CN110088615B - 用于肾功能代谢物的检测和定量的质谱法测定方法 - Google Patents

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Abstract

描述了一种通过质谱法测定样品中一种或多种分析物的量的方法，所述分析物选自由以下组成的组：N‑乙酰基苏氨酸、TMAP、苯基乙酰基谷氨酰胺、色氨酸、肌酸酐、内消旋赤藓糖醇、阿拉伯糖醇、肌醇、N‑乙酰基丝氨酸、N‑乙酰基丙氨酸、3‑甲基组氨酸、反式‑4‑羟基脯氨酸、犬尿氨酸、尿素、C‑糖基色氨酸、3‑吲哚硫酸酯、假尿苷及其组合。所述方法包括在适合于从一种或多种分析物中的每一种产生可通过质谱法检测的一种或多种离子的条件下使样品经受电离源处理；通过质谱法测量来自一种或多种分析物中的每一种的一种或多种离子的量；并且使用测量的一种或多种离子的量来确定样品中一种或多种分析物中的每一种的量。还描述了试剂盒，其包含一种或多种同位素标记的类似物作为一种或多种分析物中的每一种的内标。

Description

用于肾功能代谢物的检测和定量的质谱法测定方法
相关申请的交叉引用
本申请要求2016年12月19日提交的美国临时专利申请No.62/435,967、2017年6月28日提交的美国临时专利申请No.62/526,043和2017年9月13日提交的美国临时专利申请No.62/558,014的权益，所述专利申请的每一个的全部内容通过引用并入本文。
背景技术
提供用于描述本发明背景的以下信息以帮助理解本发明，并且不承认所述信息构成或描述本发明的现有技术。
对于评估肾脏的排泄功能(肾小球滤过率，GFR)的敏感、准确和方便的测试存在显著未满足的临床需求。肾功能的最准确测量是测量的肾小球滤过率(mGFR)，其需要使用过滤标志物(marker)(例如菊粉，碘酞酸盐，碘海醇)。由于其复杂性，该测量是昂贵的，难以在常规临床实践中执行，并且通常仅用于调查研究或用于潜在的肾脏供体。其他目前对肾功能的评估(例如，BUN，尿白蛋白测量；基于血清肌酸酐，半胱氨酸蛋白酶抑制剂C的水平的肾小球滤过率估计(eGFR))对于在肾脏损伤早期检测肾功能受损或早期肾脏疾病、或监测疾病进展(特别是在个体无症状的慢性肾病(CKD)的早期阶段)而言不是足够敏感和/或准确的。因此，已开发出基于选自由以下组成的组的一种或多种和至多17种代谢物生物标志物的组合的测量水平的肾功能的替代测量：假尿苷、N-乙酰基苏氨酸、苯基乙酰基谷氨酰胺、色氨酸、N,N,N-三甲基-L-丙氨酰基-L-脯氨酸(TMAP)、肌酸酐、内消旋赤藓糖醇(meso-erythritol)、阿拉伯糖醇、肌醇(myo-inositol)、N-乙酰基丝氨酸、N-乙酰基丙氨酸、3-甲基组氨酸、反式-4-羟脯氨酸、犬尿氨酸、尿素、C-糖基色氨酸(也称为2-吡喃甘露糖基-色氨酸、2-(α-D-吡喃甘露糖基)-L-色氨酸、甘露-L-色氨酸或2-MT)和3-吲哚硫酸酯(3-indoxylsulfate)。这些分析物的组合用于复杂的方程式中，得出的估计GFR(eGFR)比基于血清肌酸酐和/或半胱氨酸蛋白酶抑制剂C水平的eGFR估计值更精确。这种方法的优点是易于用于常规临床实践中以更准确地评估肾功能。评估肾功能中改善的精密度使得进行适当的治疗干预和肾功能监测，从而实现更好的治疗效果。
本文描述了用于检测和定量生物样品中至多17种分析物的方法。17种分析物可包括小组(panel)，其包括(comprised of)选自以下的一种或多种分析物：假尿苷、N-乙酰基苏氨酸、苯基乙酰基谷氨酰胺、色氨酸、TMAP、肌酸酐、内消旋赤藓糖醇、阿拉伯糖醇、肌醇、N-乙酰基丝氨酸、N-乙酰基丙氨酸、3-甲基组氨酸、反式-4-羟基脯氨酸、犬尿氨酸、尿素、C-糖基色氨酸和3-吲哚硫酸酯。有利的是，代谢物测定需要小的样品大小，不需要衍生化并且可以使用质谱法分析方法进行。
发明内容
在本发明的第一方面，一种方法包括通过质谱法检测和确定样品中分析物小组的量，其包括选自由以下组成的组的一种或多种分析物：假尿苷、N-乙酰基苏氨酸、苯基乙酰基谷氨酰胺、色氨酸、TMAP、肌酸酐、内消旋赤藓糖醇、阿拉伯糖醇、肌醇、N-乙酰基丝氨酸、N-乙酰基丙氨酸、3-甲基组氨酸、反式-4-羟基脯氨酸、犬尿氨酸、尿素、C-糖基色氨酸、3-吲哚硫酸酯及其组合。在一个实施方案中，所述方法包括在适合于从一种或多种分析物中的每一种产生可通过质谱法检测的一种或多种离子的条件下使样品经受电离源处理。在另一个实施方案中，分析物在电离之前不衍生化。还提供了在通过质谱法检测之前从生物样品中提取分析物并色谱分离分析物的方法。
在另一个方面，一种方法包括通过质谱法检测和确定样品中分析物小组的量，其包括选自由以下组成的组的一种或多种分析物：假尿苷、N-乙酰基苏氨酸、苯基乙酰基谷氨酰胺、色氨酸、TMAP、肌酸酐、内消旋赤藓糖醇、阿拉伯糖醇、肌醇、N-乙酰基丝氨酸、N-乙酰基丙氨酸、3-甲基组氨酸、反式-4-羟基脯氨酸、犬尿氨酸、尿素、C-糖基色氨酸、3-吲哚硫酸酯及其组合，其中，如果所述一种或多种分析物只是一种分析物，那么所述一种分析物不是肌酸酐。
在一个实施方案中，质谱法是串联质谱法。
在其中一种或多种分析物包括N-乙酰基苏氨酸的实施方案中，来自N-乙酰基苏氨酸的一种或多种离子可包含选自由具有以下的质荷比(m/z)的离子组成的组的一种或多种离子：约162.0±0.5，74.1±0.5，144.0±0.5，126.1±0.5，119.9±0.5，116.1±0.5，102.0±0.5，97.9±0.5，84.0±0.5，70.0±0.5，57.0±0.5，56.0±0.5，43.0±0.5，28.1±0.5，159.9±0.5，73.9±0.5，118.1±0.5，115.8±0.5，97.9±0.5，71.9±0.5，70.9±0.5，70.1±0.5，56.1±0.5，54.0±0.5，42.0±0.5，40.9±0.5，26.0±0.5，和159.9±0.5。
在其中一种或多种分析物包括苯基乙酰基谷氨酰胺的实施方案中，来自苯基乙酰基谷氨酰胺的一种或多种离子可包含选自由具有以下的质荷比(m/z)的离子组成的组的一种或多种离子：约265.0±0.5，91.0±0.5，248.1±0.5，219.1±0.5，147.1±0.5，136.0±0.5，130.0±0.5，129.1±0.5，101.1±0.5，84.0±0.5，83.0±0.5，65.0±0.5，56.0±0.5，50.9±0.5，44.0±0.5，40.9±0.5，39.1±0.5，28.0±0.5，262.9±0.5，和42.0±0.5。
在其中一种或多种分析物包括肌酸酐的实施方案中，来自肌酸酐的一种或多种离子可包含选自由具有以下的质荷比(m/z)的离子组成的组的一种或多种离子：约113.9±0.5，43.0±0.5，86.0±0.5，72.0±0.5，44.1±0.5，42.0±0.5，28.1±0.5，111.9±0.5，和67.9±0.5。
在其中一种或多种分析物包括色氨酸的实施方案中，来自色氨酸的一种或多种离子可包含选自由具有以下的质荷比(m/z)的离子组成的组的一种或多种离子：约205.0±0.5，146.0±0.5，191-193±0.5，173-174±0.5，163-164±0.5，144.8-151.2±0.5，117.1-122.1±0.5，102.9-110.1±0.5，89.9-96.0±0.5，74.1-81.1±0.5，60.9-68.9±0.5，50.1-54.1±0.5，38.0-43.1±0.5，28.0-29.0±0.5，202.9±0.5，115.9±0.5，185.9±0.5，158.9±0.5，141.9±0.5，130.0±0.5，74.1±0.5，72.2±0.5，59.0±0.5，44.9±0.5。
在其中一种或多种分析物包括假尿苷的实施方案中，来自假尿苷的一种或多种离子可包含选自由具有以下的质荷比(m/z)的离子组成的组的一种或多种离子：约244.9±0.5，191.0±0.5，209.0±0.5，179.0±0.5，167.0±0.5，163.0±0.5，154.8±0.5，151.0±0.5，148.0±0.5，139.0±0.5，125.0±0.5，120.0±0.5，111.8±0.5，109.8±0.5，107.8±0.5，96.0±0.5，92.0±0.5，84.0±0.5，82.0±0.5，80.0±0.5，68.0±0.5，65.2±0.5，55.0±0.5，54.0±0.5，43.0±0.5，41.0±0.5，39.0±0.5，242.9±0.5，153.0±0.5，182.8±0.5，151.9±0.5，139.9±0.5，138.9±0.5，124.0±0.5，110.8±0.5，109.9±0.5，96.0±0.5，82.0±0.5，55.0±0.5，42.0±0.5，和41.0±0.5。
在其中一种或多种分析物包括内消旋赤藓糖醇的实施方案中，来自内消旋赤藓糖醇的一种或多种离子可包含选自由具有以下的质荷比(m/z)的离子组成的组的一种或多种离子：约120.9±0.5，88.9±0.5，120.0±0.5，119.0±0.5，105.9±0.5，103.0±0.5，100.9±0.5，93.9±0.5，92.8±0.5，79.9±0.5，77.0±0.5，70.9±0.5，67.9±0.5，65.8±0.5，65.0±0.5，58.9±0.5，52.0±0.5，43.2±0.5，和40.0±0.5。
在其中一种或多种分析物包括阿拉伯糖醇的实施方案中，来自阿拉伯糖醇的一种或多种离子可包含选自由具有以下的质荷比(m/z)的离子组成的组的一种或多种离子：约150.9±0.5，88.9±0.5，149.1±0.5，136.0±0.5，133.0±0.5，131.1±0.5，119.0±0.5，112.8±0.5，108.2±0.5，103.1±0.5，100.9±0.5，96.8±0.5，91.8±0.5，84.9±0.5，83.0±0.5，81.9±0.5，78.8±0.5，77.0±0.5，73.0±0.5，70.9±0.5，68.9±0.5，66.9±0.5，59.0±0.5，57.0±0.5，55.0±0.5，45.0±0.5，42.9±0.5，和41.2±0.5。
