CN112162049B

CN112162049B - 一种非诊断目的检测尿液中肌氨酸的方法

Info

Publication number: CN112162049B
Application number: CN202011087393.6A
Authority: CN
Inventors: 刘翼飞; 刘晓红; 何心友; 韩婧; 张梦娜
Original assignee: Hefei Peijia Medical Laboratory Co ltd
Current assignee: Hefei Peijia Medical Laboratory Co ltd
Priority date: 2020-10-13
Filing date: 2020-10-13
Publication date: 2022-12-02
Anticipated expiration: 2040-10-13
Also published as: CN112162049A

Abstract

本发明提供了一种非诊断目的检测尿液中肌氨酸的方法，采用本发明的方法检测尿液中肌氨酸具有较高的准确度，并且特异性强，重现性好，前处理过程无须衍生和氮吹，操作简单，一般实验室均可完成，可以进行大批量样本处理和检测。

Description

一种非诊断目的检测尿液中肌氨酸的方法

技术领域

本发明涉及尿液检测技术领域，特别涉及一种非诊断目的高效液相色谱串联质谱检测尿液中肌氨酸的方法。

背景技术

前列腺癌是威胁男性健康的常见肿瘤之一，病死率仅次于肺癌，中国的前列腺癌发病率呈明显上升趋势，大部分患者以尿路症状或骨痛就诊，血清前列腺特异性抗原(prostate antigen,PSA)检测在临床上广泛应用于前列腺癌的早期筛查和诊断。临床上需要对PSA异常患者进行穿刺活检去的组织病理学诊断后方可确诊。PSA是前列腺特异性抗原非前列腺癌特异性抗原，诊断结果存在灰区。PSA在诊断前列腺癌灰区的含量为4-10ng/mL,在此区间不能准去的区分前列腺癌增生、前列腺炎和早期前列腺癌。在中国，PSA含量4-10ng/mL范围内穿刺活检前列腺癌阳性率不足20％，且确诊需活检数次，对于患者来说这一过程非常痛苦。此外，活检穿刺可能会增加肿瘤转移风险增加感染等并发症的发生。

肌氨酸是一种存在于人体肌肉和其他组织的天然氨基酸，为甘氨酸的代谢产物，前列腺癌患者的尿液中肌氨酸水平显著高于健康人群，可作为前列腺癌的新型、简便、无创的生物标志物，临床检测数值可用于评判患者前列腺癌患癌的可能性，且对早期前列腺癌的诊断准确性优于PSA。肌氨酸加成呢仅需采集患者清晨中段尿液，增加前列腺癌的检测准确率，减少血样采集及活检穿刺给患者带来的痛苦。

基于我国初诊前列腺癌分期偏晚，早期前列腺癌具有隐匿性的特点，且早期前列腺癌存在有效的治疗措施，以及国内外研究和文献报道的支持，在我国开展前列腺癌的检查具有重大的意义，可提高前列腺的治疗效果，改善预后等。

目前衍生化高效液相色谱法在临床肌氨酸的检测中应用较多，但存在操作繁琐、影响因素多、分析时间长等缺点，给实际工作带来了诸多不便。本专利采用液相色谱-质谱联用法对尿液中的肌氨酸进行检测，前处理无需衍生，省时省力的同时提高了检测结果的敏感性。

发明内容

本发明的目的是解决现有肌氨酸检测方法的缺陷，提供了一种非诊断目的非衍生化方法检测尿液中肌氨酸的方法。

一种非诊断目的检测尿液中肌氨酸的方法，包括如下步骤：(1)使用A1试剂和A2试剂对尿液样品中的肌氨酸进行释放；(2)使用液相色谱法对释放后的肌氨酸进行进一步分离；(3)使用质谱法分析释放的肌氨酸，从而对肌氨酸进行定性和/或定量检测。

色谱条件包括：色谱柱为C18柱，流动相A为甲酸水，流动相B为甲酸甲醇，梯度洗脱。

进一步地，色谱柱为Phenomenex Kinetex-C18，50×2.1mm，1.7μm；流动相A为0.1％的甲酸水，流动相B为0.1％的甲酸甲醇。

进一步地，色谱条件还包括：流速为0.3mL/min，柱温为40℃，进样体积为2μL。

进一步地，梯度洗脱程序见下表：

时间(min)	流速(ml/min)	A％	B％
				0	0.3	95	5
2	0.3	30	70
				3	0.3	30	70
3.1	0.3	95	5
				4.0	0.3	95	5

。

质谱条件包括：在电喷雾电离正离子检测模式下，采用多反应监测的质谱扫描模式；喷雾电压为5500V；气帘气为32psi；离子源气流GS1为55psi，GS2为55psi；离子源温度为500℃；同时监测目标物肌氨酸m/z 90.1→44.1；肌氨酸去簇电压为15V、碰撞电压6V。

