CN102680599A - 尿肌氨酸及肌酐测定试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及尿中肌氨酸和肌酐测定试剂盒,属医药检测技术领域。该试剂盒的组成包括:用于制备试剂盒标准曲线的、肌氨酸或肌酐含量稳定的对照品和质控品,肌氨酸-d350-100mg/L,肌酐-d3150-200mg/L内标溶液,乙腈沉淀剂,以及添加甲酸铵和甲酸作为改性剂的流动相。本发明以乙腈作为沉淀剂除去尿样中蛋白,添加改性剂,优化流动相洗脱方式,将肌氨酸和肌酐与样品中结构类似的其他干扰物质色谱分离,在特异性方面具有明显优势,肌氨酸和肌酐的色谱保留时间分别为2.6min和3.1min,以保留时间最短、且灵敏度高、准确性好、检测成本低、响应值最大,而满足临床和科研上对分析方法快速和高通量的要求。
Description
技术领域
本发明涉及医药检测技术领域,具体涉及尿中肌氨酸和肌酐测定试剂盒。
背景技术
通过检测生物样本中小分子或者大分子标志物是疾病筛查与诊断的有效手段,对于疾病的早期诊断、治疗和预后具有重要的参考价值和临床意义。肌氨酸(N-甲基甘氨酸, sarcosine)是一种存在于人体肌肉和其他组织的天然氨基酸,为甘氨酸的代谢产物。研究表明,肌氨酸在侵袭性前列腺癌中含量显著升高,且肌氨酸可在尿样中检测出来,这一发现使得肌氨酸成为前列腺癌非损伤性诊断的一个候选生物标记,也有可能成为更优的新型的前列腺癌进展标志物。尿中肌酐的排泄量较少受尿液浓缩和稀释的影响,故尿中肌酐浓度的测定常用作尿中其他物质排泄浓度的参照物。在本试剂盒中肌酐作为肌氨酸的参照物在同一份样品中同时测定,校正了样品中肌氨酸的浓度,降低了对临床样品的要求。目前对于肌氨酸和肌酐的检测,分别采用气相色谱-质谱法和化学法,它们的主要缺陷是特异性和灵敏度低,方法比较复杂。
液相色谱-同位素稀释质谱法,属于非损伤性检测方法,是近年来获得迅速发展的分析测试技术,在体内药物分析、临床生化和新生儿遗传性代谢疾病筛选等领域已有广泛应用。它具有高度特异性、灵敏度和准确性的特点,且成本低廉,简单、快速,已成为临床科研中检测量值的基准方法之一。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种操作简便、专一灵敏的尿中肌氨酸浓度的定量检测法及配套试剂盒,以满足开展大规模临床前列腺癌研究的需要。
本发明公开的尿肌氨酸和肌酐测定试剂盒的组成包括:
1)对照品:肌氨酸浓度分别为100-300μg/L、1000-3000μg /L、5000-8000μg /L和肌酐浓度分别为100-300mg/L、1000-3000mg/L、5000-8000mg/L的化学品;
2)质控品:肌氨酸浓度为800-1000μg /L 和肌酐浓度为800-1000mg/L的化学品;
3)内标溶液:肌氨酸-d3 50-100mg/L,肌酐-d3 150-200 mg/L的化学品;
4)沉淀剂:乙腈;
5)流动相A:含0.1 mmol/L甲酸铵和0.4%甲酸的20%乙腈水溶液;
6)流动相B:含0.02%甲酸和20%乙腈的水溶液。
采用所述试剂盒进行尿中肌氨酸和肌酐测定方法,其特征在于步骤为:
1)标准曲线的绘制:用对照品和內标的比值绘制标准曲线,用质控品和內标的比值确认标准曲线;
2)尿样采集:随机尿,3000rpm离心5min,取上清尿2 mL左右-20℃保存,临用前于室温下解冻;
3)样品稀释处理:尿样中以乙腈∶尿样体积比为2∶1的比例加入沉淀剂乙腈,除去尿样中蛋白,并稀释尿样至肌氨酸浓度为100-5000μg/L,肌酐浓度为100-5000mg/L;
4)色谱分离纯化: 以硅胶键合相填料为色谱柱,流动相A和流动相B采用等度或者梯度洗脱,将肌氨酸和肌酐从色谱柱上洗脱,与其他干扰物质色谱分离;
5)质谱检测:经液相色谱仪分离纯化的肌氨酸和肌酐,采用电喷雾离子化串联质谱仪,在正离子检测模式下,检测肌氨酸和肌酐;肌氨酸的母离子,其质量电荷比m/z为90±0.5;经过进一步质谱碎裂后同时检测肌氨酸的母离子和碎片离子,其质量电荷比m/z分别为90±0.5和44±0.5;肌酐的母离子,其质量电荷比m/z为114±0.5;经过进一步质谱碎裂后同时检测肌酐的母离子和碎片离子,其质量电荷比m/z分别为114±0.5和86±0.5;
