CN114414700A - 一种同时测定生物样品中多种内源性糖醇含量的方法和系统 - Google Patents

Abstract

本发明涉及内源性物质检测技术领域，具体涉及一种同时测定生物样品中多种内源性糖醇含量的方法，包括如下依次进行的步骤：经预处理获得含有内标的待富集处理品；使用UPLC含有内标的待富集处理品获得糖醇富集样品；使用MS/MS检测和/或量化所述糖醇富集样品中的糖醇；所述糖醇包括山梨醇、甘露醇、赤藓糖醇、核糖醇和肌醇。本方案解决了现有技术中的分析方法难以同时检测多种内源性糖醇的技术问题，且解决了同分异构体糖醇色谱难以完全分离的技术难题。该方法检测过程耗时短、相对成本低、特异性好、灵敏度高、节省劳动量，更适合应用于评价药物或者治疗方法的效果的实践操作中。

Description

一种同时测定生物样品中多种内源性糖醇含量的方法和系统

技术领域

本发明涉及内源性物质检测技术领域，具体涉及一种同时测定生物样品中多种内源性糖醇含量的方法和系统

背景技术

糖醇是碳水化合物催化加氢形成的一类特殊的多元醇，在自然界中多在特定的水果、蔬菜、菌类中被发现，通常也在很多类似口香糖、糖果、饮料中被用作无糖甜味剂。正常条件下，机体体内的糖醇含量较低，但受到某种内部或者外部的刺激之后，其内源性含量会产生变化，因此糖醇常被用作判断药物反应和药物疗效等的生物标志物。例如，血清赤藓糖醇水平高于正常水平，预示着中心性肥胖增加和心血管疾病。肌醇在大脑和其他哺乳动物组织中大量存在，参与细胞信号转导，以响应多种激素、神经递质和生长因子。

糖醇一般极性较大，大部分在生物体内含量较低。而传统的分析技术，如气相色谱串联质谱(GC-MS)和高效液相色谱串联紫外(LC-UV)都存在不足。因为糖醇是非挥发性的分子，GC-MS分析时需要通过复杂的过程转化为挥发性的衍生物。同时多糖醇也不吸收紫外光，LC-UV分析时需要柱前衍生或柱后衍生的方式来提高分离度和灵敏度。液相色谱串联质谱/质谱(LC-MS/MS)分析方法，其无需将待测物转化成挥发性物质，也无需考虑待测物吸收紫外光的问题。对于相关药物临床试验，需根据受试者体内多种糖醇浓度水平变化评价有效性和安全性时，现有LC-MS/MS分析方法只能同时测定一个或两个目标的糖醇。同时，很多糖醇互为同分异构体(如山梨醇与甘露醇)，具有相似的理化性质，质谱检测时用于定量的离子对也相同，进一步增加了定量检测难度。此外，在生物样品中的糖醇内源性浓度较低，样品中其他未知内源性物质也容易干扰检测。因此，同时测定生物样品中多种内源性糖醇含量，对于分析方法的特异性、灵敏度、定量范围均有很高的要求，现有技术中尚无适合于同时分析多种内源性糖醇的技术。

发明内容

本发明意在提供一种同时测定生物样品中多种内源性糖醇含量的方法，以解决现有技术中的分析方法难以同时检测多种内源性糖醇的技术问题。

为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种同时测定生物样品中多种内源性糖醇含量的方法，用于非治疗或非诊断目的的评价药物或者治疗方法的效果，包括如下依次进行的步骤：

S1：经预处理获得含有内标的待富集处理品；

S2：使用UPLC含有内标的待富集处理品获得糖醇富集样品；

S3：使用MS/MS检测和/或量化所述糖醇富集样品中的糖醇；

所述糖醇包括山梨醇、甘露醇、赤藓糖醇、核糖醇和肌醇。

本方案还提供了一种同时测定生物样品中多种内源性糖醇含量的系统，包括UPLC-MS/MS设备，其UPLC条件为：

色谱柱：Carbo Sep CHO-620，300×6.5mm；

流动相A：超纯水；

洗针液：超纯水；

流速：0.6mL/min；

柱温：90℃；

进样室温度：2-8℃；

进样量：2-40μL；

洗脱条件：流动相A等度洗脱至少17min。

本技术方案的原理及优点是：

本方案首先通过预处理(具体为萃取技术)使样品中的蛋白杂质除去，获得待富集处理品，再使用UPLC法从待富集处理品获得糖醇富集样品，然后通过MS/MS获得碎片离子并测量碎片离子的量，测定的碎片离子的量与所述样品中糖醇的量有关，因此可对糖醇进行定量或者定性的检测。本发明利用超高效液相色谱串联质谱/质谱法(UPLC-MS/MS)，通过研究影响糖醇分离的实验因素，建立了一次性同时定量与定性检测生物样品中5种糖醇(山梨醇、甘露醇、赤藓糖醇、核糖醇和肌醇)的方法。本方法利用超高效液相色谱结合串联质谱技术，来检测并量化生物样品中的糖醇，具有检测过程耗时短、相对成本低、特异性好、灵敏度高和节省劳动量的优点。