在其中一种或多种分析物包括肌醇的实施方案中，来自肌醇的一种或多种离子可包含选自由具有以下的质荷比(m/z)的离子组成的组的一种或多种离子：约178.9±0.5，87.0±0.5，177.2±0.5，161.0±0.5，159.0±0.5，146.8±0.5，141.0±0.5，134.9±0.5，128.8±0.5，125.0±0.5，122.7±0.5，117.0±0.5，112.8±0.5，110.9±0.5，100.9±0.5，98.9±0.5，97.0±0.5，95.0±0.5，90.8±0.5，89.0±0.5，85.0±0.5，82.9±0.5，81.0±0.5，78.8±0.5，74.8±0.5，73.1±0.5，70.9±0.5，68.9±0.5，59.0±0.5，56.9±0.5，55.0±0.5，45.1±0.5，43.0±0.5，和41.0±0.5。
在其中一种或多种分析物包括N-乙酰基丝氨酸的实施方案中，来自N-乙酰基丝氨酸的一种或多种离子可包含选自由具有以下的质荷比(m/z)的离子组成的组的一种或多种离子：约145.9±0.5，74.0±0.5，119.0±0.5，116.0±0.5，104.9±0.5，103.9±0.5，103.0±0.5，97.9±0.5，84.0±0.5，81.0±0.5，72.0±0.5，70.0±0.5，64.9±0.5，60.8±0.5，57.0±0.5，42.0±0.5，和40.9±0.5。
在其中一种或多种分析物包括N-乙酰基丙氨酸的实施方案中，来自N-乙酰基丙氨酸的一种或多种离子可包含选自由具有以下的质荷比(m/z)的离子组成的组的一种或多种离子：约131.9±0.5，89.9±0.5，114.1±0.5，86.1±0.5，和44.0±0.5。
在其中一种或多种分析物包括3-甲基组氨酸的实施方案中，来自3-甲基组氨酸的一种或多种离子可包含选自由具有以下的质荷比(m/z)的离子组成的组的一种或多种离子：约170.0±0.5，94.9±0.5，109.1±0.5，97.0±0.5，96.0±0.5，92.9±0.5，83.0±0.5，81.0±0.5，80.1±0.5，70.2±0.5，67.9±0.5，67.0±0.5，55.0±0.5，54.0±0.5，42.0±0.5，和41.0±0.5。
在其中一种或多种分析物包括反式-4-羟基脯氨酸的实施方案中，来自反式-4-羟基脯氨酸的一种或多种离子可包含选自由具有以下的质荷比(m/z)的离子组成的组的一种或多种离子：约131.9±0.5，68.0±0.5，114.2±0.5，86.0±0.5，58.0±0.5，和41.0±0.5。
在其中一种或多种分析物包括犬尿氨酸的实施方案中，来自犬尿氨酸的一种或多种离子可包含选自由具有以下的质荷比(m/z)的离子组成的组的一种或多种离子：约209.0±0.5，94.0±0.5，192.1±0.5，191.2±0.5，174.0±0.5，164.1±0.5，163.1±0.5，150.0±0.5，146.1±0.5，136.0±0.5，119.9±0.5，118.1±0.5，98.9±0.5，88.0±0.5，和73.9±0.5。
在其中一种或多种分析物包括尿素的实施方案中，来自尿素的一种或多种离子可包含选自由具有以下的质荷比(m/z)的离子组成的组的一种或多种离子：约60.9±0.5，29.2±0.5，44.0±0.5，43.0±0.5，42.1±0.5，28.0±0.5，和27.1±0.5。
在其中一种或多种分析物包括3-吲哚硫酸酯的实施方案中，来自3-吲哚硫酸酯的一种或多种离子可包含选自由具有以下的质荷比(m/z)的离子组成的组的一种或多种离子：约211.8±0.5，79.9±0.5，132.0±0.5，104.0±0.5，80.9±0.5，和77.0±0.5。
在其中一种或多种分析物包括TMAP的实施方案中，来自TMAP的一种或多种离子可包含选自由具有以下的质荷比(m/z)的离子组成的组的一种或多种离子：约229.1±0.5，170.1±0.5，142.2±0.5，126.0±0.5，124.0±0.5，116.0±0.5，114.0±0.5，98.0±0.5，96.0±0.5，70.0±0.5，68.0±0.5，60.0±0.5，59.1±0.5，58.1±0.5，54.9±0.5，227.0±0.5，181.0±0.5，159.0±0.5，133.2±0.5，114.8±0.5，112.9±0.5，105.8±0.5，89.1±0.5，71.0±0.5，69.0±0.5，和45.1±0.5。
在其中一种或多种分析物包括C-糖基色氨酸的实施方案中，来自C-糖基色氨酸的一种或多种离子可包含选自由具有以下的质荷比(m/z)的离子组成的组的一种或多种离子：约365.2±0.5，245.0±0.5，130.0±0.5，142.0±0.5，156.0±0.5，和116.0±0.5。
在一个实施方案中，所述方法包括使用单次注射通过质谱法确定样品中多种分析物的量，例如，选自由色氨酸和3-吲哚硫酸酯组成的组的两种或更多种分析物的量。
在一个实施方案中，所述方法包括使用单次注射通过质谱法确定样品中多种分析物的量，例如，选自由色氨酸、3-吲哚硫酸酯和C-糖基色氨酸组成的组中的两种或更多种或三种分析物的量。
在一个实施方案中，所述方法包括使用单次注射通过质谱法确定样品中多种分析物的量，例如，选自假尿苷、N-乙酰基苏氨酸、苯基乙酰基谷氨酰胺、色氨酸和肌酸酐的两种或更多种、三种或更多种、四种或更多种或五种分析物的量。在另一个实施方案中，所述方法包括确定N-乙酰基苏氨酸、假尿苷、苯基乙酰基谷氨酰胺和色氨酸的量。
在一个示例性实施方案中，确定两种或更多种分析物的水平，其中两种或更多种分析物包括假尿苷和N-乙酰基苏氨酸。
在一个示例性实施方案中，确定两种或更多种分析物的水平，其中两种或更多种分析物包括假尿苷和苯基乙酰基谷氨酰胺。
在一个示例性实施方案中，确定两种或更多种分析物的水平，其中两种或更多种分析物包括假尿苷和色氨酸。
在一个示例性实施方案中，确定两种或更多种分析物的水平，其中两种或更多种分析物包括假尿苷和肌酸酐。
在一个示例性实施方案中，确定两种或更多种分析物的水平，其中两种或更多种分析物包括N-乙酰基苏氨酸和苯基乙酰基谷氨酰胺。
在一个示例性实施方案中，确定两种或更多种分析物的水平，其中两种或更多种分析物包括N-乙酰基苏氨酸和色氨酸。
在一个示例性实施方案中，确定两种或更多种分析物的水平，其中两种或更多种分析物包括N-乙酰基苏氨酸和肌酸酐。
在一个示例性实施方案中，确定两种或更多种分析物的水平，其中两种或更多种分析物包括苯基乙酰基谷氨酰胺和色氨酸。
在一个示例性实施方案中，确定两种或更多种分析物的水平，其中两种或更多种分析物包括苯基乙酰基谷氨酰胺和肌酸酐。
在一个示例性实施方案中，确定两种或更多种分析物的水平，其中两种或更多种分析物包括色氨酸和肌酸酐。
在一个示例性实施方案中，确定两种或更多种分析物的水平，其中两种或更多种分析物包括TMAP和假尿苷。
在一个示例性实施方案中，确定两种或更多种分析物的水平，其中两种或更多种分析物包括TMAP和N-乙酰基苏氨酸。
在一个示例性实施方案中，确定两种或更多种分析物的水平，其中两种或更多种分析物包括TMAP和苯基乙酰基谷氨酰胺。
在一个示例性实施方案中，确定两种或更多种分析物的水平，其中两种或更多种分析物包括TMAP和色氨酸。
在一个示例性实施方案中，确定两种或更多种分析物的水平，其中两种或更多种分析物包括TMAP和肌酸酐。
在一个示例性实施方案中，确定两种或更多种分析物的水平，其中两种或更多种分析物包括C-糖基色氨酸和假尿苷。
在一个示例性实施方案中，确定两种或更多种分析物的水平，其中两种或更多种分析物包括C-糖基色氨酸和N-乙酰基苏氨酸。
在一个示例性实施方案中，确定两种或更多种分析物的水平，其中两种或更多种分析物包括C-糖基色氨酸和苯基乙酰基谷氨酰胺。
在一个示例性实施方案中，确定两种或更多种分析物的水平，其中两种或更多种分析物包括C-糖基色氨酸和色氨酸。
在一个示例性实施方案中，确定两种或更多种分析物的水平，其中两种或更多种分析物包括C-糖基色氨酸和肌酸酐。
在一个示例性实施方案中，确定两种或更多种分析物的水平，其中两种或更多种分析物包括C-糖基色氨酸和TMAP。
在一个实施方案中，所述方法包括使用单次注射通过质谱法确定样品中多种分析物的量，例如，选自由N-乙酰基苏氨酸、阿拉伯糖醇、苯基乙酰基谷氨酰胺、肌酸酐和假尿苷组成的组中的两种或更多种、三种或更多种、四种或更多种，或五种分析物的量。
在一个实施方案中，所述方法包括使用单次注射通过质谱法确定样品中多种分析物的量，例如，选自由N-乙酰基苏氨酸、假尿苷、内消旋赤藓糖醇、阿拉伯糖醇、肌醇和N-乙酰基丝氨酸组成的组的两种或更多种、三种或更多种、四种或更多种、五种或更多种或六种分析物的量。
在一个实施方案中，所述方法包括使用单次注射通过质谱法确定样品中多种分析物的量，例如，选自由N-乙酰基苏氨酸、假尿苷、苯基乙酰基谷氨酰胺、色氨酸，TMAP和肌酸酐组成的组的两种或更多种、三种或更多种、四种或更多种、五种或更多种或六种分析物的量。
在一个实施方案中，所述方法包括使用单次注射通过质谱法确定样品中多种分析物的量，例如，选自由N-乙酰基苏氨酸、肌醇、色氨酸、苯基乙酰基谷氨酰胺、肌酸酐和假尿苷组成的组的两种或更多种、三种或更多种、四种或更多种、五种或更多种或六种分析物的量。
在一个实施方案中，所述方法包括使用单次注射通过质谱法确定样品中多种分析物的量，例如，选自由N-乙酰基苏氨酸、苯基乙酰基谷氨酰胺、色氨酸、肌酸酐、N-乙酰基丙氨酸、3-甲基组氨酸、反式-4-羟基脯氨酸、犬尿氨酸、尿素及其组合组成的组的两种或更多种、三种或更多种、四种或更多种、五种或更多种、六种或更多种、七种或更多、八种或更多种或九种分析物的量。分析物的示例性组合显示在表A中，作为附录A提供。
在一个实施方案中，所述方法包括使用单次注射通过质谱法确定样品中多种分析物的量，例如，选自由N-乙酰基苏氨酸、内消旋赤藓糖醇、阿拉伯糖醇、肌醇、3-吲哚硫酸酯、色氨酸、苯基乙酰基谷氨酰胺、肌酸酐、假尿苷和N-乙酰基丝氨酸组成的组的两种或更多种、三种或更多种、四种或更多种、五种或更多种、六种或更多种、七种或更多、八种或更多种、九种或更多种、或十种分析物的量。
在一个实施方案中，运行时间可以是7分钟或更短。在另一个实施方案中，运行时间可小于4分钟。
在实施方案中，样品可以是血浆样品或血清样品。样品体积可以是10μl至200μl。例如，样品体积可以是10μl、15、20、25、30、40、50μl、60、70、80、90、100、120、140、160、180或200μl或10至200μl之间的任何其他体积.
