CN115586265A - 一种用于检测尿液中5-羟吲哚乙酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种用于检测尿液中5‑羟吲哚乙酸的方法，包括如下步骤：将尿液样品进行前处理，然后采用液相色谱‑质谱法对尿液样品的中的5‑羟吲哚乙酸进行定量分析；本发明采用液相色谱‑质谱法对尿液中的5‑羟吲哚乙酸进行检测，与现有的技术中的检测方法相比，检测过程操作简单，检测时间短、耗材成本低；且该检测方法具有良好的线性关系、精密度和回收率，其线性范围在0.050至20.0μg/mL之间，适用于5‑羟吲哚乙酸在人尿液样本中快速准确地定量分析。
Description
技术领域
本发明涉及一种生物标志物的检测方法，尤其是涉及一种用于检测尿液中5-羟吲哚乙酸的方法。
背景技术
神经内分泌肿瘤(NETs)是一类罕见的且生长缓慢的肿瘤，其特点是能储存和分泌不同的肽和神经胺。NETs不仅检测困难，而且其临床症状缺乏特异性，难以根据症状判断可能的肿瘤类型；同时NETs的临床症状多变，生理失调的症状相似，又类型复杂。
目前，根据NETs的国际诊断共识，这一类肿瘤主要的诊断方法有生化指标诊断、基因检查及影像学检查；由于NETs可能导致各种生物活性物质如嗜铬粒蛋白、血管活性物质及5－羟色胺等的过度分泌，因而这几个生物标志物常用于NETs的诊断和治疗评价。其中5－羟基吲哚乙酸(5－HIAA)是5－羟色胺最主要的代谢产物，对于NETs尤其是肠肿瘤患者，其24h尿液中的5－HIAA含量与临床症状密切相关，因而其被广泛用于监测疾病的进展及治疗疗效的评估。
现有技术中，5-羟吲哚乙酸常用的检测方法有化学显色法、气相色谱法、毛细管电泳法、伏安法、酶联免疫吸附试验法和表面辅助激光解吸电离-飞行时间质谱检测等方法。其中化学显色法操作复杂，且在萃取过程中容易造成5-HIAA的损失，相对来说敏感性较低；而气相色谱法需要用氯甲酸乙酯/乙醇进行初步衍生，然后萃取出相应的衍生物，最终采用气相色谱-三重四极杆质谱系统进行多反应监测(MRM)采集，对分析物进行鉴定和定量，操作麻烦，精度低；毛细管电泳法，伏安法，表面辅助激光解吸电离-飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)检测法、酶联免疫吸附试验法等均虽然具有较高的检测精准度，但是由于5-羟吲哚乙酸广泛存在于不同的生物基质中，如尿液、血浆、血清和脑脊液，如果对这些生物样本进行分析，则需要先对这些生物样本进行提取、并进行前处理，除掉生物基质中大部分的杂质和干扰物，避免基质效应对分析物定量分析的干扰，其存在样本提取困难，操作繁琐，检测时间过长，且使用的耗材成本较高的技术问题。
因此，有必要提供一种新的技术方案以克服上述缺陷。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于检测尿液中5-羟吲哚乙酸的方法；该方法可以对24小时尿液中5-羟吲哚乙酸进行含量测定，且测定过程操作简单，检测快速、耗材成本低。
为达到本发明之目的，采用如下技术方案：
本发明提供的一种用于检测尿液中5-羟吲哚乙酸的方法，包括如下步骤：将尿液样品进行前处理，然后采用液相色谱-质谱法对尿液样品的中的5-羟吲哚乙酸进行定量分析。
优选的，所述前处理包括如下步骤：
取10ul尿液样本，加入190ul的含有5-HIAA内标的75％乙腈水溶液，振荡5min，而后离心10min，离心转速为12000rpm，随后吸取100ul上清液，采用液相色谱-质谱法进行定量分析。
优选的，所述液相色谱-质谱法中，液相色谱的色谱条件如下：
色谱柱：Phenomenex Kinetex F5；
流动相：A相：2mM NH4F-0.1％甲酸水；
B相：2mM NH4F-0.1％甲酸乙腈；
梯度洗脱程序：0-0.5min，25％B相；0.6-2.1min，100％B相，2.2-2.5min25％B相；
流动相的流速：0.4mL/min。
优选的，所述色谱柱的规格为100A，100×3mm。
优选的，所述色谱柱的柱温为40℃。
优选的，进样体积为2μL。
优选的，所述液相色谱-质谱法中，所述质谱检测的参数包括：
离子源：电喷雾离子源；离子喷射电压：-4500V；温度500℃；喷雾气压力：55psi；辅助气压力：60psi；气帘气体压力：30psi；检测方式：负离子监测；扫描方式：多重反应监测。
优选的，当待测物质为5-HIAA时，质谱参数如下：监测离子对为190.1/146.2，去簇电压为-80V,碰撞电压为-15eV。
优选的，当待测物质为5-HIAA-d5时，质谱参数如下：监测离子对为195.1/151.0，去簇电压为-80V,碰撞电压为-15eV。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明采用液相色谱-质谱法对尿液中的5-羟吲哚乙酸进行检测，与现有的技术中的检测方法相比，检测过程操作简单，检测时间短、耗材成本低；且该检测方法具有良好的线性关系、精密度和回收率，其线性范围在0.050至20.0μg/mL之间，适用于5-羟吲哚乙酸在人尿液样本中快速准确地定量分析。
具体实施方式
为了使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例是本发明的部分实施例，而不是全部实施例。
本发明提供的一种用于检测尿液中5-羟吲哚乙酸的方法，包括如下步骤：将尿液样品进行前处理，然后采用液相色谱-质谱法对尿液样品的中的5-羟吲哚乙酸进行定量分析。
其中，所述前处理包括如下步骤：
