CN115541731A - 一种保护氨基酸对映异构体的分析方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种保护氨基酸对映异构体的分析方法。与现有技术相比，本发明通用性较强，色谱方法比较稳定，灵敏度较高，耐用性较好，且对醋酸西曲瑞克起始物料一种保护氨基酸的对映异构体检测适用；使用的溶剂正己烷，无水乙醇均为常用试剂，容易获得。不同试验室进行该色谱条件分析方法转移，均满足要求。
Description
技术领域
本发明涉及药物分析技术领域，具体涉及一种保护氨基酸对映异构体的分析方法。
背景技术
醋酸西曲瑞克，又常称为西曲瑞克，是一种有效的黄体酮释放激素抑制素受体拮抗剂，它能控制卵巢的刺激作用，预防不成熟卵泡过早排出，帮助受孕；西曲瑞克单剂量方案可减少注射次数，更方便使用。目前国内注射用醋酸西曲瑞克仅有原研药品在售，竞争格局良好，是辅助生殖相关指南推荐用药，临床前景较好。醋酸西曲瑞克一种合成的十肽，其化学名称为：N-乙酰-3-(2-萘)-D-丙氨酰-p-氯-D-苯丙氨酰-3-(3-吡啶基)-D-丙氨酰-L-丝氨酰-L-酪氨酰-N5-氨甲酰-D-鸟氨酰-L-亮氨酰-L-精氨酰-L-脯氨酰-D-丙氨酰胺醋酸盐。
其结构式为：
可以看出，醋酸西曲瑞克肽链中含有多个手性中心，而这些手性中心是由合成醋酸西曲瑞克的多个氨基酸起始原料引进的。这些氨基酸起始原料中均存在对映异构体杂质风险，若对起始原料的手性杂质不加以控制，会引入到终产品中，导致终产品精制困难，难以达到质控标准，生产成本增加。
因此，开发出能有效检出氨基酸对映异构体的分析方法，对醋酸西曲瑞克的生产和提纯具有重要的指导意义，并建立严格的质控标准，从而对降低终产品提纯难度、提高产品质量有积极意义。
目前对于多肽保护氨基酸对映体的测定分析方法文献较少，专利CN111505161A公开了一种保护氨基酸对映异构体检测方法，是采用反相色谱方法对Fmoc保护氨基酸的对映体进行测定，使用的色谱柱为纤维素-三(3，5-二甲基苯基氨基甲酸酯)色谱柱，流动相为0.1％三氟乙酸水溶液-乙腈体系。申请人尝试用该方法检测醋酸西曲瑞克的多个氨基酸起始原料，发现并不适用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种保护氨基酸对映异构体的分析方法，该色谱条件对醋酸西曲瑞克的一种保护氨基酸起始物料的对映异构体检测皆适用。能够实现主峰与对映异构体的有效分离，分离效果突出，专属性好。
实现上述发明目的的技术方案是：
本发明提供一种保护氨基酸对映异构体的分析方法，包括以下步骤：
(1)样品配制：
供试品溶液制备：精密称取供试品10mg，置20ml量瓶中，用稀释剂溶解并稀释至刻度线，摇匀，即得；
对照品溶液制备：精密称取保护氨基酸对映异构体，用稀释剂溶解并稀释成浓度为0.03mg/ml的溶液，作为对照品贮备液；精密量取对照品贮备液1ml，置20ml量瓶中，用稀释剂溶解并稀释至刻度线，摇匀，即得；
灵敏度溶液制备：精密量取对照品溶液2ml，置10ml量瓶中，用稀释剂溶解并稀释至刻度线，摇匀，即得；
系统适用性溶液制备：精密称取供试品10mg，置20ml量瓶中，加入对照品贮备液1ml，用稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀，即得；
(2)色谱条件设置：
色谱柱：硅胶表面涂敷有直链淀粉-三(3，5-二甲基苯基氨基甲酸酯)手性固定相为色谱柱；
流动相：以正己烷为流动相A，以无水乙醇为流动相B进行梯度洗脱；
柱温：30～45℃；
流速：0.3～1.1ml/min；
进样体积：1～10μl；
检测波长：260～270nm；
(3)检测和计算：
精密量取系统适用性溶液，灵敏度溶液、对照品溶液和供试品溶液，分别注入液相色谱仪，记录色谱图；通过外标法计算主峰和对映异构体的峰面积。
根据本发明实施方案，所述稀释剂为无水乙醇和正己烷的混合溶液，其中无水乙醇和正己烷的体积比为60:40。
根据本发明实施方案，按照下表进行梯度洗脱：
根据本发明实施方案，柱温为30～45℃；例如：30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、41℃、42℃、43℃、44℃、45℃，优选为35～45℃，更优选为40℃。