附图说明
图1A-F分别显示了苯基乙酰基谷氨酰胺、假尿苷、色氨酸、N-乙酰基苏氨酸和肌酸酐的示例性色谱图，其为有内标(1A)的单一色谱图，以及每种分析物的各自色谱图(1B-F)，所述色谱图使用色谱方法1分别生成。
图2A-H显示了内消旋赤藓糖醇、N-乙酰基丝氨酸、阿拉伯糖醇、N-乙酰基苏氨酸、肌醇和假尿苷的示例性色谱图，其为包括来自血清的内标(2A)或BSA中的校准标准(2B)的单一色谱图，和每种分析物的各自色谱图(2C-H)，所述色谱图分别使用色谱方法2生成。
图3A-K显示了尿素、肌酸酐、反式-4-羟基脯氨酸、N-乙酰基丙氨酸、N-乙酰基苏氨酸、3-甲基组氨酸、色氨酸、犬尿氨酸和苯基乙酰基谷氨酰胺的色谱图，其为来自血清(3A)或血浆(3B)的单一色谱图和每种分析物的各自色谱图(3C-K)，所述色谱图分别使用色谱方法3生成。
图4A-H显示了C-糖基色氨酸、色氨酸和3-吲哚硫酸酯的色谱图，其为来自血清(4A)或血浆(4E)的单一色谱图以及来自血清(4B-D)和血浆(4F-H)的每种分析物的各自色谱图，所述色谱图使用色谱方法4生成。
图5显示了苯基乙酰基谷氨酰胺、肌酸酐、N-乙酰基苏氨酸、色氨酸、假尿苷和TMAP的示例性色谱图，其为单一色谱图，所述色谱图使用色谱方法5产生。包括苯基乙酰基谷氨酰胺、肌酸酐、N-乙酰基苏氨酸、色氨酸和假尿苷的内标。TMAP是内源的。
图6显示了N-乙酰基苏氨酸、内消旋赤藓糖醇、阿拉伯糖醇、肌醇、3-吲哚硫酸酯、色氨酸、苯基乙酰基谷氨酰胺、肌酸酐、假尿苷和N-乙酰基丝氨酸的示例性色谱图，其为单一色谱图，包括内标，所述色谱图使用色谱方法6生成。
图7显示了阿拉伯糖醇、苯基乙酰基谷氨酰胺、肌酸酐、假尿苷和N-乙酰基苏氨酸的示例性色谱图，其为单一色谱图，包括内标，所述色谱图使用色谱方法7产生。
图8显示了肌醇、色氨酸、苯基乙酰基谷氨酰胺、肌酸酐、假尿苷和N-乙酰基苏氨酸的示例性色谱图，其为单一色谱图，包括内标，所述色谱图使用色谱方法8产生。
图9显示了由N-乙酰基苏氨酸的串联质谱碎裂(fragmentation)产生的示例性母离子和子(daughter)离子峰。
图10显示了由苯基乙酰基谷氨酰胺的串联质谱碎裂产生的示例性母离子和子离子峰。
图11显示了由肌酸酐的串联质谱碎裂产生的示例性母离子和子离子峰。
图12显示了由色氨酸的串联质谱碎裂产生的示例性母离子和子离子峰。
图13显示了由假尿苷的串联质谱碎裂产生的示例性母离子和子离子峰。
图14A-B显示了在正电离模式(A)和负电离模式(B)下TMAP的串联质谱碎裂产生的示例性母离子和子离子峰。
发明详述
描述了用于测量样品中选自由以下组成的代谢物的组的一种或多种分析物的量的方法：N-乙酰基苏氨酸、假尿苷、苯基乙酰基谷氨酰胺、色氨酸，TMAP、内消旋赤藓糖醇、阿拉伯糖醇、肌醇、N-乙酰基丝氨酸、N-乙酰基丙氨酸、3-甲基组氨酸、反式-4-羟基脯氨酸、犬尿氨酸、尿素、C-糖基色氨酸、3-吲哚硫酸酯和肌酸酐，其中，如果一种或多种测定的分析物仅为一种分析物，则所述一种分析物不是肌酸酐。描述了用于使用单次注射方法定量样品中的单个和多个分析物的质谱方法。所述方法可以使用诸如UPLC的液相色谱法步骤来进行所选分析物的分离(纯化、富集)，所述液相色谱法与质谱法的方法结合，从而提供用于量化经得起自动化的样品中的多种分析物的高通量测定系统。
本文提供的方法提供优于当前测量这些分析物的方法的优点。在单次注射中测量各种组合中的多种分析物的能力减少了获得分析结果所需的时间，在实验室一次性物品(例如，管、移液管吸头(pipette tip)、试剂)、实验室仪器和人类资源方面使用较少的资源。这些改进通过降低测定成本和增加仪器和实验室样品分析能力来节省成本。
在进一步详细描述本发明之前，定义了以下术语。
定义：
术语“固相提取”是指样品制备过程，其中使用固体颗粒色谱填充材料(即固相或固定相)根据复杂混合物(即流动相)的组分的物理和化学性质分离复杂混合物(即流动相)的组分。固体颗粒填充材料可以包含在筒式(cartridge)装置(例如柱)中。
术语“分离”是指将复杂混合物分离成其组分分子或代谢物的过程。常见的示例性实验室分离技术包括电泳和色谱法。
术语“色谱法”是指物理分离方法，其中待分离的组分(即化学成分(constituent))分布在两相之间，其中一相是静止的(固定相)而另一相(流动相)朝着明确的方向移动。流动相可以是气体(“气相色谱法”，“GC”)或液体(“液相色谱法”，“LC”)。色谱输出数据可用于本文所述方法的实施方案中。
术语“液相色谱法”或“LC”是指当流体均匀地移动通过细分物质的柱或通过毛细管通道时选择性抑制流体溶液的一种或多种组分的过程。当流动相相对于固定相移动时，抑制由一种或多种固定相和流动相之间的混合物组分的分布产生。“液相色谱法”的实例包括“反相液相色谱法”或“RPLC”，“高效液相色谱法”或“HPLC”，“超高效液相色谱法”或“UPLC”或“UHPLC”。
术语“保留时间”是指自从将样品引入分离装置以来在色谱法过程中的经过时间。样品成分的保留时间是指在样品注入分离装置的时间和样品成分从包含固定相的分离装置的部分洗脱(例如，离开)的时间之间的色谱过程中经过时间。
术语“保留指数”是指通过内推(interpolation)(通常是对数)获得的数字，其将样品组分的保留时间或保留因子与样品组分峰值之前和之后洗脱的标准物的保留时间相关联，其机制是使用已知标准物的分离特征来消除系统误差。
术语“分离指数”是指与通过分离技术分离的化学成分相关的度量(metric)。对于色谱分离技术，分离指数可以是保留时间或保留指数。对于非色谱分离技术，分离指数可以是化学成分经过的物理距离。
如本文所用，术语“分离信息”和“分离数据”是指表示就分离指数而言存在或不存在化学成分的数据。例如，分离数据可以指示在特定时间洗脱的具有特定质量的化学成分的存在。分离数据可以指示随时间洗脱的化学成分的量上升，达到峰值，然后下降。根据分离指数(例如，时间)绘制的化学成分的存在的图可以显示图形峰。因此，在分离数据的上下文中，术语“峰值信息”和“峰值数据”与术语“分离信息”和“分离数据”同义。
术语“质谱法”(MS)是指用于测量和分析分子的技术，其涉及电离或电离和碎裂靶分子，然后基于它们的质/荷比分析离子以产生质谱，其用作“分子指纹”。确定物体的质量/电荷比可以通过确定该物体吸收电磁能的波长来完成。有几种常用的方法来确定离子的质荷比，一些测量离子轨迹与电磁波的相互作用，另一些测量离子行进给定距离所花费的时间，或两者的组合。可以针对数据库搜索来自这些片段质量测量的数据，以获得靶分子的鉴定。
术语“以负模式操作”或“以负MRM模式操作”或“以负电离模式操作”是指那些产生和检测负离子的质谱方法。术语“以正模式操作”或“以正MRM模式操作”或“以正电离模式操作”是指那些产生和检测正离子的质谱方法。
术语“质量分析器”是指质谱仪中的装置，其通过质荷比(“m/z”)将离子混合物分离。
术语“m/z”是指通过将离子的质量数除以其电荷数而形成的无量纲量(dimentionless quantity)。它一直被称为“质荷”比。
如本文所用，术语“来源”是指质谱仪中的装置，其使待分析的样品电离。离子源的实例包括电喷雾电离(ESI)、大气压化学电离(APCI)、加热电喷雾电离(HESI)、大气压光电离(APPI)、火焰离子化检测器(FID)、基质辅助激光解吸电离(MALDI)等。
如本文所用，术语“检测器”是指质谱仪中检测离子的装置。
术语“离子”是指包含电荷的任何物体(object)，其可以例如通过向物体添加电子或从物体移除电子来形成。
术语“质谱”是指由质谱仪产生的数据图，通常包含x轴上的m/z值和y轴上的强度值。
术语“扫描”是指与特定分离指数相关的质谱。例如，使用色谱分离技术的系统可能会生成多次扫描，每次扫描的保留时间不同。
术语“运行时间”是指从样品注射到仪器数据的产生的时间。总运行时间包括样品的色谱法和质谱法。
术语“串联MS”是指这样的操作，其中执行称为“初级(primary)MS”的第一MS步骤，然后执行一个或多个后续MS步骤，通常称为“二级(secondary)MS”。在初级MS中，在初级质谱的产生期间检测并记录代表一种(并且可能多于一种)化学成分的离子。由离子表示的物质经历二级MS，其中感兴趣的物质经历碎裂以使物质破裂成子组分，其被检测并记录为二级质谱。在真正的串联MS中，初级MS中感兴趣的离子与二级MS期间产生的峰值之间存在明确的关系。初级MS中感兴趣的离子对应于“母”或前体离子，而在二级MS期间产生的离子对应于母离子的子组分，并且在本文中称为“子”或“产物”离子。
因此，串联MS允许创建表示复杂混合物中化学成分的母-子关系的数据结构。该关系可以由树状结构表示，该树状结构示出了母离子和子离子彼此的关系，其中子离子代表母离子的子组分。例如，可以对子离子重复串联MS以确定“孙子(grand-daughter)”离子。因此，串联MS不限于两级碎裂，而是一般用于指代多级MS，也称为“MSn”。术语“MS/MS”是“MS2”的同义词。为简单起见，下文中的术语“子离子”是指由二级或更高级(即非初级)MS产生的任何离子。
一种或多种生物标志物的“水平”是指样品中测量的生物标志物的绝对或相对量或浓度。
“样品”或“生物样品”意指从受试者分离的生物材料。生物样品可含有适合于检测所需生物标志物的任何生物材料，并且可包含来自受试者的细胞和/或非细胞材料。样品可以从任何合适的生物流体或组织，例如血液、血浆(blood plasma)(血浆(plasma))、血清(blood serum)(血清(serum))、尿液、脑脊髓液(CSF)或组织中分离。
“受试者”是指任何动物，但优选是哺乳动物，例如人、猴、小鼠、兔或大鼠。
C-糖基色氨酸也称为2-吡喃甘露糖基-色氨酸、2-(α-D-吡喃甘露糖基)-L-色氨酸、甘露-L-色氨酸、2-MT。因此，这些术语在本文中可互换使用。
I.样品制备和质量控制(QC)
通过将分析物与可能存在于样品中的大分子(例如，蛋白质、核酸、脂质)分离，制备含有分析物的样品提取物。样品中的一些或所有分析物可以与蛋白质结合。在MS分析之前，可以使用各种方法破坏分析物和蛋白质之间的相互作用。例如，可以从样品中提取分析物以产生液体提取物，同时沉淀并除去可能存在的蛋白质。可以使用例如乙酸乙酯或甲醇的溶液沉淀蛋白质。为了沉淀样品中的蛋白质，向样品中加入乙酸乙酯或甲醇溶液，然后将混合物在离心机中旋转以从沉淀的蛋白质中分离含有提取的分析物的液体上清液。
在其他实施方案中，分析物可以从蛋白质中释放而不会沉淀蛋白质。例如，可以将甲酸溶液添加到样品中以破坏蛋白质和分析物之间的相互作用。或者，可以向样品中加入硫酸铵，甲酸在乙醇中的溶液或甲酸在甲醇中的溶液，以破坏蛋白质和分析物之间的离子相互作用而不沉淀蛋白质。在一个实例中，乙腈、甲醇、水和甲酸的溶液可用于从样品中提取分析物。
在一些实施方案中，可以对提取物进行各种方法，包括如本文所述的液相色谱法、电泳、过滤、离心和亲和分离，以相对于样品中的一种或多种其他组分纯化或富集所选分析物的量。