在本技术方案中，对UPLC的各项条件进行了优化和摸索，选用了适合的色谱柱、柱温和流速等条件，成功地分离了5种糖醇中的同分异构体甘露醇和山梨醇。由于山梨醇与甘露醇这两种同分异构体难以用质谱区分，所以需要找到一种将这两种物质进行区分的高效液相色谱方法。本方案的色谱条件为使用UPLC-MS/MS同时分析物种糖醇的方案创造了前提条件。现有技术中针对糖醇的检测时(通常是针对于包括水果在内的食品)，往往采用离子色谱加多级淋洗的方法来进行检测。上述分析方法不足之处在于：单个样品进样时间较长(120分钟每个样品)；取样量较大(0.1g)；低通路检测(单个样品制备)；很多待测物峰没有与基线峰分开或无法精确积分；只能通过保留时间判断化合物，缺乏特异性。而本技术方案是针对内源性糖醇进行检测，由于检测对象的不同，其检测难度相应增加，不能使用现有技术中的常规方法，必须探索出一种适用于本方案特殊要求的方法。本技术方案采用UPLC-MS/MS分析方法，其优点主要有：单个样品进样时间短(20分钟以内)；取样量较小(100μL)；高通量检测(96个样品同时制备)；糖醇类物质在生物基质中含量通常较低且有内源性干扰，需要使用串联质谱特异性离子对，才能获得理想检测效果；待测物峰能很好的分离和积分，方法特异性好。

进一步，在S1中，所述预处理的方法为：在样品中加入内标工作液并均质，然后用沉淀剂处理加入内标后的样品，离心取上清再用氮气挥干后用水复溶，获得含有内标的待富集处理品；所述样品为生物样品、质控样品或者用于绘制标准曲线的样品。

本技术方案利用蛋白沉淀和超高效液相色谱法(UPLC)，进行所选分析物的纯化，有利于糖醇的富集便于后于质谱分析。质控样品在本技术方案中可以对本方案的检测系统进行监控，确保系统的稳定性和精确性。用于绘制标准曲线的样品可以用于确定本系统的检测线性范围，以及通过绘制标准曲线来对目标检测物进行定量分析。

进一步，在S1中，所述生物样品的来源包括人、猴、犬、兔和鼠；所述生物样品为全血、红细胞、血浆、血清、胆汁、唾液、尿、汗或组织；所述内标为6个¹³C标记的山梨醇；所述沉淀剂为甲醇和乙腈组成的混合溶液。

本方案的方法适用于各种生物样本，可以实现对5种糖醇的准确检测。本方案在样品加入了内标6个¹³C标记的山梨醇，通过与检测的内标离子的量作比较，判断目标分析物生成的离子的存在与否或存在的量。

进一步，在S1中，当生物样品为全血、红细胞或组织时，在生物样品中加入匀浆珠和内标，再匀浆,然后用沉淀剂处理，离心取上清再用氮气挥干后用水复溶，获得含有内标的待富集处理品；当生物样品为血浆时，生物样品中含有抗凝剂，所述抗凝剂包括草酸钾、肝素、氟化钠、二乙胺四乙酸钠盐和枸橼酸钠。

在处理全血、红细胞或组织的生物样品时，需要对其进行匀浆处理，以保证其内部的糖醇类物质被充分提取。在处理血浆的时候需要加入抗凝剂，以避免血液凝固而造成的检测效果不佳的情况。

进一步，在S3中，使含糖醇的成分经受电离源，获得糖醇前体离子；然后使糖醇前体离子经受碰撞诱导解离生成碎片离子；测定所述碎片离子的量并换算为所述糖醇的量。

采用上述技术方案，在适合生成可通过质谱法检测的糖醇前体离子的条件下使糖醇富集样品经受电离源，再使糖醇前体离子经受碰撞诱导解离以生成可通过质谱法检测的一种或多种碎片离子，最后通过质谱法测定一种或多种碎片离子的量，测定的碎片离子的量与所述样品中糖醇的量有关，因此可对糖醇进行定量或者定性的检测。

进一步，所述糖醇前体离子包括质荷比为181.0的山梨醇前体离子，质荷比为181.0的甘露醇前体离子，质荷比为121.0的赤藓糖醇前体离子，质荷比为151.0的核糖醇前体离子，质荷比为179.0的肌醇前体离子。

进一步，所述碎片离子包括质荷比分别为101.0、89.0、59.0的山梨醇碎片离子，质荷比分别为101.0、89.0、59.0的甘露醇碎片离子，质荷比分别为79.0、71.1、59.0的赤藓糖醇碎片离子，质荷比分别为101.0、89.0、71.0、59.0的核糖醇碎片离子，质荷比分别为91.0、86.9、59.0的肌醇碎片离子。

采用上述技术方案，来自色谱分析柱的液体溶剂流进入MS/MS分析器的加热喷雾器接口；并且在接口的加热带电管道内将溶剂/分析物混合物转化为蒸汽。在这些过程期间，分析物(即糖醇：山梨醇、甘露醇、赤藓糖醇、核糖醇和肌醇)电离，形成各种前提离子。前体离子通过仪器口并且进入第一个四极杆。四极杆1和3(Q1和Q3)为滤质器，允许基于其质荷比(m/z)选择离子(即，分别选择Q1和Q3中的“前体”和“碎片”离子)。四极杆2(Q2)是碰撞室，在碰撞室内破碎离子。质谱仪的第一个四极杆(Q1)选择具有糖醇离子的m/z的分子。使具有恰当m/z的前体离子进入碰撞室(Q2)，而具有任何其它m/z的不合需要的离子与四极杆的侧面碰撞并且被消除。进入Q2的前体离子与中性气体分子(例如氩分子)碰撞并且破碎。使生成的碎片离子进入四极杆3(Q3)，在四极杆3中选择碎片离子进行检测。

Q1选择用于m/z为181.0(山梨醇)、181.0(甘露醇)、121.0(赤藓糖醇)、151.0(核糖醇)、179.0(肌醇)的前体离子。破碎这些糖醇前体离子生成m/z为101.0、89.0、59.0(山梨醇)、101.0、89.0、59.0(甘露醇)、79.0、71.1、59.0(赤藓糖醇)、101.0、89.0、71.0、59.0(核糖醇)、91.0、86.9、59.0(肌醇)的碎片离子。可测量来自单个前体离子的单个碎片离子的峰面积比。或者，可测量自单个前体离子的两个或更多个碎片离子的峰面积比。通过现有技术常规的计算方法，将每个碎片离子的峰面积比换算成糖醇的量，以定量评估最初样品中的糖醇。

