CN115389682A

CN115389682A - 用于检测血浆和尿液中儿茶酚胺及其代谢产物的试剂盒及其应用

Info

Publication number: CN115389682A
Application number: CN202211112168.2A
Authority: CN
Inventors: 丁沛瑜; 张新星; 栗琳; 周立; 丁亮; 宋兆晴; 苏营雪; 赵炽娜; 郑佳
Original assignee: Hunan Haosi Biotechnology Co ltd; Jiangsu Haosi Muke Biotechnology Co ltd; Beijing Haosi Biotechnology Co ltd
Current assignee: Hunan Haosi Biotechnology Co ltd; Jiangsu Haosi Muke Biotechnology Co ltd; Beijing Haosi Biotechnology Co ltd
Priority date: 2022-09-13
Filing date: 2022-09-13
Publication date: 2022-11-25
Anticipated expiration: 2042-09-13
Also published as: CN115389682B

Abstract

本发明提供了一种用于检测血浆和尿液中儿茶酚胺及其代谢产物的试剂盒及其应用，涉及儿茶酚胺及其代谢产物检测的技术领域。该试剂盒检测的目标物质包括3‑MT、MN、NMN、DA、E和NE，包含用于样本前处理试剂稀释液C；用于固相萃取的活化液、淋洗液、洗脱液和复溶液；以及用于LC‑MS/MS检测的校准品和内标。该试剂盒通过LC‑MS/MS的方法检测血浆和尿液中的儿茶酚胺及其代谢物，使用SPE法对样本进行处理，采用选择性吸附、选择性洗脱的方式对样本进行富集、分离、净化，具有选择性良好，灵敏度高和检测快速的优点。

Description

用于检测血浆和尿液中儿茶酚胺及其代谢产物的试剂盒及其应用

技术领域

本发明涉及儿茶酚胺及其代谢产物检测技术领域，尤其是涉及一种用于检测血浆和尿液中儿茶酚胺及其代谢产物的试剂盒及其应用。

背景技术

儿茶酚胺(Catecholamines，CAs)是一种含有儿茶酚和胺基的神经类物质。它是人体内重要的神经递质和激素，主要包括肾上腺素(Epinephrine，E)、去甲肾上腺素(Norepinephrine，NE)和多巴胺(Dopamine，DA)。CAs是由肾上腺髓质、肾上腺神经元以及肾上腺外嗜铬体合成与分泌的单胺类神经递质，是具有较强的生理活性的内源性物质，在大脑和神经信号传导中起着重要的作用。血浆和尿液中CAs及其代谢物水平与人体多种生理、病理现象有密切关系。临床研究发现，CAs及其代谢物的体内水平与人体多种生理、病理现象有密切关系，对心血管系统、神经系统、内分泌系统、肾脏、平滑肌组织等生理活动起着调节作用。儿茶酚胺的代谢物主要包括变肾上腺素(Metanphrine，MN)、去甲肾上腺素(Normetanephrine，NMN)、3-甲氧酪胺(3-Methoxytyramine，3-MT)、香草扁桃酸(Vanillylmandelic acid，VMA)和高香草酸(Homovanillic acid，HVA)。多巴胺、肾上腺素和去甲肾上腺素通过儿茶酚-O-甲基转移酶(COMT)形成代谢物3-MT、MN和NMN。

嗜铬细胞瘤(pheochromocytoma，PCC)起源于肾上腺髓质嗜铬细胞，分泌生产儿茶酚胺；副神经节瘤(paraganglioma，PGL)起源于肾上腺外嗜铬细胞，位于胸、腹和盆腔脊柱旁交感神经链，也可来源于沿颈部和颅底分布的舌咽、迷走神经的副交感神经节，后常不产生CA。PCC占80％～85％，PGL占15％～20％，二者合称PPGLs(pheochromocytomas orparagangliomas)，是继发性高血压的少见类型，在普通门诊高血压患者中的患病率为0.2％-0.6％。副神经节瘤的临床表现多为顽固性高血压，有的患者伴有发作性多汗、心悸、头痛、震颤、皮肤苍白等症状和/或体位性低血压；有的首发症状为麻醉时出现高血压或高血压危象；有的患者可因严重心血管并发症而致死亡。NMN和MN(合称MNs)仅在肾上腺髓质和嗜铬细胞瘤和副神经节瘤(pheochromocytoma and paraganglioma，PPGL)内代谢生成并且以高浓度水平持续存在，故是PPGL的特异性标记物。《嗜铬细胞瘤和副神经节瘤诊断治疗的专家共识》中推荐PPGL的首选生化检验为测定血游离MNs或尿MNs浓度，其次可检测血或尿NE、E、DA浓度以帮助进行诊断。

因儿茶酚胺在体内浓度水平对临床的意义，建立选择性良好，灵敏度高，快速准确的分析方法具有重要意义。目前国内外对于生物样本中儿茶酚胺的测定方法报道和文献比较多，主要方法是高效液相色谱法(HPLC)、毛细管电泳法(CE)、电化学和荧光光度法(FL)等。毛细管电泳法、电化学和荧光光度法等方法简单，但是灵敏度差，易被干扰，多化合物联检表现出不足。而HPLC法由于具有方便、快速、准确等优点，是CAs最常用的分析方法。相比于HPLC-ECD和HPLC-FLD法，LC-MS/MS方法能够高效、高灵敏度分离和检测待测物质。因血浆内儿茶酚胺及其代谢物含量较低，对于CAs水平，建议采用LC-MS/MS法。

市面上已有江西美康的儿茶酚胺检测试剂盒，美康生物科技有限公司于2018年申请的专利“用于准确测定体液样本中儿茶酚胺和变肾上腺素的质谱试剂盒”，对血浆样本进行蛋白沉淀，然后进行衍生化反应，将衍生化样品用液相色谱串联质谱进行检测，该试剂盒同时检测3种儿茶酚胺和2种变肾上腺素。对于衍生化方法，衍生条件的自由度有所限制，过量试剂或试剂的水解产物可能造成干扰，容易引入杂质或干扰峰，使分离度降低，也有可能造成样品损失。因此，一种改进的适用于LC-MS/MS法检测血浆和尿液中儿茶酚胺及其代谢产物的产品是目前需要的。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的第一目的在于提供一种用于检测血浆和尿液中儿茶酚胺及其代谢产物的试剂盒，该试剂盒适用于LC-MS/MS法检测血浆和尿液中儿茶酚胺及其代谢产物，具有选择性良好，灵敏度高，检测快速的优点。