根据本发明实施方案，流速为0.3～1.1m/min；例如：0.3ml/min、0.4ml/min、0.5ml/min、0.6ml/min、0.7ml/min、0.8ml/min、0.9ml/min、1.0ml/min、1.1ml/min，优选为0.95～1.05ml/min，更优选为1.0ml/min。
根据本发明实施方案，进样体积为1～10μl；例如：1μl、3μl、5μl、7μl、9μl、10μl；优选为10μl。
根据本发明实施方案，检测波长为260～270nm；例如：260nm、261nm、262nm、263nm、264nm、265nm、266nm、267nm、268nm、269nm、270nm；优选为261～267nm，更优选为264nm。
根据本发明实施方案，所述灵敏度溶液中，峰高的信噪比大于10。
根据本发明实施方案，所述保护氨基酸为Fmoc-Leu-OH。
本发明还提供一种保护氨基酸对映异构体的分析方法用于测定醋酸西曲瑞克起始原料药中保护氨基酸的纯度，其特征在于，所述保护氨基酸为Fmoc-Leu-OH，其对应异构体Fmoc-D-Leu-OH的含量不高于0.3％。
本发明的有益效果是：
1、本发明采用的流动相是正己烷，无水乙醇，正己烷为惰性试剂，很少与样品会发生反应；选择无水乙醇作为极性试剂，洗脱能力较好，且色谱系统压力较小。同时流动相系统中未使用三氟乙酸等酸性添加剂，从而避免了因为长期使用酸性流动相而造成手性色谱柱和仪器被腐蚀的问题。
2、本发明对醋酸西曲瑞克起始物料一种保护氨基酸Fmoc-Leu-OH中可能的降解杂质和工艺杂质，如Fmoc-β-Ala-Leu-OH，Fmoc-Leu-Leu-OH，Fmoc-Osu，Fmoc-β-Ala-OH和L-亮氨酸等进行了杂质峰定位，本发明采用了梯度洗脱的方式进行检测，通过优化设置合理的梯度洗脱条件，使这些杂质能够准确定位，与对映异构体Fmoc-D-Leu-OH的分离度符合要求，并且能快速被洗脱出来；不干扰样品中对映异构体的检测，并且不影响同一色谱系统其它批次样品的检测。避免了对映异构体Fmoc-D-Leu-OH与样品中其它杂质不完全分离，与主峰分离度不符合要求而影响峰面积积分，导致检测结果不准确的问题。
3、本发明通过对流动相配比、对照品溶液以及梯度洗脱条件进行综合设计和优化，本发明的分析方法在液相色谱系统运行过程中，基线平稳，空白溶剂和其它杂质基本无干扰本品中对映异构体的检测，杂质分离效果突出，专属性好，试验数据证明，检出限可达到0.0045％，灵敏度极高，检测结果可为产品研发、生产和提纯提供可靠有效的信息，为建立保护氨基酸质控标准打下了坚实基础，为终产品的质量控制起到了积极作用。
附图说明
图1为实施例1中Fmoc-Leu-OH及对映异构体系统适用性谱图。
图2为实施例1中对映异构体Fmoc-D-Leu-OH的灵敏度测试溶液色谱图。
图3为对比例中Fmoc-Leu-OH及对映异构体系统适用性谱图。
图4为实施例2中对映异构体Fmoc-D-Leu-OH的线性趋势图。
具体实施方式
下面结合具体实施例和附图对本发明作进一步详述，以下实施例只是描述性的，不是限定性的，不能以此限定本发明的保护范围，如无特别说明，所用原料均可通过市售或自制获得。
实施例1(正相)(XQRK-SM-4)
醋酸西曲瑞克起始原料Fmoc-Leu-OH对映异构体检测方法，具体包含如下步骤：
(1)色谱条件设置：采用以硅胶表面涂敷有直链淀粉-三(3，5-二甲基苯基氨基甲酸酯)手性固定相为色谱柱，柱长25cm，内径4.6mm，膜厚5μm；柱温为40℃，以正己烷为流动相A，以无水乙醇为流动相B，按下表5进行梯度洗脱；流速为每分钟1.0ml；检测波长为264nm，进样体积10μl；
(2)供试品溶液制备：取本品约10mg，精密称定，置20ml量瓶中，加溶剂无水乙醇-正己烷(60:40)溶解并稀释至刻度，摇匀，即得；
(3)对照品溶液制备：取对映异构体Fmoc-D-Leu-OH对照品适量，精密称定，加溶剂溶解并稀释成每1ml含0.03mg的溶液，作为对照品贮备液；精密量取对照品贮备液1ml，置20ml量瓶中，用溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀，即得；