进一步，一种同时测定生物样品中多种内源性糖醇含量的系统，其MS/MS条件为：

气帘气：30psi；

离子源气体1：50psi；

离子源气体2：50psi；

离子源温度：500℃；

加热板块：ON；

离子源电压：-4500V；

CAD：9units；

电离源为电喷雾电离源；电离模式为负离子模式，扫描模式为多反应离子监测。

本方案通过“串联质谱法”(即“MS/MS”)提高MS技术的分辨率。在这种技术中，可在MS仪器中过滤由目标分子生成的前体离子(也称为母离子)，随后破碎前体离子以产生一个或多个碎片离子(也称为子离子或产物离子)，然后在第二个MS过程中分析所述碎片离子。通过精心选择前体离子，仅使某些分析物产生的离子通过到达破碎室，在那里与惰性气体原子的碰撞产生碎片离子。因为在一系列指定电离/破碎条件下以可重现方式生成前体和碎片离子，所以MS/MS技术可提供极其强大的分析工具。

使用多反应离子监测(MRM)检测模式检测离子。当离子与检测器碰撞时，它们产生转化为数字信号的电子脉冲。将所需数据转发至计算机，计算机绘制收集离子计数与时间的图。所得质量色谱图与传统高效液相色谱串联质谱(HPLC-MS)方法中生成的色谱图类似。可测量与特定离子相对应的峰下面积与目标分析物的量相关联。

进一步，一种同时测定生物样品中多种内源性糖醇含量的系统，还包括预处理试剂，所述预处理试剂包括内标工作液、沉淀剂和水；所述内标工作液含有6个¹³C标记的山梨醇，所述沉淀剂为甲醇和乙腈组成的混合溶液。通过沉淀剂除去样品中的杂质，增加检测准确程度。

进一步，还包括质控样品；所述质控样品包括替代质控样品和真实基质样品；所述替代质控样品的原料包括质控工作液和替代基质，所述真实基质样品的原料包括质控工作液和空白基质；所述空白基质为血浆、全血或者红细胞；所述替代基质为0.01M磷酸盐缓冲液，或者1％牛血清白蛋白溶于0.01M磷酸盐缓冲液。不同的质控样品用于检测系统的准确度，以保证测试结果的准确性。

进一步，还包括用于绘制标准曲线的样品；所述用于绘制标准曲线的样品的原料包括标准曲线工作液和替代基质。在标准曲线工作液中加入替代基质，最大限度地减少未知内源物质对测定结果的干扰和影响。

进一步，其用于测量样品中的山梨醇、甘露醇或赤藓糖醇的线性范围为50-5000ng/mL；其测量样品中的核糖醇的线性范围为25-2500ng/mL；其用于测量样品中的肌醇的线性范围为300-30000ng/mL。

本系统能够测定生物样品中50ng/mL至5000ng/mL范围内的山梨醇、甘露醇和赤藓糖醇(包括50ng/mL和5000ng/mL)的量；测定生物样品中25ng/mL至2500ng/mL范围内的核糖醇(包括25ng/mL和2500ng/mL)的量；测定生物样品中300ng/mL至30000ng/mL范围内的核糖醇(包括300ng/mL和30000ng/mL)的量。因此，本系统特别适合于检测生物样品中的内源性糖醇，因为在生物样品中的糖醇内源性浓度较低，常规方法难以实现检测。

综上所述，本技术方案获得的有益效果在于：

首次提出将UPLC-MS/MS方法应用于生物样品中五种糖醇(山梨醇、甘露醇、赤藓糖醇、核糖醇和肌醇)的同时检测，大幅度提高了检测效率，降低了检测成本。

通过对色谱柱及色谱条件的选取和调整，使得相同分子量的同分异构体，如山梨醇和甘露醇，能够在分析中成功地分离和定量。

本方案的精度和准确度很高，它可以被用作评估新药或新治疗方法的临床效果和安全性的指标。本方法准确度和精密度全部在可接受水平内(精密度：≤15％，LLOQ为≤20％；准确度：≤±15％，LLOQ为≤±20％)。本方案色谱条件、质谱条件以及样品预处理方法的适当选取，保证了本技术方案获得理想检测效果。如果调整色谱柱类型以及色谱参数或者调整质谱参数，均会导致检测的准确度或者精密度不符合要求。

本发明方法通过替代基质配制标准曲线样品和质控样品、蛋白质沉淀以及氮气挥干后复溶相配合的方式，来最大限度地减少未知内源物质对测定结果的干扰和影响。

本发明方法对生物样品类型为分离胶血清、促凝剂血清、二乙胺四乙酸钠盐血浆、肝素钠血浆、肝素锂血浆、枸橼酸钠血浆、氟化钠血浆的样品的糖醇定量测定均适用，基质特异性小。本发明方法对生物样品类型为红细胞、全血或组织等粘稠度大的样品，样品加入匀浆珠后使用匀浆机混匀再进行蛋白沉淀、氮气挥干等预处理，可有效降低移液误差和检测负偏差。

