CN114252538A - 一种富马酸替诺福韦艾拉酚胺及其异构体的分离测定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于医药化学技术领域，提供一种富马酸替诺福韦艾拉酚胺及其异构体的分离测定方法。所述分离测定方法中所用色谱柱为手性色谱柱，流动相为正己烷、乙醇、甲醇和二乙胺的混合溶液，其中正己烷、乙醇、甲醇和二乙胺的体积比为70‑77：18‑22：5‑10：0.1。本发明提供的分离测定方法简便，能在一个体系下实现富马酸替诺福韦艾拉酚胺及其六个异构体的同时分离，分离度好，为原料药与制剂的质量控制提供了有效手段。
Description
技术领域
本发明属于医药化学技术领域，更具体地说，是涉及一种富马酸替诺福韦艾拉酚胺及其异构体的分离测定方法。
背景技术
富马酸替诺福韦艾拉酚胺(TAF)是Gilead Sciences Inc.(吉利德)开发的新型口服核苷转录酶抑制剂，具有临床给药剂量更小、安全性更高的特点。富马酸替诺福韦艾拉酚胺于2016年11月10日获得FDA批准上市，商品名为VemLidy，规格为25mg；2018年11月8日在我国获批上市，商品名为“韦立得/VemLidy”，规格为25mg。
富马酸替诺福韦艾拉酚胺的化学名为9-[(R)-2-[[(S)-[[(S)-1-(异丙氧基羰基)乙基]氨基]苯氧基氧膦基]甲氧基]丙基]腺嘌呤半富马酸盐，其结构式如下所示：
化学药品中异构体的研究是药品研发的一项重要内容，它包括选择合适的分析方法，准确地分辨与测定异构体的含量，并给出合理限度。化学药品的异构体的存在直接关系到药品的质量及安全性，因此对化学药品的异构体进行准确地分析检测、控制其含量是非常有意义的。
目前，国内外测定富马酸替诺福韦艾拉酚胺异构体的药物分析方法的文献较少，没有富马酸替诺福韦艾拉酚胺的标准收载，异构体检测方法需要自己建立。并且富马酸替诺福韦艾拉酚胺具有多个异构体，为分离检测带来了更大的难度。因此，开发一种可以同时准确地分离测定富马酸替诺福韦艾拉酚胺的多种异构体的分析方法是十分有意义的。
发明内容
本发明的目的在于提供一种富马酸替诺福韦艾拉酚胺及其异构体的分离测定方法，以解决现有技术中富马酸替诺福韦艾拉酚胺及其多个异构体难以有效分离检测的技术问题。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：
一方面，本发明提供一种富马酸替诺福韦艾拉酚胺及其异构体的分离测定方法，所用色谱柱为手性色谱柱，流动相为正己烷、乙醇、甲醇和二乙胺的混合溶液，其中正己烷、乙醇、甲醇和二乙胺的体积比为70-77：18-22：5-10：0.1；
所述异构体为以下富马酸替诺福韦艾拉酚胺异构体的一种或多种：
进一步的，所述手性色谱柱以表面涂敷有直链淀粉-三(3,5-二甲苯基氨基甲酸酯)的硅胶为填充剂。
进一步的，所述色谱柱柱长为250mm，内径为4.6mm，填充料粒径为5μm。
进一步的，所述方法中样品的稀释剂为正己烷、乙醇和甲醇的混合溶液，其中正己烷、乙醇和甲醇的体积比为75：20：5。
进一步的，所述分离测定方法为正相高效液相色谱法，包括：
取富马酸替诺福韦艾拉酚胺样品制成供试品溶液，取供试品溶液稀释成对照溶液，取富马酸替诺福韦艾拉酚胺对照品及六种异构体对照品制成系统适用性溶液；
分别将供试品溶液、对照溶液和系统适用性溶液注入高效液相色谱仪中进行检测；
将供试品溶液产生的色谱图的杂质峰和主成分峰面积比较，按照主成分自身对照法计算各有关物质的含量。
进一步的，所述高效液相色谱的测定条件包括：色谱柱柱温为30-40℃；色谱柱进样量为15-20μL；流动相流速为0.8-1.2mL/min；检测器采用紫外检测器，检测波长为255-265nm。
进一步的，每1mL所述供试品溶液中含有富马酸替诺福韦艾拉酚胺样品1mg。
进一步的，每1mL所述对照溶液中含有富马酸替诺福韦艾拉酚胺样品5μg。
进一步的，每1mL所述系统适用性溶液中含有富马酸替诺福韦艾拉酚胺对照品1mg、各个异构体对照品各5μg。