所述的A1试剂由甲酸、甲醇按照一定的比例混合而成；所述的A2试剂由甲醇和肌氨酸氘代物按照一定的比例混合而成。

进一步地，A1试剂中，甲酸、甲醇按照1：1000体积比进行配比。

进一步地，A2试剂中，肌氨酸氘代物的浓度为5ng/mL。

进一步地，尿液样品、A1试剂和A2试剂的体积比为1:2:1。

其中，使用A1试剂和A2试剂对尿液样品中的肌氨酸进行释放，具体实施过程为：将尿液样品依次和A1试剂、A2试剂按照一定比例进行混合，室温涡旋一段时间后即对尿液样品中的肌氨酸进行释放。

进一步地，上述实施过程为：取尿液50μL于1.5ml离心管中，加100μL A1试剂后再加入50μL A2试剂，涡旋混合5min，12000r/min,4℃离心10min，取上清液用于检测。

进一步地，A2试剂按如下方法得到：精确称取10.0mg氘代同位素内标品于10mL容量瓶中，加入甲醇使其完全溶解，并用甲醇定容至容量瓶刻度，得到浓度为1.0mg/mL的同位素内标储备溶液，然后用甲醇将内标储备溶液稀释至5ng/mL。

定量步骤包括：利用内标法定量，以基质中标准品的浓度为Y轴，基质中标准品与氘代物内标的峰面积比为X轴，建立标准曲线，从而对肌氨酸进行定量检测；所述基质为0.5％牛血清白蛋白水溶液或尿液。

A1试剂的作用：根据肌氨酸的酸碱性质，甲醇中加入一定比例的甲酸，可使90％的肌氨酸以非电离形式存在而更易溶于有机溶剂中。

A2试剂的作用：利用肌氨酸和肌氨酸内标的峰面积比值来定量，减小或消除了基质效应，定量更准确。

本发明的有益效果：采用本发明的方法检测尿液中肌氨酸具有较高的准确度，并且特异性强，重现性好，前处理过程无须衍生和氮吹，操作简单，一般实验室均可完成，可以进行大批量样本处理和检测，而且节约分析成本，所需分析时间较短，检测样本易采集。

附图说明

构成本申请的一部分的说明附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定，其中：

图1肌氨酸在尿液样本中的总离子流色谱图；

图2肌氨酸在0.5％BSA中的校准曲线；

图3基质替代试验检测结果；

使用本发明中方法，对尿液中的肌氨酸进行检测，得到相应的高特异性的质谱峰图。

具体实施方式

根据下述实施例，可以更好的理解本发明。然而本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于本发明，而不应该也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明

实施例1

液相色谱串联质谱法测定人尿液中肌氨酸

取尿液50μL于1.5ml离心管中，加100μL A1试剂后再加入50μL A2试剂，涡旋混合5min，12000r/min，4℃离心10min，取上清150μl用于检测。检测即获得人尿液中肌氨酸的总离子流色谱图(图1)。

具体的色谱条件如下：(1)流动相A：体积比为0.1％的甲酸水；(2)流动相B：体积比为0.1％的甲酸甲醇，甲醇纯度为HPLC级；(3)色谱柱型号：Phenomenex Kinetex-C18，50×2.1mm，1.7μm；(4)流速为0.3mL/min，柱温为40℃，进样体积为2μL；(5)采用梯度洗脱的方式，见下表；

具体的质谱条件如下：在电喷雾电离正离子检测模式下，采用多反应监测的质谱扫描模式；喷雾电压为5500V；气帘气为32psi；离子源气流GS1为55psi，GS2为55psi；离子源温度为500℃；同时监测目标物肌氨酸m/z 90.1→44.1；肌氨酸去簇电压为15V、碰撞电压6V。

实施例2

A1试剂中各组分配比的探究

按照下表配制4种A1(配方1～4)，使用4种A1分别处理同一管人尿液(取4个1.5mLEp管，标记为管1～4，每管加入50μL人尿液，之后管1～4对应加入100μL配方1～4的A1试剂)，之后每管加入50μLA2试剂，涡旋混合5min，12000r/min，4℃离心10min，取上清液进样2μL，比较质谱检测的直接峰面积大小。其中配方1的质谱峰面积为497016，配方2的质谱峰面积为543303，配方3的质谱峰面积为637558，配方4的质谱峰面积为437980。由此可见，配方3的质谱峰面积最大，即甲酸、甲醇提取液体积比为1:1000时可以最大程度地释放尿液中的肌氨酸，利于肌氨酸的定量检测。为此配方3为优化的甲酸、甲醇的配比。

实施例3

A2试剂中各组分配比的探究

按照下表配制3种A2(配方1～3)，取3个1.5mL Ep管，标记为管1～3，每管加入50μL人尿液以及100μL的A1试剂，之后管1～4对应加入50μL配方1～3的A2试剂，涡旋混合5min，12000r/min,4℃离心10min，取上清液进样2μL，比较质谱检测的直接峰面积大小。其中配方1的质谱峰面积为627717，配方2的质谱峰面积为618929，配方3的质谱峰面积为863291，配方4的质谱峰面积为848653。由此可见，配方3和配方4的质谱峰面积明显大于配方1和配方2，即使用纯甲醇时可以最大程度地释放尿液中的肌氨酸，利于肌氨酸的定量检测；配方3和配方4的质谱峰面积为同一数量级，数值上基本没有差异。为此甲醇可以在配方3的基础上，加入肌氨酸氘代物，形成配方A2。