本发明方法中使用纯水为流动相和洗针液可有效降低对人类健康、生态环境有害的溶剂、试剂、副产物，符合绿色分析的理念。

附图说明

图1为实施例1的典型液相色谱图(流速：0.6mL/min，柱温：90℃)。

图2为实施例1的五种糖醇液相色谱图(流速：0.6mL/min，柱温：90℃)。

图3为实施例2的山梨醇和甘露醇未分离开的典型液相色谱图(色谱柱：LunaOmega SUGAR 100×2.1mm，3μm)。

图4为实施例2的山梨醇和甘露醇未完全分离开的典型液相色谱图(色谱柱：LunaNH2150×4.6mm，5μm)。

图5为实施例2的山梨醇和甘露醇分离开的典型液相色谱图(色谱柱：CarboSepCHO 620300×6.5mm，10μm)。

图6为实施例3的5种糖醇液相色谱图(流速：0.4mL/min，柱温：90℃)。

图7为实施例3的5种糖醇液相色谱图(流速：0.8mL/min，柱温：90℃)。

图8为实施例4的5种糖醇液相色谱图(流速：0.6mL/min，柱温：40℃)。

图9为实施例4的5种糖醇液相色谱图(流速：0.6mL/min，柱温：70℃)。

图10为实施例5的替代基质(0.01M磷酸盐缓冲液)配制的山梨醇样品的质谱图(从上至下依次为空白样品、LLOQ、ULOQ以及真实基质样品)。

图11为实施例5的替代基质(0.01M磷酸盐缓冲液)配制的甘露醇样品的质谱图(从上至下依次为空白样品、LLOQ、ULOQ以及真实基质样品)。

图12为实施例5的替代基质(0.01M磷酸盐缓冲液)配制的赤藓糖醇样品的质谱图(从上至下依次为空白样品、LLOQ、ULOQ以及真实基质样品)。

图13为实施例5的替代基质(0.01M磷酸盐缓冲液)配制的核糖醇样品的质谱图(从上至下依次为空白样品、LLOQ、ULOQ以及真实基质样品)。

图14为实施例5的替代基质(0.01M磷酸盐缓冲液)配制的肌醇样品的质谱图(从上至下依次为空白样品、LLOQ、ULOQ以及真实基质样品)。

图15为实施例5的替代基质(0.01M磷酸盐缓冲液)配制的内标的质谱图(从上至下依次为空白样品、LLOQ、ULOQ以及真实基质样品)。

图16为实施例6的替代基质(0.01M磷酸盐缓冲液)配制的山梨醇标准品的定量线性图线。

图17为实施例6的替代基质(0.01M磷酸盐缓冲液)配制的甘露醇标准品的定量线性图线。

图18为实施例6的替代基质(0.01M磷酸盐缓冲液)配制的肌醇标准品的定量线性图线。

图19为实施例6的替代基质(0.01M磷酸盐缓冲液)配制的赤藓糖醇标准品的定量线性图线。

图20为实施例6的替代基质(0.01M磷酸盐缓冲液)配制的核糖醇标准品的定量线性图线。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步详细的说明，但本发明的实施方式不限于此。若未特别指明，下述实施例以及实验例所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，且所用的材料、试剂等，均可从商业途径得到。

对本文件中用到的术语进行统一解释如下：

术语“生物样品”指可能含有目标分析物的任何样品。术语“体液”指可从各个体内分离的任何流体。例如，“体液”可包括全血、红细胞、血浆、血清、胆汁、唾液、尿、汗等。在优选实施方案中，生物样品包括来自人类的体液样品，优选血浆或血清。生物样品为血浆时，抗凝剂包括草酸钾、肝素、氟化钠、二乙胺四乙酸钠盐、枸橼酸钠。

术语“纯化”和“富集”并不指从样品中去除除目标分析物外的所有物质。相反，这些术语指使一种或多种目标分析物的量相对于样品中可能干扰目标分析物的检测的其它组分富集的过程。通过各种方式纯化样品可使一种或多种干扰物质，例如可能或可能不干扰通过质谱法检测所选母离子或子离子的一种或多种物质相对减少。当使用该术语时，相对减少不需要通过纯化完全去除待纯化材料中与目标分析物一起存在的任何物质。

术语“蛋白沉淀”指分析过程中对生物样品进行前处理的一种常用方式。对于富含蛋白质的样品，在进行分离、提取时要将大量干扰测定的蛋白质沉淀除去，使待测物仍留存于溶液中。生物样品为红细胞、全血、组织时，操作时一般要先将样品磨碎，然后再加入蛋白沉淀剂进行蛋白质沉。

术语“氮气挥干”指通过将氮气快速、可控、连续地吹到加热液体样品表面，使样品中的溶剂快速蒸发、分离，从而达到样品无氧浓缩的目的，保持样品更纯净。

术语“超高效液相色谱法”或“UPLC”指通过在压力下迫使流动相通过固定相，通常为密集填充柱，提高分离程度的液相色谱法。术语“等度洗脱”是在样品组分的分析周期中，流动相的组成比例和流速恒定不变的洗脱方式。

术语“质谱法”或“MS”指通过其质量鉴定化合物的分析技术。MS指基于其质荷比或“m/z”过滤、检测和测量的方法。MS技术通常包括电离化合物以形成带电化合物；和检测带电化合物的分子量并计算质荷比。可通过任何适合方式电离并检测化合物。“质谱仪”通常包括离子发生器、质量分析器和离子检测器。一般而言，电离一个或多个目标分子，并且随后将离子引入质谱仪中，其中由于磁场和电场的组合，离子在空间上跟随取决于质量(m)和电荷(z)的途径。

术语“电离”指生成具有等于一个或多个电子单位的净电荷的分析物离子的过程。负离子是具有一个或多个电子单位的净负电荷的离子，而正离子是具有一个或多个电子单位的净正电荷的离子。

术语“电喷雾电离”或“ESI”指使溶液沿末端施加了高正或负电位的长度较短的毛细管通过的方法。使到达管末端的溶液蒸发(雾化)成于溶剂蒸汽中非常小的溶液液滴射流或喷雾。这种雾滴流过蒸发室。当液滴变小时，电气表面电荷密度增大，直至相同电荷之间的自然排斥引起离子以及中性分子被释放。