6)结果计算:以肌氨酸和肌酐质谱检测获得的峰面积与內标峰面积的比值,代入标准曲线回归方程,根据公式y =a+bx计算即可得到肌氨酸或肌酐的浓度值。其中,Y为肌氨酸或肌酐与內标峰面积比值,x为肌氨酸或肌酐的浓度值。
所述步骤4)中: HYPERSIL silica,5μm, 2.1×100mm,Thermo,流动相B:含0.02%甲酸的 20%乙腈溶液,等度洗脱,流速:0.3mL/min,进样量:5μL。
将从肌酐色谱柱上洗脱的条件为:色谱柱:HYPERSIL silica,5um, 2.1×100mm,Thermo ,流动相A 为含 0.1 mmol/L甲酸铵和 0.4%甲酸的 20%乙腈溶液,流动相B为含 0.02%甲酸的 20%乙腈溶液,梯度洗脱,0~0.1 min、0.1~2 min、 2.1~6 min,流动相B占流动相总量的体积百分数分别为75%、0%、75%,流速:0.3mL/min,进样量:3μL。
所述步骤5)中肌氨酸质谱检测条件为:电喷雾离子源, 正离子扫描;MRM扫描,肌氨酸检测通道90.1>44.1,±0.5 m/z,肌氨酸-d3检测通道93.1>47.1 ,±0.5 m/z,离子化电压:5000V;离子化温度:550℃;喷雾气:60 psi;加热气:60 psi;气帘气:25 psi;碰撞气:中等;去簇电压(DP):21 V;入口电压(EP):4 V;碰撞能(CE):20 V;出口电压(CXP):6 V。
所述肌酐质谱检测条件为:电喷雾离子源,正离子扫描;MRM扫描,肌酐检测通道114.8>86.1,±0.5 m/z,肌酐-d3检测通道117.1>89.1 (±0.5 m/z) ,离子化电压:5000V;离子化温度:550℃;喷雾气:60 psi;加热气:60 psi;气帘气:25 psi;碰撞气:中等;去簇电压(DP):26 V;入口电压(EP):7 V;碰撞能(CE):18 V;出口电压(CXP):5 V。
本发明尿肌氨酸和肌酐测定试剂盒,配备了用于制备试剂盒标准曲线的、肌氨酸或肌酐含量稳定的对照品和质控品。以乙腈作为沉淀剂处理样品,用改性剂优化流动相,等度或者梯度洗脱法将肌氨酸和肌酐与样品中结构类似的其他干扰物质色谱分离,在特异性方面具有明显优势,以保留时间最短(肌氨酸和肌酐的色谱保留时间分别为2.6min和3.1min),且灵敏度高、准确性好、检测成本低,响应值最大而满足临床和科研上对分析方法快速和高通量的要求。
通过优化样品处理、流动相改性、正离子模式下以多反应监测(MRM)LC-MS测定,以同位素稀释内标法定量,尿样中肌氨酸的最低检测限(LOD)为20μg/L, 最低定量限(LLOQ)为100μg/L, 在100~8000μg/L浓度范围内,线性相关系数大于0.99,提取回收率的相对偏差均小于11%,准确度在87.8%~99.5%之间,批内、批间精密度均小于12%。肌酐的最低检测限(LOD)为5mg/L, 最低定量限(LLOQ)为100 mg/L, 在100~8000 mg/L浓度范围内,线性相关系数大于0.99,提取回收率的相对偏差均小于9%,准确度在87.8%~108%之间,批内、批间精密度均小于15%。
附图说明
图1空白尿样中肌氨酸的色谱图;
图2空白尿样中肌酐的色谱图;
图3肌氨酸浓度分别为100,1000,5000μg/L的标准曲线;
图4肌酐浓度分别为100,1000,5000mg/L的标准曲线;
图5肌氨酸浓度分别为300,3000,8000μg/L的标准曲线;
图6肌酐浓度分别为300,3000,8000mg/L的标准曲线。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明作进一步阐述, 但并不限制本发明。
实施例1
1、试剂盒的配制
(1)对照品:肌氨酸浓度分别为100μg/L,1000μg /L,5000μg /L和肌酐浓度分别为100mg/L,1000mg/L,5000mg/L的化学品;