实施例4

尿液与A1试剂和A2试剂配比的优化

取3个1.5mL Ep管，标记为管1～3，管1～3对应按照下表中的配比1～3分别加入人尿液、A1和A2试剂，涡旋混合5min，12000r/min,4℃离心10min，取上清液进样2μL，比较质谱检测的直接峰面积大小。其中配比1的质谱峰面积为818808，配比2的质谱峰面积为679927，配比3的质谱峰面积为570286。由此可见，配方1的质谱峰面积最大，即人尿液、A1、A2体积比为1:2:1时可以最大程度地释放尿液中的肌氨酸，利于肌氨酸的定量检测。为此，配比1为优化人尿液、A1、A2体积。

实施例5

使用A1试剂和A2试剂对尿液的肌氨酸进行室温释放时间探究

取4个1.5mL Ep管，标记为管1～4，每管加入50μL人尿液、100μL的A1试剂以及50μL的A2试剂，之后管1涡旋混合1min，管2涡旋混合5min，管3涡旋混合10min，管4涡旋混合15min。涡旋混合后，依次对管1～4进行12000r/min，4℃离心10min，取上清液进样2μL，比较质谱检测的直接峰面积大小。其中管1的质谱峰面积为405610，管2的质谱峰面积为617503，管3的质谱峰面积为600266，管4的质谱峰面积为596196。由此可见，管2～4的峰面积明显高于管1，且管2～4的峰面积都处于同一数量级，数值相差不大。为此，考虑到检测效果以及检测时间上的高效性，选取管2对应的涡旋混合5min作为较优的室温释放时间。

方法学验证

1、总离子流图：图1为肌氨酸在尿液样本中的总离子流色谱图；可以看到，没有其他杂质干扰，说明在此条件下能够得到良好的检测；

2、基质替代：在相同的测量系统中分别用尿液基质和0.5％BSA基质配制标准曲线一系列不同浓度的样本，比较两种基质各样本的检测信号强度和线性的一致程度，图3为基质替代的检测结果，横坐标表示尿液中不同浓度肌氨酸检测结果，纵坐标表示0.5％BSA基质中不同浓度肌氨酸检测结果。

3、标准曲线：采用同位素内标法定量，利用分析软件以标准品的浓度为X轴，以标准品与内标的峰面积比值为Y轴，建立校准曲线，并计算出待测样本中肌氨酸的浓度，0.5％BSA中肌氨酸的在2～2000ng/mL呈现良好的线性关系(r>0.99)，肌氨酸的线性方程为：Y＝0.0015x+0.0128。

4、加标回收率和精密度：取肌氨酸标准工作液配制成高中低3种浓度进行加标回收率试验和精密度试验，按实施例1的方法进行测定，重复分析测定3批次，其回收率和精密度如下表。其中，低、中、高三个添加水平的平均回收率为98.56％-104.87％，相对标准偏差为3.05％-5.32％

加标量(ng/mL)	平均回收率(％)	精密度RSD(％)
			2	98.56	3.86
10	101.22	5.32
			50	104.87	3.05

。

5、定量限：将肌氨酸标准溶液不断稀释，以信噪比(S/N)≥10对应浓度确定为定量限，肌氨酸的定量限为50pg/mL。

Claims

1.一种非诊断目的检测尿液中肌氨酸的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)使用A1试剂和A2试剂对尿液样品中的肌氨酸进行释放；(2)使用液相色谱法对释放后的肌氨酸进行进一步分离；(3)使用质谱法分析释放的肌氨酸，从而对肌氨酸进行定性和定量检测；

色谱柱为Phenomenex Kinetex-C18，50×2.1mm，1.7μm；流动相A为0.1％的甲酸水，流动相B为0.1％的甲酸甲醇；

梯度洗脱程序如下表：

时间min 流速ml/min A％ B％ 0 0.3 95 5 2 0.3 30 70 3 0.3 30 70 3.1 0.3 95 5 4.0 0.3 95 5

所述A1试剂由甲酸、甲醇按照1:1000混合而成；所述A2试剂由甲醇和肌氨酸氘代物混合而成，肌氨酸氘代物的浓度为5ng/mL；尿液样品、A1试剂和A2试剂的体积比为1:2:1；

2.根据权利要求1的方法，其特征在于，色谱条件还包括：柱温为40℃，进样体积为2μL。

3.根据权利要求1的方法，其特征在于，使用A1试剂和A2试剂对尿液样品中的肌氨酸进行释放，具体实施过程为：取尿液50μL于1.5ml离心管中，加100μL A1试剂后再加入50μL A2试剂，涡旋混合5min，12000r/min，4℃离心10min，取上清液用于检测。

4.根据权利要求1的方法，其特征在于，利用内标法定量，以基质中标准品的浓度为Y轴，基质中标准品与氘代物内标的峰面积比为X轴，建立标准曲线，从而对肌氨酸进行定量检测；所述基质为0.5％牛血清白蛋白水溶液或尿液。