CN111007173A - 吲哚胺2，3-二氧化酶抑制剂的筛选方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种吲哚胺2，3‑二氧化酶抑制剂的筛选方法，包括以下步骤：标准品配制：配制色氨酸标准溶液和犬尿氨酸标准溶液；分别取标准品加入到细胞培养基中得到做标准曲线的标准溶液；RapidFire液质联用检测标准溶液样品的峰面积，采用标准溶液的浓度和相应的峰面积信号做标准曲线；将色氨酸与细胞加入细胞培养基中，并加入待筛选药物，孵育一段时间，加入乙腈或甲醇处理待测样品，待测样品经高速离心机离心，取上清液进行上机检测，根据所得标准曲线，计算样品中色氨酸和犬尿氨酸的浓度，进而判断待筛选药物是否为吲哚胺2，3‑二氧化酶抑制剂。与现有技术相比，本发明方法可提供在细胞水平内筛选IDO抑制剂药物的可靠和有效的方法。

Description

吲哚胺2，3-二氧化酶抑制剂的筛选方法
技术领域
本发明涉及一种药物筛选方法，尤其是涉及一种吲哚胺2，3-二氧化酶抑制剂的筛选方法。
背景技术
吲哚胺2，3-二氧化酶(Indoleamine 2,3-dioxygenase，IDO)是色氨酸-犬尿氨酸途径的限速酶，它催化哺乳动物肝外组织必需氨基酸L-色氨酸生成犬尿氨酸。IDO抑制T淋巴细胞的增殖，使得恶性肿瘤细胞借此逃避免疫监视、导致肿瘤发生。IDO的抑制剂有望成为肿瘤治疗的手段。另外在同种异体间器官移植间，IDO的表达能够减弱T细胞介导的急性排斥反应，延长移植物存活时间。
发明内容
本发明的目的就是为了提供一种吲哚胺2，3-二氧化酶抑制剂的筛选方法。
本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：
本发明提供一种吲哚胺2，3-二氧化酶抑制剂的筛选方法，包括以下步骤：
1)标准品配制：配制色氨酸标准溶液和犬尿氨酸标准溶液；
2)分别取标准品加入到细胞培养基中得到做标准曲线的标准溶液；
3)系列标准溶液加入乙腈或甲醇处理标准溶液样品，处理后标准溶液样品经高速离心机离心，标准溶液样品准备上机检测；
4)RapidFire液质联用检测标准溶液样品的峰面积，采用标准溶液的浓度和相应的峰面积信号做标准曲线；
5)将色氨酸与细胞加入细胞培养基中，并加入待筛选药物，孵育一段时间，加入乙腈或甲醇处理待测样品，待测样品经高速离心机离心，取上清液准备上机检测；
6)RapidFire液质联用检测待测样品的峰面积，根据步骤4)所得标准曲线，计算样品中色氨酸和犬尿氨酸的浓度，进而判断待筛选药物是否为吲哚胺2，3-二氧化酶抑制剂。
在本发明的一个实施方式中，步骤1)中，所述色氨酸标准溶液为一系列不同已知浓度的溶液；所述犬尿氨酸标准溶液为一系列不同已知浓度的溶液；
优选地，步骤1)中，色氨酸标准溶液和犬尿氨酸标准溶液的系列浓度为30,000、10,000、3,000、1,000、300、100、30、10、3μM。
在本发明的一个实施方式中，步骤1)中，配制色氨酸标准溶液和犬尿氨酸标准溶液的溶剂选择甲醇或乙腈或水中的一种或多种。
在本发明的一个实施方式中，步骤2)中，分别取标准品5μL加入到45μL细胞培养基中得到做标准曲线的标准溶液，浓度为3,000、1,000、300、100、30、10、3、1、0.3μM。
在本发明的一个实施方式中，步骤2)所述细胞培养基为DMEM(high glucose)培养基，选择市售的DMEM(high glucose)培养基，主要成分包括甘氨酸(Glycine)，精氨酸(Arginine)，氢氯酸盐(hyfrochloride)，胱氨酸(Cystine)，谷氨酰胺(glutamine)，组氨酸，异亮氨酸，亮氨酸，赖氨酸盐酸盐，蛋氨酸，苯丙氨酸，丝氨酸，苏氨酸，色氨酸，酪氨酸，缬氨酸，氯化胆碱，泛酸钙，叶酸，烟酰胺，氯化钙，硫酸镁等。
在本发明的一个实施方式中，步骤3)中，步骤2)的系列标准溶液加入200μL乙腈或甲醇处理样品。加入乙腈或甲醇处理样品的目的在于去除蛋白质等。
在本发明的一个实施方式中，RapidFire液质联用仪器为美国Agilent公司的型号360高通量液相平台联用AB Sciex公司的型号API4000+四级杆质谱仪。