(2)质控品:肌氨酸浓度为800μg /L 和肌酐浓度为800mg/L的化学品;
(3)内标溶液:肌氨酸-d3 50mg /L ,肌酐-d3 150mg/L的化学品;
(4)沉淀剂:乙腈;
(5)流动相A:含0.1 mmol/L甲酸铵和 0.4%甲酸,20%乙腈的水溶液
(6)流动相B:含0.02%甲酸和 20%乙腈水溶液。
2、尿样采集:随机尿,3000rpm离心5min,取上清尿2 mL左右-20℃保存,临用前于室温下解冻。
3、样品处理:取100 μL尿样,加入20 μL肌氨酸和肌酐的混合内标溶液,再加入200 μL 沉淀剂,混旋30s,15000 rpm离心3 min,弃沉淀,然后再吸取100 μL上清液与300 μL乙腈混合,转移至进样瓶,供LC-MS/MS分析。
4、肌氨酸色谱条件及质谱仪器参数:
色谱条件:
色谱柱:HYPERSIL silica,5μm,(2.1×100mm,Thermo), 柱温:室温,流动相B:含0.02%甲酸的 20%乙腈溶液,等度洗脱,流速:0.3mL/min,进样量:5μL。
质谱条件:
电喷雾离子源, 正离子扫描;MRM扫描,肌氨酸检测通道90.1>44.1 (±0.5 m/z),肌氨酸-d3检测通道93.1>47.1 (±0.5 m/z),离子化电压:5000V;离子化温度:550℃;喷雾气:60 psi;加热气:60 psi;气帘气:25 psi;碰撞气:中等;去簇电压(DP):21 V;入口电压(EP):4 V;碰撞能(CE):20 V;出口电压(CXP):6 V。
5、肌酐色谱条件及质谱仪器参数:
色谱条件
色谱柱:HYPERSIL silica,5um,(2.1×100mm,Thermo) ,柱温:室温,流动相A :含 0.1 mmol/L甲酸铵和 0.4%甲酸的 20%乙腈溶液,流动相B: 0.02%甲酸的 20%乙腈溶液,梯度洗脱,0~0.1 min、0.1~2 min、 2.1~6 min,流动相B占流动相总量的体积百分数分别为75%、0、75%,流速:0.3mL/min,进样量:3μL。
质谱条件
电喷雾离子源,正离子扫描;MRM扫描,肌酐检测通道114.8>86.1 (±0.5 m/z),肌酐-d3检测通道117.1>89.1 (±0.5 m/z) ,离子化电压:5000V;离子化温度:550℃;喷雾气:60 psi;加热气:60 psi;气帘气:25 psi;碰撞气:中等;去簇电压(DP):26 V;入口电压(EP):7 V;碰撞能(CE):18 V;出口电压(CXP):5 V。
6、结果计算:采用内标法,以峰面积计算样品中肌氨酸和肌酐浓度。
图1和图2分别为空白尿样中肌氨酸和肌酐的色谱图,在此条件下,肌氨酸和肌酐的保留时间为2.3和3.1min,图1、2还可以看出在尿中肌氨酸和肌酐与其他杂质峰能很好地分离。相应的峰面积和肌氨酸及肌酐含量计算结果列于表1。
表1 肌氨酸和肌酐代表性样品测定结果
样品 | 肌氨酸和肌酐峰面积 | 肌氨酸-d3和肌酐-d3峰面积 | 肌氨酸含量(μg /L)和肌酐含量(mg/L) |
空白尿样 | 1310/5090 | 149000/67600 | 111/228 |
中浓度对照品 | 102000/17900 | 1260000/52800 | 989/939 |
质控品 | 57600/15200 | 908000/46000 | 782/773 |
临床尿样 | 5100/9290 | 173000/33200 | 363/777 |
图3中肌氨酸浓度分别为100,1000,5000μg/L的标准曲线,以肌氨酸浓度为X轴,以肌氨酸与内标峰面积比值为Y轴,经过1/X权重处理,在浓度100 μg/L至5000 μg/L范围内,线性相关系数为0.9998;图4肌酐浓度分别为100,1000,5000mg/L的标准曲线,以肌酐的浓度为X轴,以肌酐与内标峰面积比值为Y轴,经过1/X权重处理,在浓度100 mg/L至5000 mg/L范围内,线性相关系数为0.9998。
实施例2
1、试剂盒的配制