本发明的第二目的在于提供上述用于检测血浆和尿液中儿茶酚胺及其代谢产物的试剂盒在非诊断和治疗目的的检测血浆和尿液中儿茶酚胺及其代谢产物中的应用。

为解决上述技术问题，本发明特采用如下技术方案：

根据本发明的一个方面，本发明提供了一种用于检测血浆和尿液中儿茶酚胺及其代谢产物的试剂盒，包括样本前处理试剂、固相萃取试剂和LC-MS/MS检测试剂；

所述样本前处理试剂包括稀释液C，所述稀释液C为20～50mM的乙酸铵溶液；或，20～50mM的甲酸铵溶液，所述甲酸铵溶液中还含有甲酸，以体积百分数计，所述甲酸含量为0.05～0.2％；

所述固相萃取试剂包括活化液、淋洗液、洗脱液和复溶液；

所述活化液为20～50mM的乙酸铵溶液；

所述淋洗液为20～50mM的乙酸铵溶液；

所述洗脱液含有体积比为(95～100)：(5～1)的乙腈和水；以体积百分比计，所述洗脱液还含有1～5％甲酸；

所述复溶液为水，或含有甲酸的水溶液；以体积百分比计，含有甲酸的水溶液中甲酸的浓度为0.1～1％；

所述LC-MS/MS检测试剂包括校准品和内标，所述校准品为含有3-MT、MN、NMN、DA、E和NE的混合溶液，所述校准品工作时各物质的目标浓度范围如下：

3-MT：10～4000pg/mL、MN：20～8000pg/mL、NMN:20～8000pg/mL、DA:25～10000pg/mL、E:50～20000pg/mL和NE:125～50000pg/mL；

所述内标为DA-d4、E-d6、NE-d6、NMN-d3、MN-d3和3-MT-d4。

根据本发明的一个方面，本发明提供了上述试剂盒在非诊断和治疗目的的检测血浆和尿液中儿茶酚胺及其代谢产物中的应用，所述检测包括：

将经过固相萃取的样本进行LC-MS/MS检测；所述样本包括校准品工作液、质控品工作液、血浆样本或尿液样本；

所述固相萃取依次包括活化、上样、淋洗、洗脱、氮吹和复溶；所述活化包括先使用甲醇活化，再使用所述活化液活化；所述淋洗包括先使用所述淋洗液淋洗，再使用甲醇淋洗。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明提供的检测血浆和尿液中儿茶酚胺及其代谢产物的试剂盒检测的目标物质包括3-MT、MN、NMN、DA、E和NE。该试剂盒通过液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)的方法检测血浆和尿液中的儿茶酚胺及其代谢物，使用SPE法对样本进行处理，采用选择性吸附、选择性洗脱的方式对样本进行富集、分离、净化，目的在于降低样品基质干扰，提高检测灵敏度。该试剂盒包括优化的样本前处理试剂、优化的固相萃取试剂和优化的LC-MS/MS检测试剂，能够得到更准确的结果，能够高效、高灵敏度分离和检测待测物质。

使用该试剂盒检测3-MT、MN、NMN、DA、E和NE的相关系数r均≥0.990；低值质控品重复性的变异系数(CV)≤15％，高值质控品重复性的变异系数(CV)≤15％；校准品低值准确度的相对偏差(B)≤±20％，其他校准品准确度的相对偏差(B)≤±15％，加标回收率为85％～115％。该试剂盒能够满足方法验证过程中对线性，重复性，准确度、残留等要求，对临床检测人体儿茶酚胺及其代谢物有重要意义。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明实施例1提供的试剂盒检测样本的谱图。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

根据本发明的一个方面，本发明提供了一种用于检测血浆和尿液中儿茶酚胺及其代谢产物的试剂盒，该试剂盒适用于采用固相萃取法处理样本，然后以LC-MS/MS检测样本的检测方法。该试剂盒中的试剂主要由样本前处理试剂、固相萃取试剂和LC-MS/MS检测试剂组成。

样本前处理试剂包括稀释液C，所述稀释液C用于在固相萃取前和对照样本混合，所述对照样本为校准品工作液或质控品工作液。

所述稀释液C为20～50mM的乙酸铵溶液，例如可以为但不限于为20、30、40或50mM；或，20～50mM的甲酸铵溶液，例如可以为但不限于为20、30、40或50mM；所述甲酸铵溶液中还含有甲酸，以体积百分数计，所述甲酸含量为0.05～0.2％，例如可以为但不限于为0.05％、0.1％、0.15％或0.2％。所述稀释液C优选为50mM的乙酸铵溶液。

固相萃取试剂包括活化液、淋洗液、洗脱液和复溶液。

活化液用于SPE柱使用甲醇活化后对柱进行活化，所述活化液为20～50mM的乙酸铵溶液，例如可以为但不限于为20、30、40或50mM的乙酸铵溶液，优选为20mM乙酸铵溶液。

淋洗液用于固相萃取的淋洗步骤，淋洗的目的是洗去吸附于固定相上的干扰组分，所述淋洗液为20～50mM的乙酸铵溶液，例如可以为但不限于为20、30、40或50mM的乙酸铵溶液，优选为20mM乙酸铵溶液。

洗脱液用于固相萃取的洗脱步骤，洗脱液的目的是洗脱待分析物，洗脱液含有体积比为(95～100)：(5～1)的乙腈和水，例如可以为但不限于为95:5、96:4、97:3、98:2、99:1或100:1；以体积百分比计，所述洗脱液还含有1～5％甲酸，例如可以为但不限于为1％、2％、3％、4％或5％的甲酸。所述洗脱液中优选还含有抗氧化剂，所述抗氧化剂优选采用BHT(2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚)；本发明通过实验发现，当洗脱液中含有BHT时可以获得更多响应，且对化合物没有影响。以体积百分比计，所述洗脱液中BHT的含量不超过0.05％；例如可以为但不限于为0.01％、0.02％、0.03％、0.04％或0.05％。洗脱液的优选组成如下：含有体积比为98：2的乙腈和水；以体积百分比计，还含有2％甲酸和0.01％BHT。