术语“定量下限”或“LLOQ”指测量在数量上变得有意义的点。在这个LLOQ的分析物反应可识别、不连续并且可重现，相对标准偏差(RSD％)小于20％并且准确度为80％-120％。术语“定量上限”或“ULOQ”指分析方法能测量的最大的分析物的点。

生物样品中分析物的“量”通常指反映样品体积中可检测的分析物质量的绝对值。然而，量也涵盖与另一分析物量相比的相对量。例如，样品中分析物的量可为大于样品中一般存在的分析物的对照或正常水平的量。

实施例1：

(1)样品制备

分别称取山梨醇、甘露醇、赤藓糖醇、核糖醇和肌醇标准品，溶于50％的二甲基甲酰胺溶液(水/二甲基甲酰胺＝1/1,v/v)中配制成待测物储备液(山梨醇/甘露醇/赤藓糖醇浓度为1000000ng/mL、核糖醇为500000ng/mL和肌醇标为6000000ng/mL)。待测物储备液配制两份，分别用于配制标准曲线工作液和质控工作液，稀释剂为50％的二甲基甲酰胺溶液，配制方法如表1所示。

表1：五种糖醇标准曲线工作液和质控工作液配制表

称取含6个¹³C标记的山梨醇标准品，溶于50％的二甲基甲酰胺溶液(水/二甲基甲酰胺＝1/1,v/v)中配制成内标储备液(1000000ng/mL)。取内标储备液125μL，加入50％的甲醇溶液(水/甲醇＝1/1,v/v)定容至100mL，配制成终浓度为1250ng/mL的内标工作液。

替代基质样品制备：使用替代基质与表1所述工作液按照95:5(v/v)的比例配制替代标准曲线样品(STD1至STD8)和替代质控样品(LLOQ、LQC、MQC、HQC、ULOQ)。替代基质有两种，包括替代基质A：0.01M磷酸盐缓冲液，以及替代基质B：含有牛血清白蛋白的0.01M磷酸盐缓冲液，其中，每1g牛血清白蛋白对应100ml的0.01M磷酸盐缓冲液(m/v)。

真实基质样品制备：取空白基质(符合GCP要求的正规来源的健康人全血、血浆或红细胞等)，平行测定6份的平均值作为内源糖醇的浓度(QC0)。空白基质加入一定量糖醇标准品配制的不同浓度的质控样品(浓度为空白基质测得糖醇量和加入糖醇量之和)，即空白基质中加入质控工作液配制而成。配制方法如表2所示。

计算公式如下：

式中：

C_QC表示使用空白基质加入糖醇标准品配制的质控样品浓度；

C_QC0表示使用空白基质中糖醇的浓度；

V_QC0表示空白基质的体积；

C_工作液表示加入空白基质工作液中糖醇的浓度；

V_工作液表示加入空白基质工作液的体积。

表2.真实基质质控样品配方表

(2)质谱分析之前富集糖醇

取样品50.0μL，加入50.0μL内标工作液，混匀后再加入400μL沉淀剂(50/50，甲醇/乙腈，v/v)，涡旋混匀后于4000转/分钟离心10min，离心完成后取上清液200μL氮气挥干，再加入200μL纯水复溶。上述样品包括：质控样品、替代标准曲线样品和生物样品。质控样品包括替代质控样品和真实基质样品。生物样品的来源包括来自人、猴、犬、兔、鼠，包括全血、红细胞、血浆、血清、胆汁、唾液、尿、汗和组织。

若生物样品为血浆、血清、胆汁、唾液、尿和汗时，直接进行上述处理。若生物样品为全血或红细胞时，取全血或红细胞50.0μL，加入50.0μL内标工作液和10-15颗(粒径3mm)匀浆珠，混匀后再加入400μL沉淀剂(50/50，甲醇/乙腈，v/v)，在组织匀浆机上70赫兹混匀1分钟，涡旋混匀后于4000转/分钟离心10min，离心完成后取上清液200μL氮气挥干，再加入200μL纯水复溶。若生物样品为组织时，称取一定质量的组织，加入一定量的替代基质(组织质量:替代基质体积＝1：4，m/v，如1g组织加入4mL的0.01M PBS缓冲液)，加入10-15颗(粒径3mm)匀浆珠，并在组织匀浆机上70赫兹混匀1分钟。取组织匀浆液50.0μL，加入50.0μL内标工作液，混匀后再加入400μL沉淀剂(50/50，甲醇/乙腈，v/v)，涡旋混匀后于4000转/分钟离心10min，离心完成后取上清液200μL氮气挥干，再加入200μL纯水复溶。

将上述20μL(进样量可采用2-40μL)复溶样品引入Shimadzu LC-30AD的分析柱上(Carbo Sep CHO-620 300×6.5mm)。将UPLC等度应用于分析柱，以将糖醇与样品所含的其它分析物分开，获得糖醇富集样品。流动相A是100％超纯水，流速0.6mL/min，柱温90℃，进样室温度4℃(可采用2-8℃的进样室温度均可取得理想效果)，使用100％的流动相A进行等度洗脱17min(实际操作中洗脱时间17-20min)。然后使糖醇富集样品进行MS/MS以定量糖醇。

(3)通过串联MS检测并定量糖醇

使用AB Sciex API 5500系统(也可选用6500+系统)进行MS/MS。在本文所述实施例中使用全部来自Watson LIMS 7.5版本(或更新版本)。离开分析柱的液体溶剂/分析物流入MS/MS分析器的ESI源接口。在接口的加热管道内溶剂/分析物混合物转化为蒸汽。在负离子模式下，通过ESI电离分析物。离子进入第一个四极杆(Q1)。在Q1处观察到5种糖醇的前体离子。图1是通过UPLC-MS/MS检测标准曲线样品(STD8)的5种糖醇离子对典型图谱(液相色谱图)。图2是通过UPLC-MS/MS检测标准曲线样品(STD8)的5种糖醇液相色谱图，从上到下依次为含有5种糖醇的液相色谱总图，核糖醇的液相色谱图，赤藓糖醇的液相色谱图，肌醇的液相色谱图，甘露醇和山梨醇的液相色谱图。不同物质的保留时间具体为：肌醇约为9.0min，核糖醇约为9.2min，赤藓糖醇约为9.7min，甘露醇约为10.4min，山梨醇约为12.6min，内标约为12.6min。