(1)对照品:肌氨酸浓度分别为300μg/L,3000μg /L,8000μg /L和肌酐浓度分别为300mg/L,3000mg/L,8000mg/L的化学品;
(2)质控品:肌氨酸浓度为1000μg /L 和肌酐浓度为1000mg/L的化学品;
(3)内标溶液:肌氨酸-d3100mg/L,肌酐-d3200mg/L;
(4)沉淀剂:乙腈;
(5)流动相A:含0.1 mmol/L甲酸铵和 0.4%甲酸的 20%乙腈溶液;
(6)流动相B:含0.02%甲酸的 20%乙腈溶液。
2、尿样采集:使用同实施例1的尿样。
3、预处理方法,色谱和质谱条件同实施例1。
4、相应的峰面积和肌氨酸及肌酐含量计算结果列于表2。
表2 肌氨酸和肌酐代表性样品测定结果
样品 | 肌氨酸和肌酐峰面积 | 肌氨酸-d3和肌酐-d3峰面积 | 肌氨酸含量(μg /L)和肌酐含量(mg/L) |
空白尿样 | 1300/5120 | 278000/90100 | 111/228 |
中浓度对照品 | 305800/53610 | 2519900/70133 | 2969/2812 |
质控品 | 71800/19120 | 1761520/59493 | 975/972 |
临床尿样 | 5120/9299 | 356380/45152 | 364/778 |
图5肌氨酸浓度分别为300,3000,8000μg/L的标准曲线,以肌氨酸浓度为X轴,以肌氨酸与内标峰面积比值为Y轴,经过1/X权重处理,在浓度300 μg/L至8000 μg/L范围内,线性相关系数为0.9998。图6肌酐浓度分别为300,3000,8000mg/L的标准曲线,以肌酐的浓度为X轴,以肌酐与内标峰面积比值为Y轴,经过1/X权重处理,在浓度300 mg/L至8000 mg/L范围内,线性相关系数为0.9998。
实施例3 方法学验证
采用实施例1所列的检测条件和方法,对尿样肌氨酸和肌酐测定方法进行了方法学验证。在配制的浓度范围内,以样品浓度为X轴,样品峰面积和内标峰面积的比值为Y轴,采用1 / x权重处理,线性回归后具良好相关性(相关系数大于0.9990)。尿样中肌氨酸的提取回收率的相对偏差均小于11%;批内、批间精密度均小于12%,准确度为87.8~99.5%。肌酐的提取回收率的相对偏差均小于9%,批内、批间精密度均小于16%,准确度为87.8~108%。稳定性试验结果表明,经预处理后的待测尿样和化学样品在自动进样器中(4℃)放置48h,尿样室温放置24h、经过3次冻融都保持稳定、尿样-20℃冻存49d,均保持稳定。
1.标准曲线和定量范围
按实施例1方法配制肌氨酸和肌酐标准曲线,分3批次,每个浓度配制平行样2次,进样分析。以肌氨酸(或肌酐)浓度为x轴,肌氨酸(或肌酐)与内标峰面积之比为y轴,进行线性回归,建立回归方程(图3、4)。结果肌氨酸和肌酐具有良好的线性相关性,线性相关系数均大于0.9980。本法肌氨酸的最低检测限为100 μg/L,肌酐为100 mg/L。
2.准确度与精密度
按实施例1方法配制肌氨酸和肌酐的质控样品。每种浓度配制6份,在同一天内按上述样品处理方法及液相色谱串联质谱条件进行处理和分析,计算批内精密度和准确度。按上述方法,分3天配制3批样品处理和分析,计算批间精密度和准确度。尿样中肌氨酸的批内、批间精密度CV% ≤12%,准确度87.8~99.5%之间;肌酐的批内、批间精密度CV% ≤16%,准确度87.8~108%之间。
3.回收率
样品浓度、处理方法和进样条件都同精密度和准确度项下,测回收率,低、中、高浓度样品的肌氨酸的平均提取回收率的相对偏差均在5.27%~10.7%,肌酐的平均提取回收率的相对偏差均在6.51%~8.21%。
4.稳定性
样品浓度、处理方法和进样条件都同精密度和准确度项下,考察自动进样器中48小时、冻融3次、室温放置24小时、-20℃放置49天,稳定性试验结果表明,经预处理后的待测尿样和化学样品的肌氨酸和肌酐在自动进样器中(4℃)放置48h,尿样室温放置24h、经过3次冻融都保持稳定、尿样-20℃冻存49d,均保持稳定。
Claims (6)