在本发明的一个实施方式中，步骤4)中，利用RapidFire液质联用进行检测，其中条件为：利用流动相A为0.1％甲酸或乙酸水溶液，流动相B为0.1％甲酸、乙酸或乙腈/甲醇溶液；色谱柱为室温操作；泵一的流速为1ml/min，泵一为流动相A，泵二的流速为1ml/min，泵二为流动相B，泵三的流速为0.75ml/min，泵三为流动相B，吸样品时间500ms，进样/冲洗3000ms，洗脱3000ms，平衡1000ms。
在本发明的一个实施方式中，所述色谱柱为C4、C18或HILIC一种。
在本发明的一个实施方式中，步骤4)中，利用RapidFire液质联用进行检测，质谱仪采用电喷雾离子源，正离子扫描模式，扫描方式为多反应检测模式，定量离子对色氨酸：205/188，碎裂电压45V，碰撞能量14eV；定量离子对犬尿氨酸离子：209/94，碎裂电压45V，碰撞能量19eV；喷雾电压5500V，离子源温度600℃。
在本发明的一个实施方式中，步骤6)中RapidFire液质联用检测待测样品的峰面积的条件与步骤4)利用RapidFire液质联用进行检测的条件相同。
在本发明的一个实施方式中，步骤6)，在不同浓度的不同待筛选药物处理细胞后，通过RapidFire液质联用检测待测样品的峰面积，并根据标准曲线，得到样品中犬尿氨酸的浓度，根据浓度计算得出IC50，进而判断待筛选药物是否为吲哚胺2，3-二氧化酶抑制剂。而根据浓度计算得出IC50，以及判断待筛选药物是否为吲哚胺2，3-二氧化酶抑制剂的方法为本领域技术人员的常规技术手段。
与现有技术相比，本发明吲哚胺2，3-二氧化酶抑制剂的筛选方法采取RapidFire液质联用检测手段，建立了稳定、高通量、灵敏、准确的敏感可重复的吲哚胺2，3-二氧化酶抑制剂药物的筛选方法。
附图说明
图1-1是色氨酸最低检测线的Rapidfire MS色谱图；
图1-2是犬尿氨酸最低检测线的Rapidfire MS色谱图；
图2是色氨酸，犬尿氨酸标准曲线；
图3是色氨酸，犬尿氨酸96孔板HPE ZPE分布图；
图4是色氨酸，犬尿氨酸Z’因子。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。
实施例1
一、本发明涉及的仪器和设备：RapidFire液质联用仪器为美国Agilent公司的型号360高通量液相平台联用AB Sciex公司的型号API4000+四级杆质谱仪；高速离心机(5424R德国Eppendorf公司)；离子水发生器(Milli-Q，美国Millipore公司)。
二、RapidFire液质联用检测方法步骤：
精确称量色氨酸和犬尿氨酸配制标准储备液的浓度为30mM，采用甲醇或乙腈或水的一种或多种稀释得到系列溶液30,000,10,000,3,000,1,000,300,100,30,10,3μM。
分别取标准品5μL加入到45μL细胞培养基中得到做标准曲线的标准溶液，浓度为3,000,1,000,300,100,30,10,3,1,0.3μM。
标准溶液加入200μL乙腈或甲醇处理样品；样品4000rpm，30min，准备上样。
利用RapidFire液质联用进行检测，其中条件为：利用流动相A为0.1％甲酸或乙酸水溶液，流动相B为0.1％甲酸、乙酸或乙腈/甲醇溶液；色谱柱为室温操作；泵一的流速为1ml/min，泵一为流动相A，泵二的流速为1ml/min，泵二为流动相B，泵三的流速为0.75ml/min，泵三为流动相B，吸样品时间(aspirate)500ms，进样/冲洗(load/wash)3000ms，洗脱(elute)3000ms，平衡(re-equilibrate)1000ms。质谱仪采用电喷雾离子源，正离子扫描模式，扫描方式为多反应检测模式，定量离子对色氨酸：205/188，碎裂电压45V，碰撞能量14eV；定量离子对犬尿氨酸离子：209/94，碎裂电压45V，碰撞能量19eV；喷雾电压5500V，离子源温度600℃。
色氨酸，犬尿氨酸最低检测线的Rapidfire MS色谱图如图1-1、图1-2所示，图1-1、图1-2可以看出Rapidfire MS可以用于检测色氨酸，犬尿氨酸，色氨酸，犬尿氨酸标准曲线如图2所示，图2说明线性R2大于0.95，符合检测要求。
三、将色氨酸与细胞加入细胞培养基中，并加入待筛选药物，孵育一段时间，加入乙腈或甲醇处理待测样品，待测样品经高速离心机离心，取上清液准备上机检测；RapidFire液质联用检测待测样品的峰面积，根据所得标准曲线，计算样品中色氨酸和犬尿氨酸的浓度，进而判断待筛选药物是否为吲哚胺2，3-二氧化酶抑制剂。
