品4，12ng/mL的校准品3，3ng/mL校准品2以及1ng/mL的校准品1。
8.根据权利要求1所述的检测人尿液儿茶酚胺及其中间代谢物的试剂盒，其特征在于，质控品的制备方法如下：用健康人尿液或人工合成尿液配制浓度为2500ng/mL肾上腺素、去甲肾上腺素、多巴胺、3-甲氧基酪胺、甲氧基肾上腺素和甲氧基去甲肾上腺素溶液为质控品QCH；将QCH用健康人尿液或人工合成尿液稀释得到1250ng/mL的质控品QCM；再将质控品QCM稀释得到4ng/mL的QCL。
9.根据权利要求1所述的检测人尿液儿茶酚胺及其中间代谢物的试剂盒，其特征在于，内标液的配制方法如下：
使用15％的1M盐酸甲醇溶液稀释盐酸肾上腺素-D6、盐酸多巴胺-D4、盐酸甲氧基去甲肾上腺-D3、盐酸去甲肾上腺素-D6、盐酸甲氧基肾上腺素-D3和盐酸3-甲氧基酪胺-D4内标母液，然后混合得到内标液，其中6种儿茶酚胺及其代谢物的浓度为，20ng/mL的盐酸甲氧基肾上腺素-D3、20ng/mL盐酸3-甲氧基酪胺-D4、20ng/mL盐酸去甲肾上腺素-D6，50ng/mL盐酸甲氧基去甲肾上腺-D3，100ng/mL肾上腺素-D6和100ng/mL盐酸多巴胺-D4。
10.一种采用权利要求1至9任一项所述的试剂盒进行人尿液儿茶酚胺及其中间代谢物的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)处理试剂；
将试剂盒中六种浓度的校准品冻干粉、质控品QCL冻干粉、质控品QCM冻干粉和质控品QCH冻干粉中分别加入超纯水，室温静置待冻干材料溶解，轻轻涡旋振荡并倒置校准品瓶、质控品瓶，直到混匀；
(2)衍生反应；
将待测样本溶液、校准品溶液、质控品分别加入对应的进样瓶中；然后在每个进样瓶中加入内标溶液，涡旋震荡混匀；最后加入缓冲液I、缓冲液II和衍生液，涡旋震荡混匀，置于37-60℃温浴5-40分钟；
(3)超高效液相色谱分离；
流动相A为0.1-0.5％V/V甲酸水溶液，流动相B为80-90％甲醇水溶液；
采用梯度淋洗的方式进行分离；
(4)质谱检测
在电喷雾电离正电子检测模式下，采用多重反应监测的质谱扫描模式，监测各个目标物的保留时间，MRM监测离子对、碰撞电压和射频聚焦的电压参数；
(5)建立校准曲线：以标准物的浓度为x轴，以标准品与内标物峰面积比为y轴，建立校准曲线，得到线性拟合方程；
(6)计算待测样本中儿茶酚胺及其中间代谢物的浓度：将待测样本与内标物峰面积的比值带入对应的线性拟合方程中，计算得到待测样本中儿茶酚胺及其中间代谢物的浓度。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114935620A (zh) * 2022-05-20 2022-08-23 上海市精神卫生中心（上海市心理咨询培训中心） 一种同时定量检测78种神经精神类药物的试剂盒
CN114965756A (zh) * 2022-05-13 2022-08-30 康谱维(武汉)医疗科技有限公司 神经递质类物质检测方法

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108693294A (zh) * 2018-05-22 2018-10-23 复旦大学 基于n-乙基化法的多种氨基代谢物同步定量分析方法

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108693294A (zh) * 2018-05-22 2018-10-23 复旦大学 基于n-乙基化法的多种氨基代谢物同步定量分析方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ANDREW G. ELLIS ET AL.: "Dilute, derivatise and shoot: Measurement of urinary free metanephrines and catecholamines as ethyl derivatives by LC-MSMS" *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114965756A (zh) * 2022-05-13 2022-08-30 康谱维(武汉)医疗科技有限公司 神经递质类物质检测方法
CN114935620A (zh) * 2022-05-20 2022-08-23 上海市精神卫生中心（上海市心理咨询培训中心） 一种同时定量检测78种神经精神类药物的试剂盒

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