复溶液用于将经氮吹后的待分析物复溶，复溶液为水；或，含有甲酸的水溶液；以体积百分比计，所述甲酸水溶液浓度为0.1～1％，例如可以为但不限于为0.1％、0.2％、0.5％、0.8％或1％，所述复溶液优选为含有甲酸的水溶液，更优选以体积百分比计，含有0.1％的甲酸水溶液。可选地，所述复溶液中还可以含有抗氧化剂；所述抗氧化剂包括柠檬酸、绿原酸、抗坏血酸、焦亚硫酸钠、硫代硫酸钠、焦性没食子酸或谷胱甘肽。

LC-MS/MS检测试剂包括校准品和内标，可选地还含有质控品。

校准品为含有3-MT、MN、NMN、DA、E和NE的混合溶液，校准品工作时，3-MT、MN、NMN、DA、E和NE在如下目标浓度范围内构建标准曲线：3-MT：10～4000pg/mL、MN：20～8000pg/mL、NMN:20～8000pg/mL、DA:25～10000pg/mL、E:50～20000pg/mL和NE:125～50000pg/mL。

在一些可选的实施方式中，所述校准品包括校准品C1～C6，校准品C1～C6在使用时使用水稀释至构建曲线的目标浓度，作为校准品工作液。

所述校准品C1～C6中各物质的目标浓度如下：

校准品C1:3-MT:0.1ng/mL、MN:0.2ng/mL、NMN:0.2ng/mL、DA:0.25ng/mL、E:0.5g/mL和NE:1.25ng/mL；

校准品C2:3-MT:0.25ng/mL、MN:0.5/mL、NMN:0.5/mL、DA:0.625ng/mL、E:1.25ng/mL和NE:3.125ng/mL；

校准品C3:3-MT:1ng/mL、MN:2ng/mL、NMN:2ng/mL、DA:2.5ng/mL、E:5ng/mL和NE:12.5ng/mL；

校准品C4:3-MT:6ng/mL、MN:12ng/mL、NMN:12ng/mL、DA:15ng/mL、E:30ng/mL和NE:75ng/mL；

校准品C5:3-MT:18ng/mL、MN:36ng/mL、NMN:36ng/mL、DA:45ng/mL、E:90ng/mL和NE:225ng/mL；

校准品C6:3-MT:40ng/mL、MN:80ng/mL、NMN:80ng/mL、DA:100ng/mL、E:200ng/mL和NE:500ng/mL。

在一些可选的实施方式中，所述试剂盒中的校准品为校准品工作液，在检测时可以直接使用，所述校准品工作液包括校准品S1～S6，所述校准品工作液以水为基质；所述校准品S1～S6中各物质的目标浓度如下：

校准品S1:3-MT:10pg/mL、MN:20pg/mL、NMN:20pg/mL、DA:25pg/mL、E:50pg/mL和NE:125pg/mL；

校准品S2:3-MT:25pg/mL、MN:50pg/mL、NMN:50pg/mL、DA:62.5pg/mL、E:125pg/mL和NE:312.5；

校准品S3:3-MT:100pg/mL、MN:200pg/mL、NMN:200pg/mL、DA:250pg/mL、E:500pg/mL和NE:1250pg/mL；

校准品S4:3-MT:600pg/mL、MN:1200pg/mL、NMN:1200pg/mL、DA:1500pg/mL、E:3000pg/mL和NE:7500pg/mL；

校准品S5:3-MT:1800pg/mL、MN:3600pg/mL、NMN:3600pg/mL、DA:4500pg/mL、E:9000pg/mL和NE:22500pg/mL；

校准品S6:3-MT:4000pg/mL、MN:8000pg/mL、NMN:8000pg/mL、DA:10000pg/mL、E:20000pg/mL和NE:50000pg/mL。

内标为DA-d4、E-d6、NE-d6、NMN-d3、MN-d3和3-MT-d4。

在一些可选的实施方式中，所述内标为内标工作液，所述内标工作液中DA-d4、E-d6、NE-d6、NMN-d3、MN-d3和3-MT-d4的目标浓度为：3-MT-d4：0.2μg/mL；MN-d3：0.3μg/mL；NMN-d3：0.5μg/mL；DA-d4：0.1μg/mL；E-d6：0.05μg/mL和NE-d6：1.5μg/mL。

本发明提供的试剂盒还可选的包括质控品，以用于对检测结果进行质量控制。

在一些可选的实施方式中，所述质控品包括质控品QCⅠ、质控品QCⅡ和质控品QCⅢ；以及稀释液A和稀释液B；质控品中各物质浓度如下：

质控品QCⅠ：3-MT:0.4ng/mL、MN:0.8ng/mL、NMN:0.8ng/mL、DA:1ng/mL、E:2ng/mL和NE:5ng/mL；

质控品QCⅡ：3-MT:2ng/mL、MN:4ng/mL、NMN:4ng/mL、DA:5ng/mL、E:10ng/mL和NE:25ng/mL；

质控品QCⅢ：3-MT:15ng/mL、MN:30ng/mL、NMN:30ng/mL、DA:37.5ng/mL、E:75ng/mL和NE:187.5ng/mL；

稀释液A用于配制血浆液质控品，其为含有BSA的缓冲液，按照质量体积比计，BSA的浓度为1～5％，例如可以为但不限于为1％、2％、3％、4％或5％，优选为按照质量体积比计含1％BSA的PBS缓冲液。