另一方面，本发明还提供一种上述富马酸替诺福韦艾拉酚胺及其异构体的分离测定方法在富马酸替诺福韦艾拉酚胺成分分析、含量检测中的应用。
本发明提供的富马酸替诺福韦艾拉酚胺及其异构体的分离测定方法的有益效果至少在于：
本发明提供的分离测定方法简便，能在一个体系下实现富马酸替诺福韦艾拉酚胺及其六个异构体的同时分离，分离度好，为原料药与制剂的质量控制提供了有效手段。
附图说明
图1为本发明实施例1的供试品溶液的高效液相色谱图。
图2为本发明实施例1的对照溶液的高效液相色谱图。
图3为本发明实施例1的系统适用性溶液的高效液相色谱图。
具体实施方式
为了使本发明要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合具体的实施方式，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施方式只是用于详细说明本专利，并不以任何方式限制本发明的保护范围。
本发明提供的富马酸替诺福韦艾拉酚胺及其异构体的分离测定方法为正相高效液相色谱法，包括：
取富马酸替诺福韦艾拉酚胺样品制成供试品溶液，取供试品溶液稀释成对照溶液，取富马酸替诺福韦艾拉酚胺对照品及六种异构体对照品制成系统适用性溶液；
分别将供试品溶液、对照溶液和系统适用性溶液注入高效液相色谱仪中进行检测；
将供试品溶液产生的色谱图的杂质峰和主成分峰面积比较，按照主成分自身对照法计算各有关物质的含量。
本发明提供的分离测定方法可分离的富马酸替诺福韦艾拉酚胺的异构体为以下的一种或多种：
其中，色谱柱为手性色谱柱。手性色谱柱可以选择以表面涂敷有直链淀粉-三(3,5-二甲苯基氨基甲酸酯)的硅胶为填充剂的色谱柱。色谱柱柱长为250mm，内径为4.6mm，填充料粒径为5μm。
流动相为正己烷、乙醇、甲醇和二乙胺的混合溶液，其中正己烷、乙醇、甲醇和二乙胺的体积比为70-77：18-22：5-10：0.1。例如正己烷、乙醇、甲醇和二乙胺的体积比可以选择70：18：5：0.1、77：22：10：0.1、75：20：5：0.1、73：19：8：0.1等。
流动相选择体积比为70-77：18-22：5-10：0.1的正己烷、乙醇、甲醇和二乙胺的混合溶液，可以保证富马酸替诺福韦艾拉酚胺和相邻异构体之间以及各异构体之间分离度均较好，可以达到富马酸替诺福韦艾拉酚胺和六种异构体的有效分离。如果改变流动相的组成或流动相中各组分的含量，会导致分离度变差。例如采用体积比为50：50：2的正己烷、异丙醇和二乙胺的混合溶液作为流动相，会使非对映异构体5和非对映异构体3分离效果不佳，分离度小于1.5，不符合要求。又例如采用正己烷：乙醇：甲醇：二乙胺＝70：15：15：0.1(体积比)的混合溶液作为流动相，会使富马酸替诺福韦艾拉酚胺和非对映异构体4分离效果不佳，分离度小于1.5，不符合要求。
样品的稀释剂为正己烷、乙醇和甲醇的混合溶液，其中正己烷、乙醇和甲醇的体积比为75：20：5。
高效液相色谱的测定条件包括：
色谱柱柱温为30-40℃，例如可以选择30℃、35℃、40℃等；
色谱柱进样量为15-20μL，例如可以选择15μL、18μL、20μL等；
流动相流速为0.8-1.2mL/min，例如可以选择15μL、18μL、20μL等；
检测器采用紫外检测器，检测波长为255-265nm，例如可以选择255nm、260nm、265nm等。
每1mL所述供试品溶液中含有富马酸替诺福韦艾拉酚胺样品1mg。
每1mL所述对照溶液中含有富马酸替诺福韦艾拉酚胺样品5μg。
每1mL所述系统适用性溶液中含有富马酸替诺福韦艾拉酚胺对照品1mg、各个异构体对照品各5μg。
本发明先后进行多次试验，在实际检测过程中，采用高效液相色谱法，其测定条件在本发明各参数范围内进行调整后，均能对富马酸替诺福韦艾拉酚胺及其六种异构体中的一种或多种进行有效的分离检测，现列举一部分试验作为参考对发明进行进一步详细描述，下面结合具体实施例进行详细说明：