(4)灵敏度溶液制备：精密量取对照品溶液2ml，置10ml量瓶中，用溶剂稀释至刻度，摇匀，即得；
(5)系统适用性溶液制备：取本品对照品约10mg，精密称定，置20ml量瓶中，加入对照品贮备液1ml，溶解并稀释至刻度，摇匀，即得；
(6)检测：精密量取系统适用性溶液，灵敏度溶液、对照品溶液和供试品溶液，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。系统适用性溶液中Fmoc-D-Leu-OH和Fmoc-Leu-OH依次出峰，Fmoc-D-Leu-OH和Fmoc-Leu-OH峰分离度应符合要求；灵敏度溶液中，峰高的信噪比应大于10。
(7)供试品溶液色谱图中，如有与Fmoc-D-Leu-OH保留时间一致的色谱峰，按外标法以峰面积计算，不得过0.3％。
表1色谱条件梯度洗脱程序
表2 Fmoc-Leu-OH和Fmoc-D-Leu-OH化学结构式
Fmoc-Leu-OH及对映异构体Fmoc-D-Leu-OH系统适用性检测结果如表3，对应附图1。
表3
| 化合物名称 | Fmoc-D-Leu-OH | Fmoc-Leu-OH |
| 出峰时间min | 11.531 | 13.375 |
| 峰面积比％ | 0.37 | 99.63 |
| 分离度 | / | 3.8 |
从图1的色谱图和表3的结果可以得到，对映异构体Fmoc-D-Leu-OH和主成分Fmoc-Leu-OH的分离度为3.8，大于1.5，说明本发明能将Fmoc-Leu-OH及对映异构体Fmoc-D-Leu-OH有效分离。
从图2对映异构体Fmoc-D-Leu-OH的灵敏度测试溶液色谱图中，可以看出本发明能检出相当于供试品含量为0.0045％的对映异构体，说明本方法的灵敏度高。通过方法学验证，当Fmoc-D-Leu-OH的浓度为Fmoc-Leu-OH的0.0045％时，其信噪比为22，故本发明的检出限浓度为0.0045％。
对比例1
专利CN111505161A中采用纤维素-三(3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯)为色谱柱，以三氟乙酸：水＝1:1000为流动相A，柱温25℃，乙腈为流动相B，流动相A：流动相B＝80：20(V/V)进行等度洗脱25min，对Fmoc系列保护氨基酸的对映异构体进行检测。本发明通过重复试验条件发现，本发明中Fmoc基团保护氨基酸在上述条件下，主成分和其对映异构体未能有效的分开，见图3为Fmoc-Leu-OH及对映异构混合溶液谱图。因此无法对起始物料中的对映异构体进行定量分析和准确检测多批次样品中的含量。这样的色谱柱和流动相对醋酸西曲瑞克的多个保护氨基酸的对映异构体检测不适用，通用性不强。
实施例2
本发明采用外标法计算对映异构体的含量，并且对该方法进行一系列的方法学验证，包括线性，检测限定量限，重复性，准确度，中间精密度，溶液放置稳定性和耐用性试验；结果表明该方法专属性强，准确度高，可以用于检测物料Fmoc-Leu-OH中对映异构体Fmoc-D-Leu-OH的含量。
一、方法学验证：
1、专属性
溶液配制：
1)空白溶剂：稀释剂。
2)Fmoc-Leu-OH定位溶液：取Fmoc-Leu-OH对照品约2mg，置10ml量瓶中，加稀释剂约5ml，超声1min后振摇使其溶解，用稀释剂稀释至刻度，摇匀即得。
3)Fmoc-D-Leu-OH定位溶液：取Fmoc-D-Leu-OH对照品约2mg，置10ml量瓶中，加稀释剂约5ml，超声1min后振摇使其溶解，用稀释剂稀释至刻度，摇匀即得。
4)Fmoc-Leu-Leu-OH定位溶液：取Fmoc-Leu-Leu-OH杂质对照品约2mg，置10ml量瓶中，加稀释剂约5ml，超声1min后振摇使其溶解，用稀释剂稀释至刻度，摇匀即得。
5)Fmoc-β-Ala-Leu-OH定位溶液：取Fmoc-β-Ala-Leu-OH杂质对照品约2mg，置10ml量瓶中，加稀释剂约5ml，超声1min后振摇使其溶解，用稀释剂稀释至刻度，摇匀即得。