为了评估例如检测和定量分析物的方法的精密度、准确度、校准范围或分析灵敏度，可以使用质量控制(QC)样品。可以基于样品中检测到的给定分析物的定量下限(LLOQ)或定量上限(ULOQ)来确定QC样品中使用的给定分析物的浓度。在一个实例中，LLOQ可以由标准物(例如，标准物A)的浓度表示，并且ULOQ可以由第二标准物(例如，标准物H)的浓度表示。低QC值可以设定为约3×LLOQ的浓度，中QC值可以设定为高QC的约25-50％的浓度，并且高QC值可以设定为ULOQ的约80％的浓度。可以基于在一组代表性样品中测量的样品结果的分析测量范围(AMR)和频率的组合来选择QC目标浓度水平。
II.色谱法
在质谱法之前，可以对分析物提取物进行一种或多种分离方法，例如电泳、过滤、离心、亲和分离或色谱法。在一个实施方案中，分离方法可包括液相色谱法(LC)，包括例如超高效LC(UHPLC)。
在一些实施方案中，可以使用反相柱色谱系统，亲水相互作用色谱(HILIC)或混合相柱色谱系统进行UHPLC。
用于LC的柱加热器(或柱管理器)可以设定在约25℃至约80℃的温度。例如，柱加热器可以设定在约30℃、40℃、50℃、60℃、70℃等。
在一个实例中，可以使用HILIC系统进行UHPLC。在另一个实例中，可以使用反相柱色谱系统进行UHPLC。该系统可包括两个或更多个流动相。流动相可以被称为例如流动相A、流动相B、流动相A'和流动相B'。
在使用两个流动相A和B的示例性实施方案中，流动相A可包含甲酸铵、甲酸和水，并且流动相B可包含乙腈。流动相A中甲酸铵的浓度可以为0.1mM至100mM，甲酸浓度可以为0.001％至5％。此外，乙腈的浓度可以为0％至100％。在一个实例中，流动相A可包含20mM甲酸铵+1％甲酸水溶液，流动相B可包含100％乙腈。在另一个实例中，流动相A可包含50mM甲酸铵+1％甲酸的水溶液，流动相B可包含100％乙腈。
在一个实例中，线性梯度洗脱可用于色谱法。线性梯度洗脱的起始条件可包括流动相(例如流动相A)的浓度和/或流动相(例如流动相A)通过柱的流速。可以优化起始条件以分离和/或保留一种或多种分析物。梯度条件也可以针对分析物的分离和/或保留进行优化，并且可以根据所选择的流速而变化。例如，在初始条件为12％流动相A和550μL/min流速的情况下，流动相A可以在1.9min时增加至22％，在2.5min时增加至30％，然后在2.7min时增加至42％。流动相B可以在3.4min恢复至12％，其中它可以维持0.3min以进行下一次样品注射的平衡。在另一个实例中，初始条件可以是12％流动相A和500μL/min流速。流动相A可以在1.9min时增加至22％，在2.5min时增加至30％，在3.1min时增加至35％，在3.7min时增加至38％，并且在5.0min时增加至45％，其中它可以保持0.5min。流动相A可以在5.7min恢复到12％，其中在下一次样品注射之前它可以保持1.3min以进行平衡。在另一个实例中，初始条件可以是12％流动相A和550μL/min流速。流动相A可以在1.9min时增加至22％，在2.5min时增加至30％，在2.7min时增加至42％。然后，流动相A可以在3.4min恢复到12％，其中在下一次样品注射之前它可以保持0.3min以进行平衡。
在另一个实例中，流动相A可包含乙酸铵、氢氧化铵和水，流动相B可包含乙腈。乙酸铵的浓度可以为约5mM至约200mM。例如，乙酸铵的浓度可为约50mM或约100mM。氢氧化铵的浓度可以为约0.001％至约1％。例如，氢氧化铵的浓度可为约0.1％或约0.2％。在另一个实例中，流动相A可以是50mM乙酸铵+0.1％氢氧化铵水溶液，流动相B可以是100％乙腈。线性梯度洗脱可以用于色谱法，并且可以在7％流动相A和450μL/min的流速的初始条件下进行。然后，流动相A的比例可以在1.5min时增加至20％。流动相A的比例可以在4.7min时增加至30％，在5.0min时增加至35％，然后在5.1min时返回至7％，其中在下一次样品注射之前可以将其保持1.9min以进行平衡。总运行时间可以是7min或更短。在另一个实例中，流动相A可以是100mM乙酸铵+0.2％氢氧化铵水溶液，流动相B可以是100％乙腈。线性梯度洗脱可以用于色谱法，并且可以在7％流动相A和500μL/min的流速的初始条件下进行。流动相A可以在1.5min时增加至20％，在4.7min时增加至30％，在5.0min时增加至35％。然后，流动相A可以在5.1min恢复到7％，其中在下一次样品注射之前它可以保持1.9min以进行平衡。在另一个实例中，线性梯度洗脱可以在7％流动相A和800μL/min的流速的初始条件下进行。流动相A可以在0.9min时增加至20％，在1.9min时增加至25％，在2.1min时增加至30％。然后，流动相A可以在2.2min恢复到7％，其中可以在下一次样品注射之前将其保持0.5min以进行平衡。在另一个实例中，使用7％流动相A和800μL/min的流速的初始条件进行线性梯度洗脱，流动相A可以在0.9min时增加至22％，在2.5min时增加至30％，在2.7min时达到35％。然后，流动相A可以在2.8min时恢复到7％，其中可以在下一次样品注射之前将其保持0.4min以进行平衡。
在其他实施方案中，流动相A可包含甲酸和水，流动相B可包含甲酸和乙腈。在一个示例性实施方案中，流动相A可含有约0.001至约1.0％的甲酸，流动相B可含有0-100％的甲酸和乙腈。在一个实例中，流动相A的浓度可以是约0.1％的甲酸水溶液，流动相B的浓度可以是乙腈中约0.1％的甲酸。线性梯度洗脱可以用于色谱法，并且可以在2％流动相B，流速为700μL/min的初始条件下进行。流动相B可以在2.5min时增加至90％，在0.3min时保持在90％，然后可以在2.9min时降低至2％，其中在下一次样品注射之前可以将其保持0.4min以进行平衡。总运行时间可能少于4分钟。
III.质谱法和定量
可以通过本领域技术人员已知的任何方法电离一种或多种分析物，所述方法包括例如质谱法。使用质谱仪进行质谱法，所述质谱仪包括离子源，用于电离分级的样品并产生带电分子以用于进一步分析。样品的电离可以通过例如电喷雾电离(ESI)进行。其他离子源可包括例如大气压化学电离(APCI)、加热电喷雾电离(HESI)、大气压光电离(APPI)、火焰离子化检测器(FID)或基质辅助激光解吸电离(MALDI)。可以基于许多考虑来确定电离方法的选择。示例性考虑因素包括待测分析物、样品类型、检测器类型以及正或负模式的选择。
一种或多种分析物可以以正或负模式电离以产生一种或多种离子。例如，分析物N-乙酰基苏氨酸、假尿苷、苯基乙酰基谷氨酰胺、色氨酸、TMAP、肌酸酐、N-乙酰基丙氨酸、3-甲基组氨酸、反式-4-羟基脯氨酸、犬尿氨酸和尿素可以以正模式进行电离。在又一实例中，分析物N-乙酰基苏氨酸、TMAP、假尿苷、内消旋赤藓糖醇、阿拉伯糖醇、肌醇、N-乙酰基丝氨酸、色氨酸、C-糖基色氨酸和3-吲哚硫酸酯可以以负模式电离。在又一实例中，分析物N-乙酰基苏氨酸、内消旋赤藓糖醇、阿拉伯糖醇、肌醇、3-吲哚硫酸酯、色氨酸、苯基乙酰基谷氨酰胺、肌酸酐、假尿苷、和N-乙酰基丝氨酸可以以负模式进行电离。在一些实例中，分析物可以在单次注射中以正模式和负模式电离。
可以针对给定方法和/或针对所使用的特定质谱仪优化质谱仪仪器设置。仪器可以使用各种气体，例如氮气、氦气、氩气或零空气。可以使用AB Sciex QTrap 5500质谱仪进行质谱法。在一个实例中，质谱仪可以以正多反应监测(MRM)模式操作。离子喷雾电压设定范围可为约0.5kV至约5.0kV；在一个实施方案中，电压可以设定为4.0kV。源温度可以为约350℃至约600℃；在一个实施方案中，源温度可以设定在550℃。气帘气体(curtain gas)的范围可为约10至约55psi；在一个实施方案中，气帘气体设定在20psi。雾化器和去溶剂化气体的流速可以为约0至约90psi。在一个实施方案中，流速可以设定为75。CAD气体设定可以从高到低；在一个实施方案中，将碰撞活化的解离(CAD)气体设定为中等。去聚集电位可以从小于15V到大于170V。碰撞能量(CE)的范围可以从小于12eV到大于100eV。入口电位(EP)设置可以从小于大约10V到大于10V。碰撞单元出口电位(CXP)设置的范围可以从小于8V到大于14V。
在另一个实例中，仪器可以以负MRM模式操作。离子喷雾电压设置范围可为-0.5kV至-5.5kV；在一个实施方案中，电压可以设定在-4.0kV。在一个实施方案中，电压可以设定为-4.5kV。源温度可以在约350℃至600℃的范围内；在一个实施方案中，源温度可以设定在550℃。气帘气体的范围可以是10至30或另一个适当值；在一个实施方案中，气帘气体可设定为20。雾化器和去溶剂化气体的流速可在40至80或另一适当值的范围内。在一个实施方案中，流速可以设定为70；在另一个实施方案中，流速可以设定为50。在另一个实例中，雾化器气体流速可以设定为60，并且去溶剂化气体流速可以设定为65。CAD气体的范围可以从低到高。在一个实例中，CAD可以设定为，例如中等。在另一个实例中，CAD可以设置为高。
在样品已经电离后，可以分析带正电或带负电的离子以确定质荷比。用于确定质荷比的示例性合适分析仪包括四极分析仪、离子阱分析仪和飞行时间分析仪。可以使用例如选择模式或扫描模式来检测离子。示例性扫描模式包括MRM和选择的反应监测(SRM)。
分析结果可包括由串联MS产生的数据。在示例性实施方案中，串联MS可以是精确质量串联MS。例如，精确质量串联质谱法可以使用四极杆飞行时间(Q-TOF)分析仪。串联MS允许创建表示复杂混合物中化学成分的母子关系的数据结构。该关系可以由树状结构表示，该树状结构示出了母离子和子离子彼此的关系，其中子离子代表母离子的子组分。
例如，初级质谱可包含五种不同的离子，其可表示为五个图形峰。初级MS中的每个离子可以是母离子。每个母离子可以经受二级MS，其产生显示该特定母离子的子离子的质谱。
可延伸母/子关系以描述分离的组分(例如，从色谱状态洗脱的组分)和在初级MS中检测的离子之间的关系，以及待分析的样品与分离的组分之间的关系。
质谱仪通常向用户提供离子扫描(即，具有给定范围内特定质量/电荷的每种离子的相对丰度)。质谱数据可以通过许多方法与原始样品中的分析物的量相关联。在一个实例中，校准标准物用于生成标准曲线(校准曲线)，使得给定离子的相对丰度可以转换成原始分析物的绝对量。在另一个实例中，校准标准可以是外部标准物，并且可以基于从那些标准物生成的离子生成标准曲线，以计算一种或多种分析物的量。在另一个实例中，外部标准物可以是未标记的分析物。
可以将内标添加到校准标准物和/或测试样品中。可以使用内标来说明样品处理过程中分析物的损失，以便获得样品中测量分析物的更准确值。分析物峰面积与校准标准物水平的内标峰面积的比率可用于产生校准曲线和定量样品。一种或多种同位素标记的分析物类似物，例如，N-乙酰基-d3-DL-苏氨酸-d2、苯基乙酰基谷氨酰胺-d5、肌酸酐-d3、L-色氨酸-d5、假尿苷-13C,15N2、赤藓糖醇-13C4、D-阿拉伯糖醇-13C5、肌醇-d6、乙酰基丝氨酸-d3、N-N-乙酰基-L-丙氨酸-d4、3-甲基-L-组氨酸-d3、反式-4-羟基-L-脯氨酸-d3、犬尿氨酸-d6、尿素-13C,15N2、2-(α-D-吡喃甘露糖基)-L-色氨酸-d4、3-吲哚硫酸酯-d4和N,N,N-三甲基-L-丙氨酰基-L-脯氨酸-13C3可用作内标。