图3是色氨酸，犬尿氨酸96孔板的HPE ZPE分布图；图3只是样品在样品96孔板中的分布示意图，图4是色氨酸，犬尿氨酸Z’因子。Z’因子大于0.5，说明此方法可以用于样品的筛选。
上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种吲哚胺2，3-二氧化酶抑制剂的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)标准品配制：配制色氨酸标准溶液和犬尿氨酸标准溶液；
2)分别取标准品加入到细胞培养基中得到做标准曲线的标准溶液；
3)系列标准溶液加入乙腈或甲醇处理标准溶液样品，处理后标准溶液样品经高速离心机离心，标准溶液样品准备上机检测；
4)RapidFire液质联用检测标准溶液样品的峰面积，采用标准溶液的浓度和相应的峰面积信号做标准曲线；
5)将色氨酸与细胞加入细胞培养基中，并加入待筛选药物，孵育一段时间，加入乙腈或甲醇处理待测样品，待测样品经高速离心机离心，取上清液准备上机检测；
6)RapidFire液质联用检测待测样品的峰面积，根据步骤4)所得标准曲线，计算样品中色氨酸和犬尿氨酸的浓度，进而判断待筛选药物是否为吲哚胺2，3-二氧化酶抑制剂。
2.根据权利要求1所述的一种吲哚胺2，3-二氧化酶抑制剂的筛选方法，其特征在于，步骤1)中，所述色氨酸标准溶液为一系列不同已知浓度的溶液；所述犬尿氨酸标准溶液为一系列不同已知浓度的溶液；
优选地，步骤1)中，色氨酸标准溶液和犬尿氨酸标准溶液的系列浓度为30,000、10,000、3,000、1,000、300、100、30、10、3μM。
3.根据权利要求1所述的一种吲哚胺2，3-二氧化酶抑制剂的筛选方法，其特征在于，步骤1)中，配制色氨酸标准溶液和犬尿氨酸标准溶液的溶剂选择甲醇或乙腈或水中的一种或多种。
4.根据权利要求1所述的一种吲哚胺2，3-二氧化酶抑制剂的筛选方法，其特征在于，步骤2)中，分别取标准品5μL加入到45μL细胞培养基中得到做标准曲线的标准溶液，浓度为3,000、1,000、300、100、30、10、3、1、0.3μM。
5.根据权利要求1所述的一种吲哚胺2，3-二氧化酶抑制剂的筛选方法，其特征在于，RapidFire液质联用仪器为美国Agilent公司的型号360高通量液相平台联用AB Sciex公司的型号API4000+四级杆质谱仪。
6.根据权利要求1所述的一种吲哚胺2，3-二氧化酶抑制剂的筛选方法，其特征在于，步骤4)中，利用RapidFire液质联用进行检测，其中条件为：利用流动相A为0.1％甲酸或乙酸水溶液，流动相B为0.1％甲酸、乙酸或乙腈/甲醇溶液；色谱柱为室温操作；泵一的流速为1ml/min，泵一为流动相A，泵二的流速为1ml/min，泵二为流动相B，泵三的流速为0.75ml/min，泵三为流动相B，吸样品时间500ms，进样/冲洗3000ms，洗脱3000ms，平衡1000ms。
7.根据权利要求6所述的一种吲哚胺2，3-二氧化酶抑制剂的筛选方法，其特征在于，所述色谱柱为C4、C18或HILIC一种。
8.根据权利要求1所述的一种吲哚胺2，3-二氧化酶抑制剂的筛选方法，其特征在于，步骤4)中，利用RapidFire液质联用进行检测，质谱仪采用电喷雾离子源，正离子扫描模式，扫描方式为多反应检测模式，定量离子对色氨酸：205/188，碎裂电压45V，碰撞能量14eV；定量离子对犬尿氨酸离子：209/94，碎裂电压45V，碰撞能量19eV；喷雾电压5500V，离子源温度600℃。
9.根据权利要求1所述的一种吲哚胺2，3-二氧化酶抑制剂的筛选方法，其特征在于，步骤6)中RapidFire液质联用检测待测样品的峰面积的条件与步骤4)利用RapidFire液质联用进行检测的条件相同。
10.根据权利要求1所述的一种吲哚胺2，3-二氧化酶抑制剂的筛选方法，其特征在于，步骤6)，在不同浓度的不同待筛选药物处理细胞后，通过RapidFire液质联用检测待测样品的峰面积，并根据标准曲线，得到样品中犬尿氨酸的浓度，根据浓度计算得出IC50，进而判断待筛选药物是否为吲哚胺2，3-二氧化酶抑制剂。
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