6)Fmoc-β-Ala-OH定位溶液：取Fmoc-β-Ala-OH杂质对照品约2mg，置10ml量瓶中，加稀释剂约5ml，超声1min后振摇使其溶解，用稀释剂稀释至刻度，摇匀即得。
7)Fmoc-Osu定位溶液：取Fmoc-Osu杂质约2mg，置10ml量瓶中，加稀释剂约5ml，超声1min后振摇使其溶解，用稀释剂稀释至刻度，摇匀即得。
8)L-亮氨酸定位溶液：取L-亮氨酸对照品约2mg，置20ml量瓶中，加甲醇：乙腈(1:1)约15ml，超声8min后振摇使其溶解，用稀释剂稀释至刻度，摇匀即得。
9)混合溶液：
称取Fmoc-Leu-OH约10mg，置20ml量瓶，加稀释剂约5ml振摇使其溶解后，精密加入对映异构体Fmoc-D-Leu-OH对照品贮备液1.0ml，以及上述其余5个杂质峰定位溶液各0.5ml。用稀释剂稀释至刻度，摇匀即得。混合溶液中各个成分之间的分离度结果见下表4。
表4
空白溶剂对本品中对映异构体检测无干扰；L-亮氨酸在此色谱条件下无紫外吸收，其它杂质Fmoc-β-Ala-Leu-OH，Fmoc-β-Ala-OH，Fmoc-Leu-Leu-OH和Fmoc-Osu，对本品对映异构体Fmoc-D-Leu-OH的检测均无干扰，本发明方法专属性较好。
2、线性和范围
线性溶液的配制：分别精密量取对映异构体Fmoc-D-Leu-OH贮备液适量，配制成浓度为0.1544、0.4631、0.7718、1.5435、1.8522、2.3153、3.0871μg/ml的一系列线性浓度溶液。分别注入液相色谱仪，记录色谱图。以Fmoc-D-Leu-OH浓度(μg/ml)为横坐标、以峰面积为纵坐标进行线性回归。
表5
由表5中结果得出对映异构体Fmoc-D-Leu-OH的浓度与峰面积的线性方程为y＝31813.0047x-583.4746，相关系数r＝0.9992，Y轴截距与100％响应值比值绝对值为1.2，均符合试验要求。说明Fmoc-D-Leu-OH在0.1544～3.0871μg/ml范围内线性良好。
3、检测限和定量限
精密量取Fmoc-D-Leu-OH对照品储备液0.1ml，置20ml量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得定量限溶液(LOQ溶液)；计算LOQ溶液连续进样6次对映异构体Fmoc-D-Leu-OH峰的信噪比(S/N)，及峰面积的RSD。
精密量取定量限溶液3ml，置20ml量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得检测限溶液(LOD溶液)；计算LOD溶液进样1次对映异构体Fmoc-D-Leu-OH峰的信噪比(S/N)。结果见下表6。
表6
结果表明Fmoc-D-Leu-OH的6份定量限溶液S/N值均大于10，最小值为53；6份峰面积的RSD为1.3％，符合要求。Fmoc-D-Leu-OH的检测限溶液S/N值为22，大于3，均符合要求，说明本方法灵敏度较好。
4、准确度
供试品溶液制备：精密称取供试品10mg，置20ml量瓶中，用稀释剂溶解并稀释至刻度线，摇匀，即得；
对照品溶液制备：精密称取保护氨基酸对映异构体，用稀释剂溶解并稀释成浓度为0.03mg/ml的溶液，作为对照品贮备液；精密量取对照品贮备液1ml，置20ml量瓶中，用稀释剂溶解并稀释至刻度线，摇匀，即得；
定量限准确度溶液：称取Fmoc-Leu-OH约10mg，置20ml量瓶，加入稀释剂约5ml，超声使溶解，精密加入对照品贮备液0.1ml，后用稀释剂稀释至刻度，摇匀即得；平行配制3份，各进1针。
100％限度准确度溶液：称取Fmoc-Leu-OH约10mg，置20ml量瓶，加入稀释剂约5ml，超声使溶解，精密加入对照品贮备液1.0ml，后用稀释剂稀释至刻度，摇匀即得；平行配制3份，各进1针。
200％限度准确度溶液：称取Fmoc-Leu-OH约10mg，置20ml量瓶，加入稀释剂约5ml，超声使溶解，精密加入对照品贮备液2.0ml，后用稀释剂稀释至刻度，摇匀即得；平行配制3份，各进1针。
根据公式回收率(％)＝(A-B)/C×100％，其中A为测得量，B为本底量，C为加入量来计算；计算结果见下表7。
表7