1.一种尿肌氨酸和肌酐测定试剂盒,其特征在于组成包括:
1)对照品:肌氨酸浓度分别为100-300μg/L、1000-3000μg /L、5000-8000μg /L和肌酐浓度分别为100-300mg/L、1000-3000mg/L、5000-8000mg/L的化学品;
2)质控品:肌氨酸浓度为800-1000μg /L 和肌酐浓度为800-1000mg/L的化学品;
3)内标溶液:肌氨酸-d3 50-100mg/L,肌酐-d3 150-200 mg/L的化学品;
4)沉淀剂:乙腈;
5)流动相A:含0.1 mmol/L甲酸铵和0.4%甲酸的20%乙腈水溶液;
6)流动相B:含0.02%甲酸的20%乙腈水溶液。
2.权利要求1所述试剂盒用于尿中肌氨酸和肌酐测定的方法,其特征在于步骤为:
1)标准曲线的绘制:用对照品和內标的比值绘制标准曲线,用质控品和內标的比值确认标准曲线;
2)尿样采集:随机尿,3000rpm离心5min,取上清尿2mL左右-20℃保存,临用前于室温下解冻;
3)样品稀释处理:尿样中以乙腈∶尿样体积比为2∶1的比例加入沉淀剂乙腈,除去尿样中蛋白,并稀释尿样至肌氨酸浓度为100-5000μg/L,肌酐浓度为100-5000mg/L;
4)色谱分离纯化:以硅胶键合相填料为色谱柱,用流动相A和/或流动相B等度或者梯度洗脱,使肌氨酸和肌酐与其他干扰物质色谱分离;
5)质谱检测:经液相色谱仪分离后的肌氨酸和肌酐,采用电喷雾离子化串联质谱仪,在正离子检测模式下,检测肌氨酸和肌酐;肌氨酸的母离子,其质量电荷比m/z为90±0.5;经过进一步质谱碎裂后同时检测肌氨酸的母离子和碎片离子,其质量电荷比m/z分别为90±0.5和44±0.5;肌酐的母离子,其质量电荷比m/z为114±0.5;经过进一步质谱碎裂后同时检测肌酐的母离子和碎片离子,其质量电荷比m/z分别为114±0.5和86±0.5;
6)结果计算:以肌氨酸和肌酐质谱检测获得的峰面积与內标峰面积的比值,计算肌氨酸或肌酐的浓度值。
3.根据权利要求2所述测定方法,其特征在于步骤4)所述肌氨酸与其他干扰物质色谱分离的条件是:色谱柱: HYPERSIL silica,5μm, 2.1×100mm,Thermo,流动相B:含0.02%甲酸的 20%乙腈溶液,流速:0.3mL/min,进样量:5μL。
4.根据权利要求2所述测定方法,其特征在于步骤4)所述肌酐与其他干扰物质色谱分离的条件是:色谱柱:HYPERSIL silica,5μm, 2.1×100mm,Thermo ,流动相A :含 0.1 mmol/L甲酸铵和 0.4%甲酸的 20%乙腈溶液,流动相B:含 0.02%甲酸的 20%乙腈溶液,梯度洗脱,0~0.1 min、0.1~2 min、 2.1~6 min,流动相A∶流动相B体积百分比分别为25%∶75%、100%∶0%、25%∶75%,流速:0.3mL/min,进样量:3μL。
5.根据权利要求2所述测定方法,其特征在于步骤5)所述肌氨酸质谱检测条件为:电喷雾离子源, 正离子扫描;MRM扫描,肌氨酸检测通道90.1>44.1,±0.5 m/z,肌氨酸-d3检测通道93.1>47.1 ,±0.5 m/z,离子化电压:5000V;离子化温度:550℃;喷雾气:60 psi;加热气:60 psi;气帘气:25 psi;碰撞气:中等;去簇电压(DP):21 V;入口电压(EP):4 V;碰撞能(CE):20 V;出口电压(CXP):6 V。
6.根据权利要求2所述测定方法,其特征在于所述步骤5)肌酐质谱检测条件为:电喷雾离子源,正离子扫描;MRM扫描,肌酐检测通道114.8>86.1,±0.5 m/z,肌酐-d3检测通道117.1>89.1 ±0.5 m/z ,离子化电压:5000V;离子化温度:550℃;喷雾气:60 psi;加热气:60 psi;气帘气:25 psi;碰撞气:中等;去簇电压(DP):26 V;入口电压(EP):7 V;碰撞能(CE):18 V;出口电压(CXP):5 V。
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