稀释液B用于配制尿液质控品，所述稀释液B为人工尿液、生理盐水或缓冲液，优选为PBS缓冲液。

在一些可选的实施方式中，质控品为质控品工作液，使用时无需配制可直接使用，所述质控品工作液优选包括血浆质控品工作液和/或尿液质控品工作液。

在一些可选的实施方式中，所述血浆质控品工作液包括低值血浆质控品工作液和高值血浆质控品工作液；血浆质控品工作液的基质优选为含有BSA的缓冲液，按照质量体积比计，BSA的浓度为1～5％，例如可以为但不限于为1％、2％、3％、4％或5％，缓冲液可选地为PBS缓冲液。血浆质控品工作液的基质优选为按照质量体积比计含1％BSA的PBS缓冲液。以含有牛血清蛋白的缓冲液作为血清样本的替代基质，具有易于获得、成本低、质量易于控制等优点。

所述低值血浆质控品工作液中各物质的目标浓度为：3-MT:40pg/mL、MN:80pg/mL、NMN:80pg/mL、DA:100pg/mL、E:200pg/mL和NE:500pg/mL；所述高值血浆质控品工作液中各物质的目标浓度为：3-MT:200pg/mL、MN:400pg/mL、NMN:400pg/mL、DA:500pg/mL、E:1000pg/mL和NE:2500pg/mL。

在一些可选的实施方式中，所述尿液质控品工作液包括低值尿液质控品工作液和高值尿液质控品工作液；所述尿液质控品工作液优选以人工尿液、生理盐水或缓冲液作为基质，优选以缓冲液作为基质，更优选以PBS缓冲液作为基质。上述基质作为人尿液样本的替代基质具有稳定性好又易于获得，以及方便保存的优点。

所述低值尿液质控品工作液中各物质的目标浓度为：3-MT:400pg/mL、MN:800pg/mL、NMN:800pg/mL、DA:1000pg/mL、E:2000pg/mL和NE:5000pg/mL；所述高值尿液质控品工作液中各物质的目标浓度为：3-MT:3000pg/mL、MN:6000pg/mL、NMN:6000pg/mL、DA:7500pg/mL、E:15000pg/mL和NE:37500pg/mL。

在一些可选的实施方式中，所述LC-MS/MS检测试剂还包括流动相；按照体积百分比计，流动相A为0.05～0.2％甲酸水溶液，例如可以为但不限于为0.05％、0.1％、0.15％或0.2％的甲酸水溶液；流动相B为0.05～0.2％甲酸甲醇溶液，例如可以为但不限于为0.05％、0.1％、0.15％或0.2％的甲醇溶液。流动相A优选为0.1％甲酸水溶液；流动相B优选为0.1％甲酸甲醇溶液。

使用该试剂盒快速测定血浆和尿液中儿茶酚胺及其代谢物的浓度，具有灵敏度高，特异性强，重复性好，准确度高等特点，该方法多巴胺的线性范围是25～10000pg/mL，肾上腺素的线性范围是50～20000pg/mL，去甲肾上腺素的线性范围是125～50000pg/mL，去甲变肾上腺素的线性范围是20～8000pg/mL，变肾上腺素的线性范围是20～8000pg/mL，3-甲氧酪氨的线性范围是10～4000pg/mL，相关系数r均≥0.990；低值质控品重复性的变异系数(CV)≤15％，高值质控品重复性的变异系数(CV)≤15％；校准品低值准确度的相对偏差(B)≤±15％，其他校准品准确度的相对偏差(B)≤±15％，加标回收率为85％～115％。该试剂盒能够满足方法验证过程中对线性，重复性，准确度、残留等要求，对临床检测人体儿茶酚胺及其代谢物有重要意义。

根据本发明的另一个方面，本发明还提供了上述试剂盒在非诊断和治疗目的的检测血浆和尿液中儿茶酚胺及其代谢产物中的应用，其中检测包括：

所述固相萃取依次包括活化、上样、淋洗、洗脱、氮吹和复溶；所述活化包括先使用甲醇活化，再使用所述化液活化；所述淋洗包括先使用所述淋洗液淋洗，再使用甲醇淋洗。

该应用基于上述检测血浆和尿液中儿茶酚胺及其代谢产物的试剂盒的发明构思，因此具有上述试剂盒全部的技术效果，在此不再赘述。

下面结合优选实施例进一步说明本申请的技术方案和有益效果。

实施例1

本实施例提供了一种用于检测血浆和尿液中儿茶酚胺及其代谢产物的试剂盒，包括前处理试剂、固相萃取试剂和LC-MS/MS检测试剂，具体的包括稀释液A、稀释液B、稀释液C、活化液、淋洗液、洗脱液、复溶液、校准品C1～C6、内标工作液和质控品QCⅠ、质控品QCⅡ和质控品QCⅢ，流动相A和流动相B。各试剂的具体配制方法如下：

1.化合物及内标储备液的配制

精密称取DA、E、NE适量，用5％1M HCl-甲醇溶解、定容，分别配制成1mg/mL的储备液，置于-80℃冰箱中保存。

精密称取内标DA-d4、E-d6、NE-d6、NMN-d3、MN-d3、3-MT-d4适量，用5％1M HCl-甲醇溶解、定容，分别配制成0.1mg/mL的储备液，置于-80℃冰箱中保存。

NMN和MN的1.0mg/mL溶液直接作为储备液使用，3-MT的1.0mg/mL溶液作为储备液使用，均置于-80℃冰箱中保存。

2.标准品的配制

精密移取下化合物储备液适量，用5％1M HCl-甲醇稀释成适当质量浓度的次级储备液。精密移取次级储备液置于100mL容量瓶中，适量0.05M HCl水溶液定容，制成校准品C6。