质谱条件具体如下：

气帘气：30psi；离子源气体1：50psi；离子源气体2：50psi；离子源温度：500℃；加热板块：ON；离子源电压：-4500V；CAD：9units；电离模式：ESI、负离子模式、MRM(质谱多反应监测)；离子对：如表3所示。

表3：五中糖醇及内标的质谱离子对

在本实施例中，糖醇前体离子包括质荷比为181.0的山梨醇前体离子，质荷比为181.0的甘露醇前体离子，质荷比为121.0的赤藓糖醇前体离子，质荷比为151.0的核糖醇前体离子，质荷比为179.0的肌醇前体离子。质荷比为181.0的山梨醇前体离子经受碰撞诱导解离，生成质荷比分别为101.0、89.0、59.0的山梨醇碎片离子；质荷比为181.0的甘露醇前体离子质经受碰撞诱导解离，生成质荷比分别为101.0、89.0、59.0的甘露醇碎片离子；质荷比为121.0的赤藓糖醇前体离子经受碰撞诱导解离，生成质荷比分别为79.0、71.1、59.0的赤藓糖醇碎片离子；质荷比为151.0的核糖醇前体离子经受碰撞诱导解离，生成质荷比分别为101.0、89.0、71.0、59.0的核糖醇碎片离子；质荷比为179.0的肌醇前体离子经受碰撞诱导解离，生成质荷比分别为91.0、86.9、59.0的肌醇碎片离子。

表3中的离子对的选择为经过大量测试后的最优化选择。母离子一般基于待测物分子量，由于待测物的结构不同，其产生的子离子(碎片离子)的数量以及类型不同，本技术方案选择的六种物质的作为离子对的子离子(碎片离子)具有显著高于其他子离子的信号强度，且该信号经多次重复试验后非常稳定。上述信号强度高且稳定的子离子是指质荷比为89.0的山梨醇碎片离子、质荷比为89.0的甘露醇碎片离子、质荷比为71.1的赤藓糖醇碎片离子、质荷比为71.0的核糖醇碎片离子、质荷比为86.9的肌醇碎片离子。在打碎母离子的能量选择方面，发明人使用待测物标准品进行了大量的质谱测试，获得了得到打碎母离子能量(碰撞电压)和信号强度的曲线图，选择最大信号强度对应的能量作为最佳打碎母离子能量。碰撞电压CE为-20V时，五种糖醇在质谱检测中均能获得最为理想的信号强度。综上所述，发明人采用不同的碰撞能(碰撞电压)对五种糖醇进行解析处理，发现在-20V的碰撞电压的作用下，五种糖醇均能破碎形成一种具有较高信号强度的子离子，使得五种糖醇的同时串联质谱检测变为可能。而采用高于或者低于-20V的碰撞电压，实验结果显示，获得的子离子的信号强度显著低于在本技术方案质谱条件下的信号强度。在同一碰撞电压下，五种醇糖均能在破碎后产生最佳信号，保证了检测的准确度和精确度，保证了批内/批间准确度和精密度等符合药典相关要求。

实施例2：色谱柱对分离效果的影响的研究

采用实施例1的测试方法，对色谱柱的选用进行了研究，本实施例具体列举了三种色谱柱的研究结果。本实施例的待检测样品为含有山梨醇与甘露醇这对同分异构体组分的标准曲线样品(STD8)。采用的三种色谱柱如下：

色谱柱1：Luna Omega SUGAR 100×2.1mm，3μm

色谱柱2：Luna NH2 150×4.6mm，5μm

色谱柱3：Carbo Sep CHO-620 300×6.5mm，10μm

实验结果参见图3-图5，展示了使用三种色谱柱获得的液相色谱图。通过图3可知，当选用色谱柱1时，山梨醇与甘露醇完全无法区分。从图4可知(左侧峰为甘露醇，右侧峰为山梨醇)，当选用色谱柱2时，山梨醇与甘露醇无法完全区分。从图5可知(左侧峰为甘露醇，右侧峰为山梨醇)，当选用色谱柱3并配合调节其它色谱条件时，山梨醇与甘露醇能够完全分开，从图中可以看出二者分离度(相邻色谱峰保留时间之差与两色谱峰峰宽均值之比，表示相邻两峰的分离程度)大于1.5(分离度≥99.7％)，满足进一步质谱测定要求。由于山梨醇与甘露醇这两种同分异构体难以用质谱区分，所以需要找到一种将这两种物质进行区分的高效液相色谱方法。从图1和图2可看出，其它待测物在色谱过程中也得到了较好的区分，其中分离度未达到1.5的也可以通过质谱进行进一步的鉴别。

实施例3：流速对检测的影响

采用实施例1的测试方法，在其他条件不变的情况下先后测试不同流速0.4mL/min、0.6mL/min、0.8mL/min对糖醇的组分分离情况，其组分的分离情况如图1、图2、图6、图7所示(在图2、图6、图7中，从上到下依次为含有5种糖醇的液相色谱图，核糖醇的液相色谱图，赤藓糖醇的液相色谱图，肌醇的液相色谱图，甘露醇和山梨醇的液相色谱图)。可以看出，流速越低5种糖醇分离度越好，分离时间越长。综合分离效果和分离时间，选择0.6mL/min为最佳流速。