可以将分析数据发送到计算机并使用计算机软件进行处理。在一个实例中，使用用于定量的统计回归方法将分析物与内标的峰面积比相对于校准标准物的浓度拟合。在另一个实例中，统计回归是加权线性最小二乘法回归。使用校准曲线计算的斜率和截距可用于计算实验样品中未知的分析物浓度。
在获得一种或多种肾小组分析物的浓度之后，将浓度值输入多变量算法以产生估计的GFR(肾小球滤过率)分数。例如、可以确定两种分析物、三种分析物、四种分析物、五种分析物或六种分析物的浓度，所述分析物选自由以下组成的组：N-乙酰基苏氨酸、苯基乙酰基谷氨酰胺、色氨酸，TMAP、假尿苷和肌酸酐。在一个实例中，临床参数(例如，BUN、SCr、尿白蛋白测量)，肾功能的标志物(例如，β-2微球蛋白、β-TRACE、2-吡喃甘露糖基色氨酸(2-MPT))和/或患者信息(例如，年龄、CKD的家族史、其他风险因素)可以与使用本文描述的方法获得的分析物的浓度值组合使用。
IV.试剂盒
在此描述用于测定选自由以下组成的组的一种或多种肾小组分析物的试剂盒：N-乙酰基苏氨酸、苯基乙酰基谷氨酰胺、色氨酸、TMAP、假尿苷、肌酸酐、内消旋赤藓糖醇、阿拉伯糖醇、肌醇、N-乙酰基丝氨酸、N-乙酰基丙氨酸、3-甲基组氨酸、反式-4-羟基脯氨酸、犬尿氨酸、尿素、C-糖基色氨酸、3-吲哚硫酸酯及其组合，其中，如果一种或多种测定分析物仅为一种分析物，则所述一种分析物不是肌酸酐。例如，试剂盒可以包括包装材料和足以进行一种或多种测定的量的测量量的一种或多种分析物标准物或内标。在示例性实施方案中，内标可以是同位素标记的，试剂盒可以包含预制的流动相溶液，和/或试剂盒可以包含流动相试剂和制备流动相溶液的说明书。试剂盒还可以包括以有形形式记录的说明书(例如，在纸上，例如说明书小册子或电子介质)，用于使用试剂测量一种或多种分析物。
实施例
I.样品制备
A.试剂和仪器
质谱级(98％)甲酸和甲酸铵(>98％)得自Sigma-Aldrich；HPLC级甲醇和乙腈从JTBaker获得；从Fisher Scientific获得6N(认证的)盐酸。来自VWR Scientific的多管涡旋器用于混合。板的离心在Thermo Scientific的Sorvall ST 40R离心机中用3617斗式转子(bucket rotor)进行。人血浆(肝素锂)和血清从Bioreclamation获得。从GenDepot获得牛血清白蛋白(不含脂肪酸)。苯基乙酰基L-谷氨酰胺、N-乙酰基-L-丙氨酸、β-假尿苷-13C,15N2、L-色氨酸-d5、D-阿拉伯糖醇-13C5、赤藓糖醇-13C4、2-(α-D-吡喃甘露糖基)-L-色氨酸-d4和3-吲哚硫酸酯-d4钾盐购自Toronto Research Chemicals；盐酸肌酸酐、L-色氨酸、N-乙酰基-DL-丝氨酸、L-犬尿氨酸、反式-4-羟基-L-脯氨酸、3-甲基-L-组氨酸、D-(+)-阿拉伯糖醇、内消旋-赤藓糖、肌醇、3-吲哚硫酸酯钾盐和尿素购自Sigma-Aldrich；β-假尿苷获自MPBiomedicals；乙酰基-L-苏氨酸购自Santa Cruz Biotechnology；和Nα-(苯基-d5-乙酰基)-L-谷氨酰胺、肌酸酐-d3、N-乙酰基-d3-L-苏氨酸-2,3-d2、N-乙酰基-L-丙氨酸-2,3,3,3-d4、N-乙酰基-L-丝氨酸-2,3,3-d3、反式-4-羟基-L-脯氨酸-2,5,5-d3、NT-甲基-d3-L-组氨酸、肌醇-1,2,3,4,5,6-d6获自CDN同位素；L-犬尿氨酸硫酸盐(sulfate)(环-d4,3,3-d2)和尿素(13C,15N2)得自Cambridge Isotope Laboratories。N,N,N-三甲基-L-丙氨酰基-L-脯氨酸-13C3(13C3-L,L-TMAP)得自Albany Molecular Research。
B.样品制备
样品制备在聚丙烯96孔板中进行。将研究样品、QC样品和校准标准物在冰上解冻并涡旋。从研究样品和QC样品中提取分析物，175μL含有适当内标的乙腈/甲醇/水/甲酸混合物(88/10/2/0.2)的工作内标(WIS)溶液被添加到每个孔中。WIS溶液可以包含一种或多种内标，并且可以包含本文所述的十七种分析物中的每一种的一种或多种内标。通过添加175μL不含内标的乙腈/甲醇/水/甲酸混合物(88/10/2/0.2)来提取样品空白。16种分析物的WIS浓度示于表1中。所有WIS溶液均在乙腈/甲醇/水/甲酸(88/10/2/0.2)的溶液中制备。WIS浓度的确定可以基于例如校准范围内的分析物的浓度。例如，TMAP的WIS浓度可能约为TMAP校准标准物C和D的浓度。
表1.工作内标(WIS)溶液
确定每种分析物的校准范围。对于每种分析物，LLOQ代表校准范围的低端，校准范围的高端由ULOQ表示。本领域普通技术人员将理解如何确定每种分析物的校准范围而无需过多的实验。使用八个校准器(标准物A-H)来覆盖校准范围。每个校准器中的最终分析物浓度列于表2中。校准掺加溶液(Calibration spiking solution)以相应校准浓度的20倍制备。
表2.分析物的校准范围
QC水平基于LLOQ和ULOQ确定。低水平、中等水平和高水平QC样品由适当分析物浓度的人血浆或血清库的组合制备，必要时强化分析物。对于所有分析物，LLOQ样品在不含脂肪酸的BSA溶液(7.5％在PBS中)中制备，其浓度与表2中的标准物A相同。QC样品储存在-80℃。
对于研究样品、QC样品、校准标准物和空白，将25μL提取的样品转移至板的适当孔中。将板密封并在板振荡器上高速混合约2分钟。将板在4℃以4,000rpm离心10分钟；将150μL上清液的等分试样转移到新板上进行LC-MS/MS分析。为了评估样品回收率，采用相当于表2中所示校准标准物E的浓度对中等QC样品进行掺加。标准物E的校准值显示在标题为“E”的列中。储备溶液、校准掺加溶液和内标溶液储存在4℃。
实施例1：色谱纯化和从样品中分离分析物
使用UHPLC开发色谱方法以从单次注射分析一种或多种和至多十种分析物。对于每种色谱方法，将1.0μL最终提取溶液的单个固定等分试样注射到UPLC柱上，用于分析的每个样品。对于色谱方法1、3、5、6、7和8，配备二元溶剂泵部件、冷冻自动进样器(设定在4℃)和柱加热器(设定在60℃)的Agilent 1290Infinity UHPLC系统用于HILIC柱的液相色谱法(Waters ACQUITYBEH Amide，1.7μm，2.1×150mm)。配备二元溶剂泵部件、冷冻自动进样器(设定在4℃)和恒温柱管理器(设置在60℃)的Waters Acquity UPLC系统用于液相色谱法，采用HILIC色谱柱(Waters ACQUITY/>BEH Amide，1.7μm，2.1x150mm)以用于色谱方法2，和采用反相色谱柱(Waters ACQUITY/>BEH C18，1.7μm，2.1x100mm)以用于色谱方法4。每种色谱方法的详细信息(即移动相缓冲液、洗脱梯度、流速、运行时间)在下面举例说明。
A.色谱方法1(5种分析物：N-乙酰基苏氨酸、苯基乙酰基谷氨酰胺、假尿苷、色氨酸、肌酸酐)
在一个实施例中，开发了液相色谱法，用于在相同的注射中纯化和分离一种或多种、两种或更多种、以及最多所有五种选自由以下组成的组的分析物：N-乙酰基苏氨酸、苯基乙酰基谷氨酰胺、假尿苷、色氨酸、肌酸酐及其组合，其中，如果一种或多种测定分析物仅为一种分析物，则所述一种分析物不是肌酸酐。
流动相A是20mM甲酸铵+1％甲酸的水溶液，流动相B是100％乙腈。除非另有说明，否则线性梯度洗脱在12％流动相A(88％流动相B)和550μL/min流速的初始条件下进行。流动相A在1.9min时从最初的12％增加到22％(78％流动相B)，在2.5min时从22％增加到30％(70％流动相B)，在2.7min时从30％增加到42％(58％流动相B)。然后，流动相A在3.4min恢复至12％(88％流动相B)，其中在下一个样品注射之前将其保持0.3min以进行平衡。总运行时间为3.70min。
色谱方法1分离出多个具有良好峰形的至多五种分析物。所得分离的分析物的示例性色谱图显示在图1A-F中。显示了每种分析物的目标峰的大致保留时间。苯基乙酰基谷氨酰胺、假尿苷、色氨酸、N-乙酰基苏氨酸和肌酸酐的近似保留时间(以分钟计)分别为1.11、2.45、2.61、1.43和1.83。
B.色谱方法2(6种分析物：假尿苷、N-乙酰基苏氨酸、内消旋赤藓糖醇、阿拉伯糖醇、肌醇、N-乙酰基丝氨酸)
在另一个实例中，开发了液相色谱法，用于在相同的注射中纯化和分离一种或多种，两种或更多种，以及至多所有六种选自由以下组成的组的分析物：假尿苷、N-乙酰基苏氨酸，内消旋赤藓糖醇、阿拉伯糖醇、肌醇、N-乙酰基丝氨酸及其组合。
流动相A是50mM乙酸铵+0.1％氢氧化铵水溶液，流动相B是100％乙腈。除非另有说明，否则线性梯度洗脱在7％流动相A(93％流动相B)和450μL/min流速的初始条件下进行。流动相A在1.5min时从最初的7％增加到20％(80％流动相B)，在4.7min时从20％增加到30％(70％流动相B)，在5.0min从30％增加到35％(65％流动相B)。然后，流动相A在5.1min恢复至7％(93％流动相B)，其中在注射下一个样品之前将其保持1.9min以进行平衡。总运行时间为7.0min。
色谱方法2分离了多个具有良好峰形的至多六种分析物。所得分离的分析物的示例性色谱图显示在图2A-H中。内消旋赤藓糖醇、N-乙酰基丝氨酸、阿拉伯糖醇、N-乙酰基苏氨酸、肌醇和假尿苷的近似保留时间(以分钟计)分别为2.21、3.30、2.72、2.99、4.59和2.89。
C.色谱方法3(9种分析物：N-乙酰基苏氨酸、苯基乙酰基谷氨酰胺、色氨酸、肌酸酐、N-乙酰基丙氨酸、3-甲基组氨酸、反式-4-羟基脯氨酸、犬尿氨酸、尿素)
在另一个实施例中，开发了液相色谱法，用于在相同的注射中纯化和分离一种或多种，两种或更多种，以及至多所有九种选自由以下组成的组的分析物：N-乙酰基苏氨酸、苯基乙酰基谷氨酰胺、色氨酸，肌酸酐，N-乙酰基丙氨酸、3-甲基组氨酸、反式-4-羟基脯氨酸、犬尿氨酸、尿素及其组合，其中，如果一种或多种测定分析物仅为一种分析物，则所述一种分析物不是肌酸酐。
流动相A是20mM甲酸铵+1％甲酸的水溶液，流动相B是100％乙腈。除非另有说明，否则线性梯度洗脱在12％流动相A(88％流动相B)和500μL/min流速的初始条件下进行。流动相A在1.9min时从最初的12％增加到22％(78％流动相B)，在2.5min时从22％增加到30％(70％流动相B)，在3.1min从30％增加到35％(65％流动相B)，在3.7min从35％增加到38％(62％流动相B)，和在5.0min从38％增加到45％(55％流动相B)，其中将其保持0.5min。然后，流动相A在5.7min恢复至12％(88％流动相B)，在下一个样品注射之前将其保持平衡1.3min以进行平衡。总运行时间为7.0min。
色谱方法3分离了多个具有良好峰形的至多九种分析物。所得分离的分析物的示例性色谱图显示在图3A-I中。尿素、肌酸酐、反式-4-羟基脯氨酸、N-乙酰基丙氨酸、N-乙酰基苏氨酸、3-甲基组氨酸，色氨酸，犬尿氨酸和苯基乙酰基谷氨酰胺的近似保留时间(以分钟计)分别为1.36、1.94、3.74、1.17和1.69。