精密移取20mL 5％1M HCl-甲醇，与380mL 0.05M HCl水溶液混合均匀，制成H0。

再由适量C6和适量H0按照不同稀释倍数配制C1～C5,具体配制方法见下表。

表1

表2

表3

3.质控品的配制

由适量C6和适量H0按照不同稀释倍数配制质控品QCⅠ、QCⅡ和QCⅢ，具体配制方法见下表。

表4

4.内标配置

精密移取适量内标储备液，配制内标，具体配制方法见下表。

表5

5.其他试剂配制

5.1稀释液A配制：精密称量5g牛血清白蛋白，用500mL 1×PBS溶液溶解，混合均匀，过滤，即得到1％BSA溶液。

5.2稀释液B配制：量取10×PBS溶液100mL，加入900mL超纯水，混合均匀，即得到1×PBS溶液。

5.3稀释液C配制：50mM乙酸铵。

5.4活化液2/淋洗液1配制：精密称量0.77g乙酸铵，用500ml超纯水溶解，混合均匀，即得到20mM乙酸铵溶液。

5.5洗脱液配制：乙腈/水：98/2(含有2％甲酸，0.01％BHT)。

5.6复溶液配制：0.1％甲酸水溶液。

5.7流动相A：移取0.5mL甲酸加入到500mL超纯水中，混合均匀，超声5min，去除气泡。

5.8流动相B：移取0.5mL甲酸加入到500mL甲醇中，混合均匀，超声5min，去除气泡。

实施例2～6

实施例2～6与实施例1的区别仅为稀释液C分别依次为20mM乙酸铵、20mM甲酸铵(含0.1％甲酸)和50mM甲酸铵(含0.1％甲酸)。

实施例7～9

实施例7～9与实施例1的区别仅在于复溶液分别依次为水、0.5％甲酸水溶液和1％甲酸水溶液。

实施例10

实施例10与实施例1的区别仅在于，洗脱液不含有BHT。

实施例1～10提供的试剂盒处理样品的方法如下：

1.样品处理方法

1.1校准品工作液的配制：S1～S6溶液的配制：取校准品C1～C6各50μL，分别加入纯化水450μL，涡旋混匀，即得。

表6校准品工作液浓度

1.2质控品配制

1.2.1血浆质控品工作液的配制：取质控品QCⅠ50μL，再加入稀释液A 450μL，混合均匀，即得P-LQC；取质控品QCⅡ50μL，再加入稀释液A 450μL，混合均匀，即得P-HQC。

1.2.2尿液质控品工作液的配制：取质控品QCⅡ100μL，再加入稀释液B 400μL，混合均匀，即得U-LQC；取质控品QCⅢ100μL，再加入稀释液B 400μL，混合均匀，即得U-HQC。

表7质控品工作液浓度

1.3校准品/质控品/待测样品预处理：

待检测样本：血浆样本恢复至室温；尿液样本恢复至室温，移取10μL尿液，加入990μL超纯水，混合均匀。

准确吸取500μL校准品S1～S6/质控品工作溶液/待测样本于1.5mL离心管中，加入50μL内标，混合均匀，再加入300μL稀释液C，混合均匀。

1.4上机样本制备：

(1)SPE板活化：在固相萃取装置内放入废液槽，将96孔固相萃取板(AgelaCleanert PWCX 96Well Microplates)放入装置上，先往每个小孔内加入300μL甲醇，正压抽干，然后加入300μL 20mM乙酸铵(活化液)，正压抽干。

(2)加载样品：将1.3中样本全部加入上一步骤中经活化的96孔固相萃取板，正压抽干。

(3)淋洗：向96孔固相萃取板中加入500μL 20mM乙酸铵(淋洗液)，正压抽干；再加入500μL甲醇，正压抽干。

(4)洗脱：将废液槽取出，换成样品收集板，加入150μL洗脱液，正压压下，洗脱两次，合并收集，总洗脱体积300μL。

(5)氮吹：上步的收集板置于氮吹仪中，25℃氮气吹干。

(6)复溶：精密移取100μL复溶液，分别加到吹干的各孔中。

(7)震荡：盖上96孔板垫/封口膜，置于96孔板混匀仪中，1500rpm充分震荡3min，混合均匀。

(8)检测：将96孔板置于LC-MS/MS中，进行检测。

2.LC-MS/MS分析

2.1.液相方法

表8

2.2.质谱参数

表9质谱参数

2.3离子信息

表10离子信息

化合物通道标*作为定量离子。

实施例1提供的试剂盒采用上述方法检测样本，得到的图谱如图1所，图1中六个化合物出峰依次是去甲肾上腺素，肾上腺素，去甲变肾上腺素，多巴胺，变肾上腺素和3-甲氧基酪胺。

实施例2～实施例6提供的试剂盒采用上述方法检测样本，结果如表11所示；实施例7～9提供的试剂盒采用上述方法检测样本，结果如表12所示；实施例10提供的试剂盒采用上述方法检测样本，结果如表13所示。

表11

表12

复溶液

DA

E

NE

NMN

MN

3-MT

0.5％甲酸水溶液

3.84E+05

4.70E+04

1.05E+06

2.14E+04

2.47E+05

2.39E+05

1％甲酸水溶液

3.83E+07

4.99E+04

1.05E+06

2.20E+04

2.88E+05

2.41E+05

水

2.26E+05

1.35E+04

5.79E+05

2.17E+05

2.18E+05

2.17E+05

表13

洗脱液

DA

E

NE

NMN

MN

3-MT

乙腈/水/甲酸+BHT

5.58E+04

8.79E+04

6.44E+04

5.88E+04

3.62E+04

3.23E+04

乙腈/水/甲酸

5.93E+04

1.09E+05

8.77E+04

5.74E+04

3.39E+04

3.26E+04

效果例1

校准品均一性

1.验证方案：按照高通量检测人血浆和尿液中儿茶酚胺及其代谢物含量的方法，处理待测产品校准品S1～S6溶液，每个浓度1瓶校准品重复检测10次，计算平均值

和标准差(SD₂)；同一批号每个浓度10瓶，每瓶检测1次，计算10个检测结果的平均值

和标准差(SD₁)，根据公式(1)和(2)计算出变异系数(CV)。

当SD₁＜SD₂时，令CV＝0。

2.接受标准：校准品均一性的变异系数(CV)应≤15％。

3.试验结果：

表14

校准品

DA

E

NE

NMN

MN

3-MT

S1

0.00％

7.61％

4.68％

7.33％

6.13％

9.43％

S2

4.28％

4.01％

5.33％

0.00％

4.52％

2.74％

S3

4.18％

7.74％

0.00％

5.56％

2.04％

0.00％

S4

4.79％

4.67％

5.22％

4.47％

2.48％

0.47％

S5

4.92％

6.10％

5.71％

4.99％

3.43％

4.27％

S6

2.70％

0.00％

3.98％

2.44％

0.00％

4.结论：多巴胺、肾上腺素、去甲肾上腺素、去甲变肾上腺素、变肾上腺素和3-甲氧酪氨的校准品变异系数(CV)均小于15％，满足接受标准。

效果例2

质控品均一性

1.验证方法：对质控品进行测试，测试质控品10瓶，每个浓度水平的质控品随机编号1～10，每瓶重复测试3次。3次测试按照以下顺序进行：1、3、5、7、9、2、4、6、8、10、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1、2、4、6、8、10、1、3、5、7、9。记录测试结果，按照公式(3)～公式(13)计算出变异系数(CV)。