实施例4：柱温对检测的影响

采用实施例1的测试方法，在其他条件不变的情况下先后测试不同柱温40℃、70℃、90℃对糖醇的组分分离情况，其组分的分离情况分别如图8、图9、图2所示(从上到下依次为含有5种糖醇的液相色谱图，核糖醇的液相色谱图，赤藓糖醇的液相色谱图，肌醇的液相色谱图，甘露醇和山梨醇的液相色谱图)。从图2、8、9可看出，在不影响分离度的情况下柱温越高5种糖醇分离时间越短，故选择时间最短的90℃为最佳柱温。

实施例5：

替代基质样品与真实基质样品配制与实施例1相同，其它检测条件与实施例1相同。替代基质和真实基质配制的质控样品的准确度和精密度，如表4所示。其中，LLOQ(BSA)表示替代基质B与LLOQ(定量下限质控样品)按照95:5(v/v)的比例配制而成的替代质控样品；LQC(BSA)表示替代基质B与LQC(低浓度质控样品)按照95:5(v/v)的比例配制而成的替代质控样品；MQC(BSA)表示替代基质B与MQC(中浓度质控样品)按照95:5(v/v)的比例配制而成的替代质控样品；HQC(BSA)表示替代基质B与HQC(高浓度质控样品)按照95:5(v/v)的比例配制而成的替代质控样品。在表4中Pl表示血浆，RBC表示红细胞，WB表示全血，抗凝剂为二乙胺四乙酸钠盐，BLQC、BMQC和BHQC的配制方法参见实施例1。

图10-图15为中山梨醇、甘露醇、赤藓糖醇、核糖醇、肌醇和内标的质谱图，每幅图中，从上到下的样品依次为：空白样品(不含内标和分析物的0.01M磷酸盐缓冲液)、替代质控样品(替代基质A与LLOQ工作液配制而成，参照实施例1)、替代质控样品(替代基质A与ULOQ工作液配制而成，参照实施例1，替代基质为0.01M磷酸盐缓冲液)和真实基质样品(人血浆，抗凝剂二乙胺四乙酸钠盐)。

表4：不同基质配制的质控样品的准确度和精密度

所有的质控样品测定结果都满足精密度和准确度的要求(精密度：≤15％，LLOQ为≤20％；准确度：85-115％，LLOQ为80-120％)，表明不同的生物基质之间不存在基质效应。

实施例6：测定可报道范围和线性度

用替代基质0.01M磷酸盐缓冲液配制糖醇标准曲线样品，配制方法同实施例1，其它条件与实施例1相同。即，使用替代基质A与标准曲线工作液按照95:5(v/v)的比例配制替代标准曲线样品，使用这些样品进行标准曲线的绘制。连续3次的加权(1/X)线性回归产生0.996或更高的相关系数，精度为±20％，揭示可量化范围为：

山梨醇、甘露醇和赤藓糖醇：50-5000ng/mL；

核糖醇：25-2500ng/mL；

肌醇：300-30000ng/mL。

图16-19是用UPLC-MS/MS测量的替代基质(0.01M磷酸盐缓冲液)中糖醇定量的线性图线。糖醇在替代基质中标准曲线为：

山梨醇标准曲线(图16)：y＝0.000427x+0.00974(r＝0.9964)

甘露醇标准曲线(图17)：y＝0.000486x+0.00103(r＝0.9994)

肌醇标准曲线(图18)：y＝0.000249x+0.0212(r＝0.9974)

赤藓糖醇标准曲线(图19)：y＝0.000269x+0.0013(r＝0.9995)

核糖醇标准曲线(图20)：y＝0.000258x+0.000833(r＝0.9985)

式中，x为峰面积比，y为糖醇在生物样品中的浓度，单位为ng/mL。

实施例7：批内/批间准确度和精密度研究

用替代基质(0.01M磷酸盐缓冲液)和空白基质(人肝素钠血浆)按照实施例1配制替代质控样品LLOQ(PBS)、LQC(PBS)、MQC(PBS)、HQC(PBS)和真实基质质控样品BQC0(Pl)、BMQC(Pl)、BHQC(Pl)的糖醇生物样品，其它条件与实施例1相同进行批内和批间准确度及精密度研究，以覆盖假定可报道测定范围。在研究批内准确度和精密度时，每一个浓度质控样品至少制备并测定6个样品。在研究批间准确度和精密度时，至少在不同日连续制备并测定3个分析批，参见表5。

表5：不同基质配制的质控样品的批内/批间准确度和精密度

备注：N/A表示不适用。

连续三个分析批考察精密度和准确度，五种糖醇批内和批间精密度和准确度均符合2020年版《中国药典》第四部通则9012生物样品定量分析方法验证指导原则的要求(精密度：≤15％，LLOQ为≤20％；准确度：≤±15％，LLOQ为≤±20％)。

实施例8：平行性研究

用真实空白基质(人肝素钠血浆)按照实施例1，添加HQC工作液配制真实基质BHQC(Pl)质控样品，然后用替代基质(0.01M磷酸盐缓冲液)将BHQC(Pl)样品稀释10倍，平行配制6份，其它条件与实施例1相同。平行性研究结果如表6所示。

表6：真实基质配制的质控样品的平行性

平行稀释6份样品，五种糖醇的相对标准偏差均小于15％，平均测量浓度和理论浓度偏差也在±15％之间，平行性测试符合要求。

实施例9：提取回收率

按照实施例1，经提取的样品配制同替代质控样品配制，未经提取的样品配制同真实基质质控样品配制，其它条件与实施例1相同，根据峰面积计算回收率。提取回收率研究结果如表7所示。这些研究的结果表明，提取回收率符合要求(提取回收率＞80％)。