D.色谱方法4(色氨酸、3-吲哚硫酸酯、C-糖基色氨酸)
在另一个实施例中，开发了液相色谱法，用于在相同的注射中纯化和分离一种或多种，两种或更多种，和最多所有三种选自由以下组成的组的分析物：色氨酸、3-吲哚硫酸酯和C-糖基色氨酸，及其组合。
流动相A为0.1％甲酸水溶液，流动相B为乙腈中0.1％甲酸。线性梯度洗脱在2％流动相B(98％流动相A)和700μL/min流速的初始条件下进行。流动相B在2.5min时从最初的2％增加至90％(10％流动相A)并且保持在90％持续0.3min。然后，流动相B在2.9min时恢复至2％(98％流动相A)，其中在注射下一个样品之前将其保持0.4min以进行平衡。总运行时间为3.30min。
色谱方法4分离了多个具有良好峰形的至多三种分析物。所得分离的分析物的示例性色谱图显示在图4A-H中。血清和血浆中近似保留时间(以分钟计)分别为：C-糖基色氨酸为0.91和0.95，色氨酸为1.32和1.33，3-吲哚硫酸酯为1.45。
E.色谱方法5(6种分析物：N-乙酰基苏氨酸、苯基乙酰基谷氨酰胺、假尿苷、色氨酸、TMAP、肌酸酐)
在另一个实例中，开发了液相色谱法，用于在相同的注射中纯化和分离一种或多种，两种或更多种，和最多所有六种选自由以下组成的组的分析物：N-乙酰基苏氨酸、苯基乙酰基谷氨酰胺、假尿苷、色氨酸、TMAP、肌酸酐及其组合。如果一种或多种测定分析物仅为一种分析物，则所述一种分析物不是肌酸酐。
流动相A是20mM甲酸铵+1％甲酸的水溶液，流动相B是100％乙腈。线性梯度洗脱在12％流动相A(88％流动相B)和550μL/min流速的初始条件下进行。流动相A在1.9min时从最初的12％增加到22％(78％流动相B)，在2.5min时从22％增加到30％(70％流动相B)，并且在2.7min时从30％增加到42％(58％流动相B)。然后，流动相A在3.4min恢复至12％(88％流动相B)，在下一个样品注射之前将其保持0.3min以进行平衡。总运行时间为3.70min。
色谱方法5分离了多个具有良好峰形的至多六种分析物。所得分离的分析物的示例性色谱图显示在图5中。对于苯基乙酰基谷氨酰胺、肌酸酐、N-乙酰基苏氨酸、色氨酸、假尿苷和TMAP，近似保留时间(以分钟计)分别为1.40、1.86、2.14、2.61、2.71和3.16。
F.色谱方法6(10：N-乙酰基苏氨酸、内消旋赤藓糖醇、阿拉伯糖醇、肌醇、3-吲哚硫酸酯、色氨酸、苯基乙酰基谷氨酰胺、肌酸酐、假尿苷、N-乙酰基丝氨酸)
在另一个实施例中，开发了液相色谱法，用于在相同的注射中纯化和分离一种或多种，两种或更多种，和最多所有十种选自由以下组成的组的分析物：N-乙酰基苏氨酸、内消旋赤藓糖醇、阿拉伯糖醇、肌醇、3-吲哚硫酸酯、色氨酸、苯基乙酰基谷氨酰胺、肌酸酐、假尿苷和N-乙酰基丝氨酸、及其组合，其中，如果一种或多种测定分析物仅为一种分析物，则所述一种分析物不是肌酸酐。
流动相A是100mM乙酸铵+0.2％氢氧化铵水溶液，流动相B是100％乙腈。线性梯度洗脱在7％流动相A(93％流动相B)和500μL/min流速的初始条件下进行。流动相A在1.5min时从最初的7％增加到20％(80％流动相B)，在4.7min时从20％增加到30％(70％流动相B)，在5.0min从30％增加到35％(65％流动相B)。然后，流动相A在5.1min恢复至7％(93％流动相B)，其中在注射下一个样品之前将其保持1.9min以进行平衡。总运行时间为7.0min。
色谱方法6分离了多个具有良好峰形的至多十种分析物。得到的分离的分析物的示例性色谱图显示在图6中。对于内消旋赤藓糖醇、阿拉伯糖醇、肌醇、3-吲哚硫酸酯、色氨酸、苯基乙酰基谷氨酰胺、肌酸酐、假尿苷、N-乙酰基苏氨酸和N-乙酰基丝氨酸，近似保留时间(以分钟计)分别为2.35、2.87、4.85、0.78、3.20、2.82、2.40、3.00、3.30和3.69。
G.色谱方法7(5：阿拉伯糖醇、苯基乙酰基谷氨酰胺、肌酸酐、假尿苷、N-乙酰基苏氨酸)
在另一个实施例中，开发了液相色谱法，用于在相同的注射中纯化和分离一种或多种，两种或更多种，以及至多所有五种选自由以下组成的组的分析物：阿拉伯糖醇、苯基乙酰基谷氨酰胺、肌酸酐、假尿苷，N-乙酰基苏氨酸及其组合，其中，如果一种或多种测定分析物仅为一种分析物，则所述一种分析物不是肌酸酐。
流动相A是100mM乙酸铵+0.2％氢氧化铵水溶液，流动相B是100％乙腈。线性梯度洗脱在7％流动相A(93％流动相B)和800μL/min流速的初始条件下进行。流动相A在0.9min时从最初的7％增加到20％(80％流动相B)，在1.9min时从20％增加到25％(75％流动相B)，在2.1min从25％增加到30％(70％流动相B)。然后，流动相A在2.2min恢复至7％(93％流动相B)，其中在注射下一个样品之前将其保持0.5min以进行平衡。总运行时间为2.7min。
色谱方法7分离了多个具有良好峰形的至多五种分析物。所得分离的分析物的示例性色谱图显示在图7中。对于阿拉伯糖醇、苯基乙酰基谷氨酰胺、肌酸酐、假尿苷和N-乙酰基苏氨酸，近似保留时间(以分钟计)分别为1.74、1.74、1.48、1.84和1.98。
H.色谱方法8(6：肌醇、色氨酸、苯基乙酰基谷氨酰胺、肌酸酐、假尿苷、N-乙酰基苏氨酸)
在另一个实施例中，开发了液相色谱法，用于在相同的注射中纯化和分离一种或多种，两种或更多种，和最多所有六种分析物，所述分析物选自由以下组成的组：肌醇、色氨酸、苯基乙酰基谷氨酰胺、肌酸酐、假尿苷、N-乙酰基苏氨酸及其组合，其中，如果一种或多种测定分析物仅为一种分析物，则所述一种分析物不是肌酸酐。
流动相A是100mM乙酸铵+0.2％氢氧化铵水溶液，流动相B是100％乙腈。线性梯度洗脱在7％流动相A(93％流动相B)和800μL/min流速的初始条件下进行。流动相A在0.9min时从最初的7％增加到22％(78％流动相B)，在2.5min时从22％增加到30％(70％流动相B)，在2.7min时从30％增加到35％(65％流动相B)。然后，流动相A在2.8min时恢复至7％(93％流动相B)，其中在注射下一个样品之前将其保持0.4min以进行平衡。总运行时间为3.2min。
色谱方法8分离了多个具有良好峰形的至多六种分析物。得到的分离的分析物的示例性色谱图显示在图8中。对于肌醇、色氨酸、苯基乙酰基谷氨酰胺、肌酸酐、假尿苷和N-乙酰基苏氨酸，近似保留时间(以分钟计)分别为2.64、1.83、1.64、1.40、1.74和1.85。
实施例2：分析物的MS/MS测量
如下文方法中所述，使用具有Turbo V源(ESI)的AB Sciex QTrap 5500质谱仪对样品提取物进行质谱法。从仪器获取原始数据并将其使用Analyst 1.6.2软件(AB Sciex)处理。为了定量，通过加权(1/x2)线性最小二乘法回归将分析物与内标的峰面积比相对于校准标准物的浓度拟合。得到的校准曲线的斜率和截距用于计算实验样品中的未知浓度。
A.MS/MS方法1
开发了一种方法，用于在相同的注射中检测一种或多种，两种或更多种，以及至多所有五种选自由以下组成的组的分析物的水平：假尿苷、N-乙酰基苏氨酸、苯基乙酰基谷氨酰胺、色氨酸、肌酸酐及其组合，其中，如果一种或多种测定分析物仅为一种分析物，则所述一种分析物不是肌酸酐。使用相同的MS/MS方法在相同的注射中检测一种或多种，两种或更多种，以及至多所有六种选自由以下组成的组的分析物的水平：假尿苷、N-乙酰基苏氨酸、苯基乙酰基谷氨酰胺、色氨酸、TMAP、肌酸酐及其组合。
将来自实施例1，色谱方法1中描述的色谱柱的洗脱液直接并自动引入质谱仪的电喷雾源中。在另一个实施例中，将来自实施例1，色谱方法5中描述的色谱柱的洗脱液直接并自动引入质谱仪的电喷雾源中。乙腈:水(50:50)用于针头清洗。该仪器以正多反应监测(MRM)模式操作。离子喷雾电压设定为4.0kV，源温度设定为550℃，气帘气体(例如氮气)设定为20psi，雾化器和去溶剂化气体(例如氮气)流速设定为75psi，碰撞活化的解离(CAD)气体(例如，氮气)设定为中等。
从仪器获取原始数据并将其使用Analyst 1.6.2软件(AB Sciex)处理。为了定量，通过加权(1/x2)线性最小二乘法回归将分析物与内标的峰面积比相对于校准标准物的浓度拟合。得到的校准曲线的斜率和截距用于计算实验样品中的未知浓度。为了定量假尿苷、N-乙酰基苏氨酸、苯基乙酰基谷氨酰胺、色氨酸和肌酸酐以及TMAP而生成的示例性离子列于表3中。母离子列在标题为“母离子(m/z)”的列下，并且在该实施例中用于定量的子离子列在标记为“用于定量的子离子(m/z)”的列中。在该实施例中，用于定量的子离子的选择针对分析测量范围内的灵敏度进行了优化；然而，可以选择另外的子离子来代替或增加实施例中用于定量的子离子。
表3.在正电离模式下测量的分析物的母和子离子质荷比(m/z)
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图9-14显示了由表3中所示的母离子的碎裂产生的质谱。
在正电离模式中产生的用于定量N-乙酰基苏氨酸的MRM转变包括通过使具有约162.0±0.5的m/z的母离子碎裂而产生的那些，以产生m/z为约74.1±0.5、144.0±0.5、126.1±0.5、119.9±0.5、116.1±0.5、102.0±0.5、97.9±0.5、84.0±0.5、70.0±0.5、57.0±0.5、56.0±0.5、43.0±0.5、和28.1±0.5的子离子。由N-乙酰基苏氨酸的串联质谱碎裂产生的这些母离子和子离子峰在图9中示出。可以选择任何子离子用于定量。在该实施例中，用于定量N-乙酰基苏氨酸的子离子具有约74.1±0.5的m/z。确定N-乙酰基苏氨酸的校准范围为0.0200至2.00μg/mL。
在正电离模式中产生的用于定量苯基乙酰基谷氨酰胺的MRM转变包括通过使具有约265.0±0.5的m/z的母离子碎裂产生的那些，以产生m/z为约91.0±0.5、248.1±0.5、219.1±0.5、147.1±0.5、136.0±0.5、130.0±0.5、129.1±0.5、101.1±0.5、84.0±0.5、83.0±0.5、65.0±0.5、56.0±0.5、50.9±0.5、44.0±0.5、40.9±0.5、39.1±0.5、和28.0±0.5的子离子。由苯基乙酰基谷氨酰胺的串联质谱碎裂产生的这些母离子和子离子峰在图10中示出。可以选择任何子离子用于定量。在该实施例中，用于定量苯基乙酰基谷氨酰胺的子离子具有约91.0±0.5的m/z。苯基乙酰基谷氨酰胺的校准范围确定为0.100至20.0μg/mL。
在正电离模式产生的用于定量肌酸酐的MRM转变包括通过使约113.9±0.5的m/z的母离子碎裂产生的那些，以产生m/z为约43.0±0.5、86.0±0.5、72.0±0.5、44.1±0.5、42.0±0.5、和28.1±0.5的子离子。由肌酸酐的串联质谱碎裂产生的这些母离子和子离子峰在图11中示出。可以选择任何子离子用于定量。在该实施例中，用于定量肌酸酐的子离子具有约43.0±0.5的m/z。肌酸酐的校准范围确定为2.00至200μg/mL。