SS_瓶内＝SS_总和-SS_瓶间………………公式(5)

v₁＝a-1………………公式(9)

v₂＝N-a………………公式(10)

式中：

总的测量结果均值；n_i：瓶i的重复测量次数；x_i：指定参数第i次测量值；x_i,j：样品i的第j个结果；MS：均方差；v：自由度；n₀：有效测量次数；a：抽取的样品数量；S_bb：瓶间标准差。

当F＜1时，以Sr代替计算S_bb计算CV_瓶间。

当F＜F_0.05(v₁，v₂₎时，瓶间均一性无显著差异；当F＞F_0.05(v₁，v₂₎、S_bb≤0.3δ(δ为目标标准偏差)时，瓶间均一性良好；计算结果CV_瓶间。

当F＞F_0.05(v₁，v₂₎、S_bb＞0.3δ时，瓶间均一性较差，不计算CV_瓶间。

2.接受标准：质控品的变异系数(CV)≤15％。

3.试验结果：

表15

DA	血-LQC	血-HQC	尿-LQC	尿-HQC
					1	95.947	491.085	987.180	6912.587
2	89.972	463.155	917.188	7169.650
					3	95.950	456.394	879.582	6766.219
4	90.322	490.526	1029.997	6853.338
					5	95.952	523.896	1026.631	7217.237
6	89.076	449.839	967.787	6956.769
					7	95.054	507.212	915.773	6725.778
8	94.838	459.053	944.927	6858.159
					9	91.184	442.464	975.876	6830.135
10	91.462	492.222	972.259	7416.307
					mean	92.97553	477.5844	961.72	6970.618
SS<sub>瓶间</sub>	213.2673	19771.41	62983.29	1351488
					SS<sub>总</sub>	964.0795	43728.64	152795.6	4180978
SS<sub>瓶内</sub>	750.8122	23957.23	89812.27	2829490
					MS<sub>瓶间</sub>	23.69637	2196.823	6998.144	150165.3
MS<sub>瓶内</sub>	37.54061	1197.862	4490.613	141474.5
					F	0.63122	1.833954	1.558394	1.06143
F<sub>0.05(9,20)</sub>	2.3928	2.3928	2.3928	2.3928
					n<sub>0</sub>	3	3	3	3
S<sub>bb</sub>	#NUM！	18.24793	28.91096	53.8232
					Sr	6.127039	34.61014	67.01204	376.131
CV<sub>瓶间</sub>	6.59％	3.82％	3.01％	0.77％

表16

E	血-LQC	血-HQC	尿-LQC	尿-HQC
					1	199.806	1015.843	1987.745	14638.098
2	194.894	1005.292	2116.408	15580.421
					3	206.116	999.652	2235.423	15624.142
4	197.583	1098.666	2134.887	15325.752
					5	215.998	1016.548	1982.469	16178.488
6	209.226	1015.336	2032.074	15591.759
					7	199.045	1030.618	2133.610	15035.921
8	190.800	982.624	2127.397	14728.660
					9	210.089	1004.797	2173.432	16043.651
10	191.453	1031.499	1928.671	15720.505
					mean	201.5011	1020.087	2085.212	15446.73953
SS<sub>瓶间</sub>	1944.784	26228	255880.6	7170084.435
					SS<sub>总</sub>	7906.831	89451.94	784703.5	15319693.36
SS<sub>瓶内</sub>	5962.047	63223.94	528822.9	8149608.924
					MS<sub>瓶间</sub>	216.0872	2914.222	28431.18	796676.0484
MS<sub>瓶内</sub>	298.1023	3161.197	26441.14	407480.4462
					F	0.724876	0.921873	1.075263	1.955127064
F<sub>0.05(9,20)</sub>	2.3928	2.3928	2.3928	2.3928
					n<sub>0</sub>	3	3	3	3
S<sub>bb</sub>	#NUM！	#NUM！	25.75547	360.1831026
					Sr	17.26564	56.22452	162.6073	638.3419508
CV<sub>瓶间</sub>	8.57％	5.51％	1.24％	2.33％

表17

表18

NMN	血-LQC	血-HQC	尿-LQC	尿-HQC
					1	78.247	407.028	866.006	6120.399
2	76.408	391.955	876.447	5836.389
					3	84.733	416.253	785.350	5831.700
4	79.388	422.976	842.138	6319.407
					5	80.514	396.591	887.971	6451.340
6	77.596	417.676	809.743	5663.247
					7	79.416	397.422	864.681	5921.106
8	77.734	381.341	826.546	6036.355
					9	70.792	438.034	830.602	5847.607
10	77.609	413.469	860.696	5820.766
					mean	78.2437	408.2746	845.018	5984.832
SS<sub>瓶间</sub>	329.7962	7585.18	27802.75	1647942
					SS<sub>总</sub>	933.1411	22446.57	85751.68	6600884
SS<sub>瓶内</sub>	603.3449	14861.39	57948.93	4952942
					MS<sub>瓶间</sub>	36.64402	842.7977	3089.194	183104.6
MS<sub>瓶内</sub>	30.16725	743.0693	2897.446	247647.1
					F	1.214696	1.134211	1.066178	0.739377
F<sub>0.05(9,20)</sub>	2.3928	2.3928	2.3928	2.3928
					n<sub>0</sub>	3	3	3	3
S<sub>bb</sub>	1.469328	5.765658	7.994749	#NUM！
					Sr	5.492472	27.2593	53.82793	497.6416
CV<sub>瓶间</sub>	1.88％	1.41％	0.95％	8.32％