低中高浓度水平的回收率分别为90.8～93.8％和89.3～91.4％以及90.7～91.2％，9份低中高水平回收率的RSD为1.6％。均符合要求，说明本法准确度较好。
5、重复性
称取Fmoc-Leu-OH约10mg，置20ml量瓶，加入稀释剂约5ml，超声使溶解，精密加入对照品贮备液1.0ml，后用稀释剂稀释至刻度，摇匀即得；平行配制6份，各进1针；结果见下表8。
表8
6份重复性溶液的含量值RSD为2.0％，符合要求，说明本方法重复性较好。
6、中间精密度
将重复性项下结果作为第一人的实验结果。
同一批样品，由不同试验人员不同天在不同台仪器同法进行测定。按重复性项下方法配制6份中间精密度溶液。
表9
表10
6份中间精密度溶液测得含量的RSD值为2.9％，12份溶液测得含量的RSD值为2.5％，均小于10％，符合要求。
7、溶液放置稳定性
取加标供试品溶液，室温条件下放置，分别在0小时、5小时、9小时、12小时、24小时和73h测定对映异构体Fmoc-D-Leu-OH含量，以不同时间含量与0小时变化值考察溶液稳定性。
表11
| 时间(h) | Fmoc-D-Leu-OH含量(％) | 变化值(％) |
| 0 | 0.28 | / |
| 5 | 0.29 | 2.5 |
| 9 | 0.28 | 1.1 |
| 12 | 0.27 | 4.6 |
| 24 | 0.28 | 1.1 |
| 73 | 0.29 | 2.5 |
由上表格得出，加标溶液在室温下放置不同时间，Fmoc-D-Leu-OH的检出量与0时相比，变化值最大为4.6％，各个时间点均小于5.0％，说明加标供试品溶液在室温下放置73小时内稳定。
8、耐用性试验
当仪器色谱参数发生些微变化，如流动相正己烷和无水乙醇配比、波长、柱温和流速发生变化时，考察空白溶剂是否干扰本品检测，系统适用性溶液中Fmoc-D-Leu-OH与前后色谱峰分离度，灵敏度溶液S/N值，以及加标供试品溶液与拟定条件下的检出量RSD值，是否符合要求。结果见下表12和13。
表12
表13
当仪器色谱参数变化后，灵敏度溶液的S/N值均大于10；Fmoc-D-Leu-OH对映体与前后杂质的分离度均符合要求；不同条件下，加标供试品溶液中Fmoc-D-Leu-OH与拟定色谱条件的RSD均小于10.0％；说明本方法耐用性较好。
Claims (10)
1.一种保护氨基酸对映异构体的分析方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）样品配制：
供试品溶液制备：精密称取供试品10mg，置20ml量瓶中，用稀释剂溶解并稀释至
刻度线，摇匀，即得；
对照品溶液制备：精密称取保护氨基酸对映异构体，用稀释剂溶解并稀释成浓度为
0.03mg/ml的溶液，作为对照品贮备液；精密量取对照品贮备液1ml，置20ml量瓶中，用稀释剂溶解并稀释至刻度线，摇匀，即得；
灵敏度溶液制备：精密量取对照品溶液2ml，置10ml量瓶中，用稀释剂溶解并稀释至刻度线，摇匀，即得；
系统适用性溶液制备：精密称取供试品10mg，置20ml量瓶中，加入对照品贮备液1ml，用稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀，即得；
（2）色谱条件设置：
色谱柱：硅胶表面涂敷有直链淀粉-三(3，5-二甲基苯基氨基甲酸酯）手性固定相为色谱柱；
流动相：以正己烷为流动相A，以无水乙醇为流动相B进行梯度洗脱；
柱温：30~45℃；
流速：0.3~1.1ml/min；
进样体积：1~10µl；
检测波长：260~270nm；
（3）检测和计算：
精密量取系统适用性溶液，灵敏度溶液、对照品溶液和供试品溶液，分别注入液相色谱仪，记录色谱图；通过外标法计算主峰和对映异构体的峰面积。
2.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于，所述稀释剂为无水乙醇和正己烷的混合溶液，其中无水乙醇和正己烷的体积比为60:40。
3.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于，按照下表进行梯度洗脱：
。
4.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于，所述柱温为35~45℃。