取10ul尿液样本，加入190ul的含有5-HIAA内标的75％乙腈水溶液，振荡5min，而后离心10min，离心转速为12000rpm，随后吸取100ul上清液，采用液相色谱-质谱法进行定量分析。
所述液相色谱-质谱法中，液相色谱的色谱条件如下：
色谱柱：Phenomenex Kinetex F5；100A，100×3mm；
流动相：A相：2mM NH4F-0.1％甲酸水；
B相：2mM NH4F-0.1％甲酸乙腈；
梯度洗脱程序：0-0.5min，25％B相；0.6-2.1min，100％B相，2.2-2.5min25％B相；
流动相的流速：0.4mL/min。
色谱柱的柱温为40℃；
进样体积为2μL。
所述质谱检测的参数包括：
离子源：电喷雾离子源；离子喷射电压：-4500V；温度500℃；喷雾气压力：55psi；辅助气压力：60psi；气帘气体压力：30psi；检测方式：负离子监测；扫描方式：多重反应监测；当待测物质为5-HIAA时，质谱参数如下：监测离子对为190.1/146.2，去簇电压为-80V,碰撞电压为-15eV；当待测物质为5-HIAA-d5时，质谱参数如下：监测离子对为195.1/151.0，去簇电压为-80V,碰撞电压为-15eV。
1、线性关系测试
绘制标准曲线：
S1：准确称量10mg的5-HIAA标准品，按照纯度进行校正；溶解于5mL的乙腈水溶液中得到浓度为2000μg/mL的标准储备液，储存于-20℃备用。
S2：准确称量1mg的5-HIAA-d5标准品，按照纯度进行校正；溶解于10mL的乙腈水溶液中得到浓度为100μg/mL的内标标准储备液，储存于-20℃备用。
S3：使用标准储备液经乙腈水稀释后配制成浓度为1.00、5.00、25.0、50.0、100.0和200μg/mL的二级储备液。
S4：使用人工尿液和二级储备液配制成浓度为：0.100、0.500、2.50、5.00、10.0、20.0μg/mL的标准曲线。
S5：使用内标标准储备液经乙腈水稀释后配制成浓度为0.50ug/ml的内标工作液。
以待测物的浓度为横坐标，以待测物与内标的峰面积的比值为纵坐标，用加权最小二乘法进行回归计算，最小二乘法进行回归运算，求得的直线回归方程即为标准曲线。各待测物标准曲线的线性相关系数如表1所示。
2、批内批间准确度和精密度测试
对于批间精密度，在56天的时间里，在7个不同的日期分别进行7个分析序列，反复分析所有高低浓度的QC样品；每天都进行校准，以确保结果的正确性；准确度的计算方法为：QC样品在每个浓度水平上的测量平均值除以实际值；通过测量QC样品在同一天的三个不同时间的CV来评估批内精度，相关数据见表1。
表1
由表1的数据可知，本发明的方法线性关系良好，检测值准确、精密。
所述对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。
Claims (9)
1.一种用于检测尿液中5-羟吲哚乙酸的方法，其特征在于：包括如下步骤：将尿液样品进行前处理，然后采用液相色谱-质谱法对尿液样品的中的5-羟吲哚乙酸进行定量分析。
2.根据权利要求1所述的一种用于检测尿液中5-羟吲哚乙酸的方法，其特征在于：所述前处理包括如下步骤：
取10ul尿液样本，加入190ul的含有5-HIAA内标的75％乙腈水溶液，振荡5min，而后离心10min，离心转速为12000rpm，随后吸取100ul上清液，采用液相色谱-质谱法进行定量分析。
3.根据权利要求1所述的一种用于检测尿液中5-羟吲哚乙酸的方法，其特征在于：所述液相色谱-质谱法中，液相色谱的色谱条件如下：
色谱柱：Phenomenex Kinetex F5；
流动相：A相：2mM NH4F-0.1％甲酸水；
B相：2mM NH4F-0.1％甲酸乙腈；
梯度洗脱程序：0-0.5min，25％B相；0.6-2.1min，100％B相，2.2-2.5min25％B相；
流动相的流速：0.4mL/min。
4.根据权利要求3所述的一种用于检测尿液中5-羟吲哚乙酸的方法，其特征在于：所述色谱柱的规格为100A，100×3mm。
5.根据权利要求3所述的一种用于检测尿液中5-羟吲哚乙酸的方法，其特征在于：所述色谱柱的柱温为40℃。
6.根据权利要求3所述的一种用于检测尿液中5-羟吲哚乙酸的方法，其特征在于：进样体积为2μL。
7.根据权利要求1所述的一种用于检测尿液中5-羟吲哚乙酸的方法，其特征在于：所述液相色谱-质谱法中，所述质谱检测的参数包括：
离子源：电喷雾离子源；离子喷射电压：-4500V；温度500℃；喷雾气压力：55psi；辅助气压力：60psi；气帘气体压力：30psi；检测方式：负离子监测；扫描方式：多重反应监测。
8.根据权利要求6所述的一种用于检测尿液中5-羟吲哚乙酸的方法，其特征在于：当待测物质为5-HIAA时，质谱参数如下：监测离子对为190.1/146.2，去簇电压为-80V,碰撞电压为-15eV。
9.根据权利要求6所述的一种用于检测尿液中5-羟吲哚乙酸的方法，其特征在于：当待测物质为5-HIAA-d5时，质谱参数如下：监测离子对为195.1/151.0，去簇电压为-80V,碰撞电压为-15eV。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| WW01 | Invention patent application withdrawn after publication |
Application publication date: 20230110 |
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| WW01 | Invention patent application withdrawn after publication |