表7：质控样品的提取回收率

实施例10：未知生物样品分析

按照实施例1，分析20例受试者血浆(抗凝剂二乙胺四乙酸钠盐)样品(来源符合GCP要求)中5种糖醇的浓度，每一个未知生物样品重复测定3次。检测结果如表8所示。

表8：未知生物样品中5种糖醇浓度

Claims (13)

1.一种同时测定生物样品中多种内源性糖醇含量的方法，其特征在于：用于非治疗或非诊断目的的评价药物或者治疗方法的效果，包括如下依次进行的步骤：

S1：经预处理获得含有内标的待富集处理品；

S2：使用UPLC处理含有内标的待富集处理品获得糖醇富集样品；

S3：使用MS/MS检测和/或量化所述糖醇富集样品中的糖醇；

所述糖醇包括山梨醇、甘露醇、赤藓糖醇、核糖醇和肌醇。

2.根据权利要求1所述的一种同时测定生物样品中多种内源性糖醇含量的方法，其特征在于：在S1中，所述预处理的方法为：在样品中加入内标工作液并均质，然后用沉淀剂处理加入内标后的样品，离心取上清再用氮气挥干后用水复溶，获得含有内标的待富集处理品；所述样品为生物样品、质控样品或者用于绘制标准曲线的样品。

3.根据权利要求2所述的一种同时测定生物样品中多种内源性糖醇含量的方法，其特征在于：在S1中，所述生物样品的来源包括人、猴、犬、兔和鼠中的任意一种；所述生物样品为全血、红细胞、血浆、血清、胆汁、唾液、尿、汗或组织；所述内标为6个¹³C标记的山梨醇；所述沉淀剂为甲醇和乙腈组成的混合溶液。

4.根据权利要求3所述的一种同时测定生物样品中多种内源性糖醇含量的方法，其特征在于：在S1中，当生物样品为全血、红细胞或组织时，在生物样品中加入匀浆珠和内标，再匀浆,然后用沉淀剂处理，离心取上清再用氮气挥干后用水复溶，获得含有内标的待富集处理品；当生物样品为血浆时，血浆中含有抗凝剂，所述抗凝剂包括草酸钾、肝素、氟化钠、二乙胺四乙酸钠盐和枸橼酸钠中的任意一种。

5.根据权利要求1所述的一种同时测定生物样品中多种内源性糖醇含量的方法，其特征在于：在S3中，使含糖醇的成分经受电离源，获得糖醇前体离子；然后使糖醇前体离子经受碰撞诱导解离生成碎片离子；测定所述碎片离子的量并换算为所述糖醇的量。

6.根据权利要求5所述的一种同时测定生物样品中多种内源性糖醇含量的方法，其特征在于：所述糖醇前体离子包括质荷比为181.0的山梨醇前体离子，质荷比为181.0的甘露醇前体离子，质荷比为121.0的赤藓糖醇前体离子，质荷比为151.0的核糖醇前体离子和质荷比为179.0的肌醇前体离子。

7.根据权利要求6所述的一种同时测定生物样品中多种内源性糖醇含量的方法，其特征在于：所述碎片离子包括质荷比分别为101.0、89.0、59.0的山梨醇碎片离子，质荷比分别为101.0、89.0、59.0的甘露醇碎片离子，质荷比分别为79.0、71.1、59.0的赤藓糖醇碎片离子，质荷比分别为101.0、89.0、71.0、59.0的核糖醇碎片离子和质荷比分别为91.0、86.9、59.0的肌醇碎片离子。

8.一种同时测定生物样品中多种内源性糖醇含量的系统，包括UPLC-MS/MS设备，其特征在于：其UPLC条件为：

色谱柱：Carbo Sep CHO-620，300×6.5mm；

流动相A：超纯水；

洗针液：超纯水；

流速：0.6mL/min；

柱温：90℃；

进样室温度：2-8℃；

进样量：2-40μL；

洗脱条件：流动相A等度洗脱至少17min。

9.根据权利要求8所述的一种同时测定生物样品中多种内源性糖醇含量的系统，其特征在于：其MS/MS条件为：

气帘气：30psi；

离子源气体1：50psi；

离子源气体2：50psi；

离子源温度：500℃；

加热板块：ON；

离子源电压：-4500V；

CAD：9units；

电离源为电喷雾电离源；电离模式为负离子模式，扫描模式为多反应离子监测。

10.根据权利要求9所述的一种同时测定生物样品中多种内源性糖醇含量的系统，其特征在于：还包括预处理试剂，所述预处理试剂包括内标工作液、沉淀剂和水；所述内标工作液含有6个¹³C标记的山梨醇，所述沉淀剂为甲醇和乙腈组成的混合溶液。

11.根据权利要求10所述的一种同时测定生物样品中多种内源性糖醇含量的系统，其特征在于：还包括质控样品；所述质控样品包括替代质控样品和真实基质样品；所述替代质控样品的原料包括质控工作液和替代基质，所述真实基质样品的原料包括质控工作液和空白基质；所述空白基质为血浆、全血或者红细胞；所述替代基质为0.01M磷酸盐缓冲液，或者为含有0.01g/mL的牛血清白蛋白的0.01M磷酸盐缓冲液。

12.根据权利要求11所述的一种同时测定生物样品中多种内源性糖醇含量的系统，其特征在于：还包括用于绘制标准曲线的样品；所述用于绘制标准曲线的样品的原料包括标准曲线工作液和替代基质。

13.根据权利要求12所述的一种同时测定生物样品中多种内源性糖醇含量的系统，其特征在于：其用于测量样品中的山梨醇、甘露醇或赤藓糖醇的线性范围为50-5000ng/mL；其用于测量样品中的核糖醇的线性范围为25-2500ng/mL；其用于测量样品中的肌醇的线性范围为300-30000ng/mL。

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