表19

表20

3-MT	血-LQC	血-HQC	尿-LQC	尿-HQC
					1	37.392	170.650	352.590	2482.749
2	36.244	174.081	351.737	2443.367
					3	36.282	172.560	368.075	2543.294
4	34.970	173.972	352.620	2594.012
					5	34.938	173.605	358.235	2538.578
6	34.950	172.802	371.616	2585.839
					7	33.931	177.242	363.936	2535.419
8	33.698	179.105	358.657	2436.739
					9	34.595	171.073	347.656	2514.989
10	35.332	174.731	368.858	2509.590
					mean	35.23317	173.982	359.398	2518.458
SS<sub>瓶间</sub>	34.46859	181.7257	1876.241	75721.07
					SS<sub>总</sub>	87.92692	756.1946	3890.4	211395.8
SS<sub>瓶内</sub>	53.45833	574.469	2014.158	135674.8
					MS<sub>瓶间</sub>	3.829843	20.19174	208.4712	8413.453
MS<sub>瓶内</sub>	2.672917	28.72345	100.7079	6783.738
					F	1.432833	0.702971	2.070058	1.240238
F<sub>0.05(9,20)</sub>	2.3928	2.3928	2.3928	2.3928
					n<sub>0</sub>	3	3	3	3
S<sub>bb</sub>	0.621001	#NUM！	5.993422	23.30747
					Sr	1.634906	5.359426	10.03533	82.36345
CV<sub>瓶间</sub>	1.76％	3.08％	1.67％	0.93％

4.结论：质控品的变异系数CV≤15％，满足接受标准。

效果例3

准确度

1.验证方案：人血浆恢复到室温后，离心备用。人尿液用超纯水稀释100倍后备用。血加标回收样本1配制：取质控品QCⅠ50μL，再加入人血浆450μL。血加标回收样本2配制：取质控品QCⅡ50μL，再加入人血浆450μL。尿加标回收样本1配制：取质控品QCⅡ100μL，再加入稀释尿液400μL。尿加标回收样本2配制：取质控品QCⅢ100μL，再加入稀释尿液400μL。

2.接受标准：加标回收，回收率在85％～115％范围内。

3.试验结果：

表21

表22

表23

表24

表25

表26

4.结论：血加标回收样本1，血加标回收样本2，,尿加标回收样本1，尿加标回收样本2，回收率在85％-115％，满足接受标准。

效果例4

重复性

1.验证方案：按照高通量检测血浆和尿液中儿茶酚胺及其代谢物含量的方法，每个样本重复测定10次。计算重复性的变异系数(CV)。

2.接受标准：低值样本CV≤15％，高值样本CV≤15％。

3.实验结果：

表27

表28

4.结论：低值样本的变异系数CV≤15％，高值样本的变异系数CV≤15％，满足接受标准。

效果例5

1.验证方案：在工作校准品拟合的曲线下，计算出各水平校准品重复检测3次的结果，取其平均值M，计算校准品相对偏差(B)。

2.接受标准：相对偏差≤±15％。

3.实验结果：

表29

DA	S1	S2	S3	S4	S5	S6
							1	21.67	71.41	263.74	1420.4	4416.21	10626.66
2	26.08	60.63	288.79	1519.79	5018.08	10167.84
							3	21.39	60.08	275.09	1458.44	4705.6	9911.2
MEAN	23.04667	64.04	275.8733	1466.21	4713.297	10235.233
							靶值	24.663	62.636	257.060	1581.840	4492.914	9750.037
相对偏差	-6.55％	2.24％	7.32％	-7.31％	4.91％	4.98％
							E	C1	C2	C3	C4	C5	C6
1	53.32	102.81	463.46	2793.8	9251.19	19840.02
							2	49.62	123.83	479.42	2817.55	8338.98	19951.88
3	52.26	119.54	468.68	3094.28	8824.42	19131.8
							MEAN	51.73333	115.3933	470.52	2901.877	8804.863	19641.233
靶值	49.805	121.854	486.999	2965.008	8722.509	19592.711
							相对偏差	3.87％	-5.30％	-3.38％	-2.13％	0.94％	0.25％
NE	S1	S2	S3	S4	S5	S6
							1	128.67	325.65	1361.2	7006.76	24036.14	48495.58
2	115.26	345.88	1250.71	7308.88	24419.39	51151.42
							3	108.48	339.57	1249.44	7362.65	21463.98	52822.66
MEAN	117.47	337.0333	1287.117	7226.097	23306.5	50823.22
							靶值	126.48	310.54	1230.52	7248.91	20904.54	46575.66
相对偏差	-7.13％	8.53％	4.60％	-0.31％	11.49％	9.12％
							NMN	S1	S2	S3	S4	S5	S6
1	18.36	52.97	164.84	1048.55	3825.7	8192.97
							2	21.77	56.04	183.12	1296.9	3610.62	8018.62
3	20.13	51.95	207.04	1231.36	3564.77	7858.32
							MEAN	20.08667	53.65333	185	1192.27	3667.03	8023.3033
靶值	20.48	49.81	192.46	1198.80	3493.78	7962.92
							相对偏差	-1.93％	7.71％	-3.88％	-0.54％	4.96％	0.76％
MN	S1	S2	S3	S4	S5	S6
							1	17.55	50.81	185.33	1169.21	3415.35	7461.74
2	20.92	50.05	183	1234.11	3487.79	7306.04
							3	18.22	48.27	203.13	1107.66	3478.35	7259.05
MEAN	18.89667	49.71	190.4867	1170.327	3460.497	7342.2767
							靶值	19.51	49.24	198.38	1195.01	3516.21	7805.57
相对偏差	-3.16％	0.96％	-3.98％	-2.07％	-1.58％	-5.94％
							3-MT	S1	S2	S3	S4	S5	S6
1	9.61	23.17	87.33	516.27	1451.74	3146.73
							2	9.83	22.61	89.69	526.35	1441.68	3198.81
3	9.42	23.31	86.06	527.3	1521.93	3329.89
							MEAN	9.62	23.03	87.69333	523.3067	1471.783	3225.1433
靶值	9.30	22.76	87.68	519.33	1535.90	3417.60
							相对偏差	3.44％	1.21％	0.02％	0.77％	-4.17％	-5.63％