在正电离模式中产生的用于定量色氨酸的MRM转变包括通过使约205.0±0.5的m/z的母离子碎裂产生的那些，以产生m/z为约146.0±0.5、191-193±0.5、173-174±0.5、163-164±0.5、144.8-151.2±0.5、117.1-122.1±0.5、102.9-110.1±0.5、89.9-96.0±0.5、74.1-81.1±0.5、60.9-68.9±0.5、50.1-54.1±0.5、38.0-43.1±0.5、和28.0-29.0±0.5的子离子。由色氨酸的串联质谱碎裂产生的这些母离子和子离子峰在图12中示出。可以选择任何子离子用于定量。在该实施例中，用于定量色氨酸的子离子具有约146.0±0.5的m/z。色氨酸的校准范围确定为1.00至100μg/mL。
在正电离模式中产生的用于定量假尿苷的MRM转变包括通过使约244.9±0.5的m/z的母离子碎裂而产生的那些，以产生m/z为约191.0±0.5、209.0±0.5、179.0±0.5、167.0±0.5、163.0±0.5、154.8±0.5、151.0±0.5、148.0±0.5、139.0±0.5、125.0±0.5、120.0±0.5、111.8±0.5、109.8±0.5、107.8±0.5、96.0±0.5、92.0±0.5、84.0±0.5、82.0±0.5、80.0±0.5、68.0±0.5、65.2±0.5、55.0±0.5、54.0±0.5、43.0±0.5、41.0±0.5、和39.0±0.5的子离子。由假尿苷的串联质谱碎裂产生的这些母离子和子离子峰在图13中示出。可以选择任何子离子用于定量。在该实施例中，用于定量假尿苷的子离子具有约191.0±0.5的m/z。假尿苷的校准范围确定为10.0至400μg/mL。
在正电离模式中为定量TMAP产生的MRM转变包括通过使约229.1±0.5的m/z的母离子碎裂产生的那些，以产生m/z约为170.1±0.5、142.2±0.5、126.0±0.5、124.0±0.5、116.0±0.5、114.0±0.5、98.0±0.5、96.0±0.5、70.0±0.5、68.0±0.5、60.0±0.5、59.1±0.5、58.1±0.5、54.9±0.5、227.0±0.5、181.0±0.5、159.0±0.5、133.2±0.5、114.8±0.5、112.9±0.5、105.8±0.5、89.1±0.5、71.0±0.5、69.0±0.5、和45.1±0.5的子离子。可以选择任何子离子用于定量。例如，m/z为约58.1±0.5、70.0±0.5、114.0±0.5或142.2±0.5的子离子可用于TMAP的定量。由TMAP的串联质谱碎裂产生的这些母离子和子离子峰在图14中示出。
B.MS/MS方法2
在另一个实施例中，开发了一种方法以在相同的注射中检测一种或多种，两种或更多种，以及至多所有六种选自由以下组成的组的分析物的水平：假尿苷、N-乙酰基苏氨酸、内消旋赤藓糖醇、阿拉伯糖醇、肌醇、N-乙酰基丝氨酸及其组合。将来自实施例1，色谱方法2中描述的色谱柱的洗脱液直接并自动引入质谱仪的电喷雾源中。水:乙腈(90:10)用于强/密封洗涤；乙腈:水(90:10)用于弱洗涤。
仪器以负MRM模式操作。离子喷雾电压设定为-4.0kV，源温度设定为550℃，气帘气体设定为20psi；雾化器和去溶剂化气体流速设定为70psi，并且CAD气体设定为中等。
表4中显示了用于定量假尿苷、N-乙酰基苏氨酸、内消旋赤藓糖醇、阿拉伯糖醇、肌醇和N-乙酰基丝氨酸的示例性离子。母离子列在标题为“母离子(m/z)”的列下，并且在该实施例中用于定量的子离子列在标记为“用于定量的子离子(m/z)”的列中。在该实施例中，用于定量的子离子的选择针对分析测量范围内的灵敏度进行了优化；然而，可以选择任何子离子来代替或增加用于实施例中的定量的子离子。
表4.用于定量分析物的离子
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C.MS/MS方法3
在另一个实施例中，开发了一种方法以在相同的注射中检测一种或多种，两种或更多种，以及至多所有九种分析物的水平，所述分析物选自由以下组成的组：N-乙酰基苏氨酸、苯基乙酰基谷氨酰胺、色氨酸、肌酸酐、N-乙酰基丙氨酸、3-甲基组氨酸、反式-4-羟基脯氨酸、犬尿氨酸、尿素及其组合，其中，如果一种或多种测定分析物仅为一种分析物，则所述一种分析物不是肌酸酐。将来自实施例3，色谱方法3中描述的色谱柱的洗脱液直接并自动引入质谱仪的电喷雾源中。水:乙腈(90:10)用于强/密封洗涤；乙腈:水(90:10)用于弱洗涤。该仪器以正多反应监测(MRM)模式操作。离子喷雾电压设定为4.0kV，源温度设定为550℃，气帘气体(例如氮气)设定为20psi，雾化器和去溶剂化气体(例如氮气)流速设定为75psi，碰撞活化的解离(CAD)气体(例如，氮气)设定为中等。
表5中显示了用于定量N-乙酰基苏氨酸、苯基乙酰基谷氨酰胺、色氨酸、肌酸酐、N-乙酰基丙氨酸、3-甲基组氨酸、反式-4-羟基脯氨酸、犬尿氨酸和尿素的示例性离子。母离子是在标题为“母离子(m/z)”的列下列出，并且在该实施例中用于定量的子离子列在标记为“用于定量的子离子(m/z)”的列中。在该实施例中，用于定量的子离子的选择针对分析测量范围内的灵敏度进行了优化；然而，可以选择任何子离子来代替或增加用于实施例中的定量的子离子。
表5.用于定量分析物的离子
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D.MS/MS方法4
在另一个实施例中，开发了一种方法以在相同的注射中检测一种或多种，两种或更多种，和至多所有三种分析物的水平，所述分析物选自由以下组成的组：色氨酸、C-糖基色氨酸和3-吲哚硫酸酯。将来自实施例1，色谱方法4中描述的色谱柱的洗脱液直接并自动引入质谱仪的电喷雾源中。甲醇用于针头清洗。仪器以负MRM模式操作。离子喷雾电压设定为-4.5kV，源温度设定为550℃，气帘气体设定为20psi；雾化器和去溶剂化气体流速分别设定为60psi和65psi，CAD气体设定为高。
表6中显示了可用于定量色氨酸、C-糖基色氨酸和3-吲哚硫酸酯的示例性离子对。母离子列在标题为“母离子(m/z)”的列下，并且在该实施例中用于定量的子离子列在标记为“用于定量的子离子(m/z)”的列中。在该实施例中，用于定量的子离子的选择针对分析测量范围内的灵敏度进行了优化；然而，可以选择任何子离子来代替或增加用于实施例中的定量的子离子。
表6.用于定量分析物的离子
D.MS/MS方法5
在另一个实施例中，开发了一种方法以在相同的注射中检测一种或多种，两种或更多种，和至多所有十种分析物的水平，所述分析物选自由以下组成的组：内消旋赤藓糖醇、D-阿拉伯糖醇、肌醇、3-吲哚硫酸酯、L-色氨酸、苯基乙酰基谷氨酰胺、肌酸酐、假尿苷、N-乙酰基苏氨酸和N-乙酰基丝氨酸、及其组合。将来自实施例1，色谱方法6中描述的色谱柱的洗脱液直接并自动引入质谱仪的电喷雾源中。
在另一个实施例中，将来自实施例1，色谱方法7中描述的色谱柱的洗脱液直接并自动引入质谱仪的电喷雾源中。所述方法在相同的注射中检测一种或多种，两种或更多种，以及至多所有五种选自由以下组成的组的分析物的水平：D-阿拉伯糖醇、苯基乙酰基谷氨酰胺、肌酸酐、假尿苷、N-乙酰基苏氨酸及其组合，其中，如果一种或多种测定分析物仅为一种分析物，则所述一种分析物不是肌酸酐。
在另一个实施例中，将来自实施例1，色谱方法8中描述的色谱柱的洗脱液直接并自动引入质谱仪的电喷雾源中。所述方法在相同的注射中检测一种或多种，两种或更多种以及最多所有六种分析物的水平，所述分析物选自由以下组成的组：肌醇、L-色氨酸、苯基乙酰基谷氨酰胺、肌酸酐、假尿苷、N-乙酰基苏氨酸及其组合，其中，如果一种或多种测定分析物仅为一种分析物，则所述一种分析物不是肌酸酐。乙腈:水(50:50)用于针头清洗。仪器以负MRM模式操作。离子喷雾电压设定为-4.5kV，源温度设定为550℃，并且气帘气体设定为20psi；雾化器和去溶剂化气体流速设定为50psi，并且CAD气体设定为中等。
可用于定量内消旋赤藓糖醇、D-阿拉伯糖醇、肌醇、3-吲哚硫酸酯、L-色氨酸、苯基乙酰基谷氨酰胺、肌酸酐、假尿苷、N-乙酰基苏氨酸和N-乙酰基丝氨酸的示例性离子对显示于表7。母离子列在标题为“母离子(m/z)”的列下，并且在该实施例中用于定量的子离子列在标记为“用于定量的子离子(m/z)”的列中。在该实施例中用于定量的子离子的选择针对分析测量范围内的灵敏度进行了优化；然而，可以选择任何子离子来代替或增加用于实施例中的定量的子离子。
表7.用于定量分析物的离子
实施例3：方法验证
A.色谱方法1和MS/MS法1
色谱方法1和MS/MS方法1的组合的分析性能导致在单次注射中定量多个至多五种分析物，运行时间为3.7分钟。
在血浆和血清中的三个QC水平(低、中和高)评估测量多个五种分析物的方法的精密度。在20天内每天两次运行，分析每个基质的每个QC水平的三个重复，总共40次运行。每个QC水平总共120个重复包括在每个基质的每个分析物的日间CV计算中。血浆中每个QC水平的日间精密度小于6.3％，血清中每个QC水平的日间精密度小于7.1％。结果显示在表8中。对于N-乙酰基苏氨酸、肌酸酐、假尿苷和色氨酸，在100倍范围内观察到线性响应(R2>0.98)，并且对于苯基乙酰基谷氨酰胺，观察到超过200倍范围的线性响应。基于超过1,000个血浆和血清样品的分析选择校准范围。
表8.血浆和血清中多个分析物的日间精密度。
评估血清和血浆中稀释QC的准确度和精密度，以准确测量具有高于ULOQ的分析物值的样品(即，在校准范围之外)。通过用不含脂肪酸的BSA溶液稀释高QC基质5倍来制备稀释QC。在5天内每天两次运行，分析每个基质的稀释QC的三个重复，总共10次运行。在日间准确度和精密度计算中总共包括30个重复。血清中的日间准确度(与测量的高QC值相比)大于94.5％，日间精密度小于7.6％；血浆的日间准确度大于94.7％，日间精密度小于4.4％。结果列于表9中。
表9.5X稀释QC的日间准确度和精密度
评估了LLOQ的精密度。每种分析物的信噪比大于5：1。在15天内每天两次运行，分析LLOQ样品的三次重复，总共30次运行。在每个分析物的日间％CV计算中包括总共90个LLOQ重复。所有日内和日间精密度均低于2.8％CV；数据显示在表10中。这些结果表明在下限定量多种分析物是高度精确的。
表10.LLOQ的日内和日间精密度。
为了评估提取过程中分析物的回收率，血清和血浆中的QC样品用已知浓度的分析物强化。提取掺加QC样品的六个重复并将其与常规QC样品一起分析三次。在减去掺加QC样品中的量后，计算掺加量的回收率。对于五种分析物，测定五种分析物的回收率在血清中为97.4％至113％，在血浆中为103％至110％。数据列于表11。
表11.分析物的回收率
为了评估样品类型对分析物定量的干扰，使用内标溶液进行柱后输注实验，同时分析10个单独批次的不含内标的提取的血浆和血清样品。监测内标转变并观察分析物保留时间的抑制/增强水平。色氨酸在保留区域显示出基质效应，并且恰在抑制之前洗脱，其似乎超过未受影响信号的25％。然而，由于该测定中的共洗脱内标物是同位素标记的，因此对于分析物和内标，任何温和的样品类型效应应该类似地发生。通过使用分析物与内标的峰面积比进行定量，因此在最终计算中补偿样品类型效应。