5.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于，所述流速为0.95~1.05ml/min。
6.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于，所述进样体积为10μl。
7.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于，所述波长为261~267nm。
8.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于，所述灵敏度溶液中，峰高的信噪比大于10。
9.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于，所述保护氨基酸为Fmoc-Leu-OH。
10.利用权利要求1~9任一项所述方法测定醋酸西曲瑞克起始原料药中保护氨基酸的纯度，其特征在于，所述保护氨基酸为Fmoc-Leu-OH，其对映异构体Fmoc-D-Leu-OH的含量不高于0.3%。
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN118191167A (zh) * | 2024-05-13 | 2024-06-14 | 湖南明瑞制药股份有限公司 | 一种头孢克肟颗粒色谱分析方法 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN111505161A (zh) * | 2020-05-11 | 2020-08-07 | 成都市科隆化学品有限公司 | 一种保护氨基酸对映异构体检测方法 |
| CN113490679A (zh) * | 2019-02-28 | 2021-10-08 | 富士胶片株式会社 | 肽化合物的制造方法、保护基形成用试药及芳香族杂环化合物 |
| CN114487164A (zh) * | 2021-12-29 | 2022-05-13 | 四川汇宇制药股份有限公司 | 保护氨基酸与其n端脱掉保护基的杂质的分离检测方法 |
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Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN113490679A (zh) * | 2019-02-28 | 2021-10-08 | 富士胶片株式会社 | 肽化合物的制造方法、保护基形成用试药及芳香族杂环化合物 |
| CN111505161A (zh) * | 2020-05-11 | 2020-08-07 | 成都市科隆化学品有限公司 | 一种保护氨基酸对映异构体检测方法 |
| CN114487164A (zh) * | 2021-12-29 | 2022-05-13 | 四川汇宇制药股份有限公司 | 保护氨基酸与其n端脱掉保护基的杂质的分离检测方法 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| YIN HUA LI 等: "Liquid chromatographic enantiomer resolution of N-fluorenylmethoxycarbonyl α-amino acids and their ester derivatives on polysaccharide-derived chiral stationary phase", J. SEP. SCI., vol. 28, 31 December 2015 (2015-12-31), pages 2057 * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN118191167A (zh) * | 2024-05-13 | 2024-06-14 | 湖南明瑞制药股份有限公司 | 一种头孢克肟颗粒色谱分析方法 |
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