4.结论：相对偏差≤±15％，符合接受标准。

效果例6

线性

1.验证方案：用线性范围上限附近的高浓度样本和接近线性范围下限附近的低浓度样本，按比例混合成6个稀释浓度(Xi)，每个稀释浓度检测3次，分别求出检测结果的均值

以稀释浓度为自变量，以检测结果均值为因变量求出线性回归方程，按公式(14)或数据分析软件计算线性回归的相关系数r。

2.接受标准：线性回归的相关系数r应≥0.990。

3.实验结果：

表30

表31

表32

表33

表34

表35

4.结论：线性回归的相关系数r≥0.990，满足接受标准。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims

1.用于检测血浆和尿液中儿茶酚胺及其代谢产物的试剂盒，其特征在于，包括样本前处理试剂、固相萃取试剂和LC-MS/MS检测试剂；

所述固相萃取试剂包括活化液、淋洗液、洗脱液和复溶液；

所述活化液为20～50mM的乙酸铵溶液；

所述淋洗液为20～50mM的乙酸铵溶液；

所述内标为DA-d4、E-d6、NE-d6、NMN-d3、MN-d3和3-MT-d4。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述稀释液C为50mM的乙酸铵溶液；

优选地，所述活化液为浓度为20mM乙酸铵溶液；

优选地，所述淋洗液为20mM乙酸铵溶液；

优选地，所述洗脱液中还含有抗氧化剂；

优选地，所述抗氧化剂包括BHT；

优选地，以体积百分比计，所述洗脱液中BHT的含量不超过0.05％；

优选地，所述洗脱液含有体积比为98：2的乙腈和水；以体积百分比计，所述洗脱液还含有2％甲酸和0.01％BHT；

优选地，以体积百分比计，所述复溶液为含有0.1～1％甲酸的水溶液；优选地，以体积百分比计，所述复溶液为含有0.1％甲酸的水溶液；

优选地，所述复溶液中还含有抗氧化剂；

优选地，所述抗氧化剂包括柠檬酸、绿原酸、抗坏血酸、焦亚硫酸钠、硫代硫酸钠、焦性没食子酸或谷胱甘肽。

3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述内标为内标工作液，所述内标工作液中各物质的目标浓度为：3-MT-d4：0.2μg/mL；MN-d3：0.3μg/mL；NMN-d3：0.5μg/mL；DA-d4：0.1μg/mL；E-d6：0.05μg/mL；和NE-d6：1.5μg/mL。

4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述校准品包括校准品C1～C6，所述校准品C1～C6中各物质的目标浓度如下：

5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述校准品为校准品工作液，所述校准品工作液包括校准品S1～S6，所述校准品工作液以水为基质；所述校准品S1～S6中各物质的目标浓度如下：

校准品S2:3-MT:25pg/mL、MN:50pg/mL、NMN:50pg/mL、DA:62.5pg/mL、E:125pg/mL和NE:312.5pg/mL；

6.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包含质控品。

7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述质控品包括质控品QCⅠ、质控品QCⅡ和质控品QCⅢ；以及稀释液A和稀释液B；质控品中各物质浓度如下：

所述稀释液A为含有BSA的缓冲液，按照质量体积比计，BSA的浓度为1～5％；

所述稀释液B为人工尿液、生理盐水或缓冲液；

优选地，所述稀释液A为按照质量体积比计含1％BSA的PBS缓冲液；

优选地，所述稀释液B为PBS缓冲液。

8.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述质控品包括质控品工作液，所述质控品工作液包括血浆质控品工作液和/或尿液质控品工作液；

优选地，所述血浆质控品工作液的基质为含有BSA的缓冲液，按照质量体积比计，BSA的浓度为1～5％；

优选地，所述血浆质控品工作液的基质为按照质量体积比计含1％BSA的PBS缓冲液；

优选地，所述血浆质控品工作液包括低值血浆质控品工作液和高值血浆质控品工作液；

所述低值血浆质控品工作液中各物质的目标浓度为：3-MT:40pg/mL、MN:80pg/mL、NMN:80pg/mL、DA:100pg/mL、E:200pg/mL和NE:500pg/mL；

所述高值血浆质控品工作液中各物质的目标浓度为：3-MT:200pg/mL、MN:400pg/mL、NMN:400pg/mL、DA:500pg/mL、E:1000pg/mL和NE:2500pg/mL；

优选地，所述尿液质控品工作液以人工尿液、生理盐水或缓冲液作为基质；

优选地，所述尿液质控品工作液以缓冲液作为基质，优选以PBS缓冲液作为基质；

优选地，所述尿液质控品工作液包括低值尿液质控品工作液和高值尿液质控品工作液；

所述低值尿液质控品工作液中各物质的目标浓度为：3-MT:400pg/mL、MN:800pg/mL、NMN:800pg/mL、DA:1000pg/mL、E:2000pg/mL和NE:5000pg/mL；

所述高值尿液质控品工作液中各物质的目标浓度为：3-MT:3000pg/mL、MN:6000pg/mL、NMN:6000pg/mL、DA:7500pg/mL、E:15000pg/mL和NE:37500pg/mL。

9.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述LC-MS/MS检测试剂还包括流动相；所述流动相包括流动相A和流动相B；流动相A为0.05～0.2％甲酸水溶液；流动相B为0.05～0.2％甲酸甲醇溶液；

优选地，所述流动相A为0.1％甲酸水溶液；

优选地，所述流动相B为0.1％甲酸甲醇溶液。

10.权利要求1-9任一项所述的试剂盒在非诊断和治疗目的的检测血浆和尿液中儿茶酚胺及其代谢产物中的应用，其特征在于，所述检测包括：