还评估了黄疸、脂质血症、分析物的已知异构体和药物(包括他汀类、NSAID、止痛药、抗组胺药和抗糖尿病药)的干扰。色谱方法1和MS/MS方法1被确定为不受测试干扰条件的干扰。
B.色谱方法2和MS/MS法2
色谱方法2和MS/MS方法2的组合的分析性能导致在单次注射中多个至多六种分析物的定量，所述分析物选自由以下组成的组：假尿苷、N-乙酰基苏氨酸、内消旋赤藓糖醇、阿拉伯糖醇、肌醇和N-乙酰基丝氨酸，运行时间为7.0分钟。
在代表性的血浆和血清批次中评估用于测量多个六种分析物的方法的精密度。在三次运行中分析12次血浆重复和6次血清重复。血浆中的运行间精密度小于7.3％，血清中精密度小于20％。结果列于表12中。
表12.血浆和血清中多个分析物的运行间精密度。
评估了LLOQ的精密度和准确度。每种分析物的信噪比均大于5：1。在三次运行中分析LLOQ样品的六次重复。对于每种基质，每个分析物的日间％RSD和准确度计算中包括总共18个LLOQ重复。血浆的运行间精密度小于18.0％，血清运行间精密度小于13％。血浆的运行间准确度为98.7-104％，血清的运行间准确度为95.7-101.1％。数据如表13所示。
表13.LLOQ的运行间精密度和准确度。
为了评估提取过程中分析物的回收率，血清和血浆中的QC样品用已知浓度的分析物强化。提取掺加QC样品的六个重复并将其与常规QC样品一起分析三次。在减去掺加QC样品中的量后计算掺加量的回收率。对于六种分析物，六种分析物的回收率在血浆中测定为80.4％至97.5％，在血清中测定为75.6％至96.0％。数据列于表14。
表14.分析物的回收率
C.色谱方法3和MS/MS法3
色谱方法3和MS/MS方法3的组合的分析性能导致在单次注射中多个至多九种分析物的定量，所述分析物选自由以下组成的组：N-乙酰基苏氨酸、苯基乙酰基谷氨酰胺、色氨酸、肌酸酐、N-乙酰基丙氨酸、3-甲基组氨酸，反式-4-羟基脯氨酸、犬尿氨酸和尿素，运行时间为7.0分钟。
在代表性的血浆和血清批次中评估用于测量多个九种分析物的方法的精密度。在三次运行中分析12次血浆重复和6次血清重复。血浆中的运行间精密度小于6.2％，血清中的运行间精密度小于6.0％。结果列于表15中。
表15.血浆和血清中多个分析物的运行间精密度。
评估了LLOQ的精密度和准确度。每种分析物的信噪比均大于5：1。在三次运行中分析LLOQ样品的六次重复。对于每种基质，每个分析物的日间％RSD和准确度计算中包括总共18个LLOQ重复。血浆的运行间精密度小于14.4％，血清的运行间精密度小于9.5％。血浆的运行间准确度为91.7-102％，血清的运行间准确度为92.6-101.9％。数据如表16所示。
表16.LLOQ的运行间精密度和准确度。
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为了评估提取过程中分析物的回收率，血清和血浆中的QC样品用已知浓度的分析物强化。提取掺加QC样品的六个重复并将其与常规QC样品一起分析三次。在减去掺加QC样品中的量后计算掺加量的回收率。对于9种分析物，9种分析物的回收率在血浆中测定为86.1％至96.4％，在血清中测定为91.5％至98.3％。数据列于表17。
表17.分析物的回收率
D.色谱方法4和MS/MS法4
色谱方法4和MS/MS方法4的组合的分析性能导致在单次注射中多个至多三种分析物的定量，所述分析物选自由以下组成的组：色氨酸、C-糖基色氨酸和3-吲哚硫酸酯，运行时间为3.30分钟。
在代表性的血浆和血清批次中评估测量色氨酸和/或3-吲哚硫酸酯的方法的精密度。在三次运行中分析12次血浆重复和6次血清重复。血浆中的运行间精密度小于4.4％，血清中的运行间精密度小于5.8％。结果列于表18中。
表18.血浆和血清中多种分析物的运行间精密度。
评估了LLOQ的精密度和准确度。每种分析物的信噪比均大于5：1。在三次运行中分析LLOQ样品的六次重复。对于每种基质，每个分析物的日间％RSD和准确度计算中包括总共18个LLOQ重复。血浆的运行间精密度小于7.8％，血清的运行间精密度小于8.3％。血浆的运行间准确度在106-107％之间，血清的运行间准确度在93.5-94.2％之间。数据显示在表19中。
表19.LLOQ的内部运行精密度和准确度。
为了评估提取过程中分析物的回收率，血清和血浆中的QC样品用已知浓度的分析物强化。提取掺加QC样品的六个重复并将其与常规QC样品一起分析三次。在减去掺加QC样品中的量后计算掺加量的回收率。色氨酸的回收率在血浆中测定为97.7％，在血清中测定为90.9％；3-吲哚硫酸酯的回收率在血浆中测定为94.3％和在血清中测定为96.3％。
E.色谱方法6和MS/MS法5
色谱方法6和MS/MS方法5的组合的分析性能导致定量单次注射中多个至多10种分析物，所述分析物选自由以下组成的组：内消旋赤藓糖醇、D-阿拉伯糖醇、肌醇、3-吲哚硫酸酯、L-色氨酸、苯基乙酰基谷氨酰胺、肌酸酐、假尿苷、N-乙酰基苏氨酸和N-乙酰基丝氨酸，运行时间为7.0分钟。
在代表性批次的血浆和血清中评估测量多个十种分析物的方法的精密度。在三次运行中分析12次血浆和血清重复。结果列于表20中。
表20.血浆和血清中多种分析物的运行间精密度。
为了评估提取过程中分析物的回收率，血清和血浆中的QC样品用已知浓度的分析物强化。提取掺加QC样品的六个重复并将其与血浆和血清中的六个常规QC重复样品一起分析。在减去掺加QC样品中的量后计算掺加量的回收率。确定10种分析物的回收率在血浆和血清中大于90％。
F.色谱方法7和MS/MS法5
色谱方法7和MS/MS方法5的组合的分析性能导致定量单次注射中多个至多五种分析物，所述分析物选自由以下组成的组：阿拉伯糖醇、苯基乙酰基谷氨酰胺、肌酸酐、假尿苷、N-乙酰基苏氨酸，运行时间为2.7分钟。
在代表性批次的血浆和血清中评估测量多个五种分析物的方法的精密度。在三次运行中分析12次血浆和血清重复。结果列于表21中。
表21.血浆和血清中多个分析物的运行间精密度。
为了评估提取过程中分析物的回收率，血清和血浆中的QC样品用已知浓度的分析物强化。提取掺加QC样品的六个重复并将其与血浆和血清中的六个常规QC重复样品一起分析。在减去掺加QC样品中的量后计算掺加量的回收率。在血浆和血清中测定分析物苯基乙酰基谷氨酰胺、肌酸酐和假尿苷的回收率大于90％；确定分析物阿拉伯糖醇和N-乙酰基苏氨酸的回收率大于85％。
G.色谱方法8和MS/MS法5
色谱方法8和MS/MS方法5的组合的分析性能导致单次注射中多个至多六种分析物的定量，所述分析物选自由以下组成的组：肌醇、色氨酸、苯基乙酰基谷氨酰胺、肌酸酐、假尿苷、N-乙酰基苏氨酸，运行时间为3.2分钟。
在代表性批次的血浆和血清中评估用于测量多个六种分析物的方法的精密度。在三次运行中分析12次血浆和血清重复。结果列于表22中。
表22.血浆和血清中多个分析物的运行间精密度。
为了评估提取过程中分析物的回收率，血清和血浆中的QC样品用已知浓度的分析物强化。提取掺加QC样品的六个重复并将其与血浆和血清中的六个常规QC重复样品一起分析。在减去掺加QC样品中的量后计算掺加量的回收率。确定六种分析物的回收率在血浆和血清中大于90％。
附录A
表A
针对方法1显示了2、3和4种分析物的组合
针对方法5显示了2种、3种、4种和5种分析物的组合
针对方法2、3、4、6、7和8显示了2种分析物的组合。
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Claims (18)

1.通过质谱法在单次注射中检测和确定样品中的五种分析物的量的方法，其中所述五种分析物选自由以下组成的组：N-乙酰基苏氨酸、苯基乙酰基谷氨酰胺、色氨酸、肌酸酐、和假尿苷，所述方法包括：
a)在适于从五种分析物中的每一种产生可通过质谱法检测的一种或多种离子的条件下使样品经受电离源处理，其中分析物在电离之前不衍生化；
b)通过质谱法测量来自五种分析物中的每一种的一种或多种离子的量，其中用于确定五种分析物中的每一种的量的一种或多种离子是选自下表中的离子的一种或多种离子
；和
c)使用测量的一种或多种离子的量来确定样品中五种分析物中每一种的量。
2.权利要求1的方法，其中所述方法进一步检测和确定一种或多种选自由以下组成的组的分析物的量：TMAP、内消旋赤藓糖醇、阿拉伯糖醇、肌醇、N-乙酰基丝氨酸、N-乙酰基丙氨酸、3-甲基组氨酸、反式-4-羟基脯氨酸、犬尿氨酸、尿素、C-糖基色氨酸、3-吲哚硫酸酯及其组合。
3.权利要求1-2中任一项的方法，其中质谱仪以正模式操作。
4.权利要求3的方法，其中所述方法进一步检测和确定一种或多种选自由以下组成的组的分析物的量：TMAP、N-乙酰基丙氨酸、3-甲基组氨酸、反式-4-羟基脯氨酸、犬尿氨酸、尿素及其组合。
5.权利要求1-2中任一项的方法，其中质谱仪以负模式操作。
6.权利要求1-2和4中任一项的方法，其中所述样品在经受电离源处理之前通过液相色谱法纯化。
7.权利要求6的方法，其中所述液相色谱法选自由以下组成的组：高效液相色谱法、超高效液相色谱法和湍流液相色谱法。
8.权利要求1-2、4和7中任一项的方法，其中所述样品在经受电离源处理之前通过高效液相色谱法或超高效液相色谱法纯化。
9.权利要求1-2、4和7中任一项的方法，其中使用内标来确定样品中一种或多种分析物的量。
10.权利要求9的方法，其中所述内标包括待测量的一种或多种分析物中的至少一种的同位素标记的类似物。
11.权利要求1-2、4、7和10中任一项的方法，其中所述样品选自由以下组成的组：血液、血浆和血清。
12.权利要求1-2、4、7和10中任一项的方法，其中运行时间为7分钟或更短。
13.权利要求12的方法，其中所述运行时间为4分钟或更短。
14.权利要求1-2、4、7、10和13中任一项的方法，其中所述质谱法是串联质谱法。
15.权利要求1-2、4、7、10和13中任一项的方法，其中所述方法进一步检测和确定肌醇的量。
16.权利要求1-2、4、7、10和13中任一项的方法，其中所述方法进一步检测和确定内消旋赤藓糖醇、阿拉伯糖醇、肌醇、3-吲哚硫酸酯和N-乙酰基丝氨酸的量。
17.用于进行权利要求1的方法的试剂盒，其包含一种或多种同位素标记的类似物作为内标，以及包装材料和使用该试剂盒的说明书，所述内标用于选自由以下组成的组的五种分析物中的每一种：N-乙酰基苏氨酸、假尿苷、苯基乙酰基谷氨酰胺、色氨酸和肌酸酐。
18.权利要求17所述的试剂盒，其中所述一种或多种内标包括N-乙酰基-d3-DL-苏氨酸-d2、13C3-L,L-TMAP、苯基乙酰基谷氨酰胺-d5、L-色氨酸-d5、肌酸酐-d3、赤藓糖醇-13C4、D-阿拉伯糖醇-13C5、肌醇-d6、乙酰基丝氨酸-d3、N-乙酰基-L-丙氨酸-d4、3-甲基-L-组氨酸-d3、反式-4-羟基-L-脯氨酸-d3、犬尿氨酸-d6、尿素-13C,15N2、假尿苷-13C15N2、2-(α-D-吡喃甘露糖基)-L-色氨酸-d4或3-吲哚硫酸酯-d4。
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