除有定义外，以下实施例中所用的技术术语具有与本发明所属领域技术人员普遍理解的相同含义。以下实施例中所用的试剂，如无特殊说明，均为常规生化试剂；以下实施例中所用的原材料、仪器和设备等，均可通过市场购买获得或者可通过现有方法获得；所述试剂用量，如无特殊说明，均为常规实验操作中试剂用量；所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
以下实施例、对比例以及各评价试验均依照高效液相色谱法(中国药典2020年版四部通则0512)测定。
以下实施例以及各评价试验中所用稀释剂的组成均为正己烷：乙醇：甲醇＝75：20：5。
以下实施例以及各评价试验中的主成分是指富马酸替诺福韦艾拉酚胺。
实施例1
一种富马酸替诺福韦艾拉酚胺及其异构体的分离测定方法，包括如下步骤：
S1.制备供试品溶液：取富马酸替诺福韦艾拉酚胺样品适量，用稀释剂稀释至每1mL中含富马酸替诺福韦艾拉酚胺1mg，作为供试品溶液；
S2.制备对照溶液：取供试品溶液0.5mL，用稀释剂稀释至100mL，作为对照溶液；
S3.制备系统适用性溶液：取富马酸替诺福韦艾拉酚胺对照品、对映异构体对照品、非对映异构体1对照品、非对映异构体2对照品、非对映异构体3对照品、非对映异构体4对照品、非对映异构体5对照品各适量，用稀释剂稀释至每1mL中含富马酸替诺福韦艾拉酚胺1mg、各个异构体各5μg的混合溶液，作为系统适用性溶液；
S4.取供试品溶液、对照溶液和系统适用性溶液各20μL，分别注入高效液相色谱仪中进行检测，色谱条件为：
色谱柱：表面涂敷有直链淀粉-三(3,5-二甲苯基氨基甲酸酯)的硅胶为填充剂(4.6mm×250mm，填充料粒径5μm)
检测器：紫外检测器
检测波长：260nm
色谱柱柱温：40℃
流动相流速：1.0mL/min
流动相(体积比)：正己烷：乙醇：甲醇：二乙胺＝70：20：10：0.1；
记录色谱图。图1-3分别为本实施例的供试品溶液、对照溶液和系统适用性溶液的高效液相色谱图。
检测结果如下：
系统适用性溶液中的富马酸替诺福韦艾拉酚胺及其六种异构体均能有效分离，出峰顺序依次为非对映异构体1、非对映异构体5、非对映异构体3、主成分、非对映异构体4、对映异构体和非对映异构体2，主峰与异构体峰之间的分离度均大于1.5，各异构体峰之间的分离度均大于1.2。
供试品溶液检测结果显示：除富马酸替诺福韦艾拉酚胺以外，还含有非对映异构体3和非对映异构体4，其中非对映异构体3＜0.5％，非对映异构体4＜0.2％，均符合限度要求。
富马酸替诺福韦艾拉酚胺及其异构体的分离测定方法相关评价试验
1.专属性评价
检测方法包括：
(1)制备空白溶液：正己烷-乙醇-甲醇(75：20：5)；
(2)制备系统适用性溶液：取富马酸替诺福韦艾拉酚胺对照品、对映异构体对照品、非对映异构体1对照品、非对映异构体2对照品、非对映异构体3对照品、非对映异构体4对照品、非对映异构体5对照品各适量，用稀释剂稀释至每1mL中含富马酸替诺福韦艾拉酚胺1mg、各个异构体各5μg的混合溶液，作为系统适用性溶液；
(3)制备灵敏度溶液：取富马酸替诺福韦艾拉酚胺样品适量，用稀释剂稀释至每1mL中含富马酸替诺福韦艾拉酚胺1mg，作为供试品溶液；取供试品溶液0.5mL，用稀释剂稀释至100mL，作为对照溶液；取对照溶液1mL，用稀释剂稀释至10mL，作为灵敏度溶液；
(4)取空白溶液、系统适用性溶液和灵敏度溶液各20μL，分别注入高效液相色谱仪中进行检测，色谱条件与实施例1相同，记录色谱图。对色谱图中的数据进行分析，结果如表1所示：
表1异构体测定方法专属性考察试验结果
由检测结果可知：
空白溶液未出现色谱峰，不干扰各异构体的测定。
系统适用性溶液的色谱图中，出峰顺序依次为非对映异构体1、非对映异构体5、非对映异构体3、主成分、非对映异构体4、对映异构体、非对映异构体2，各相邻色谱峰之间的分离度均大于1.5，符合要求。
灵敏度溶液的色谱图中，主成分富马酸替诺福韦艾拉酚胺信噪比为17.14，大于10，符合要求。
因此，富马酸替诺福韦艾拉酚胺及其异构体的分离测定方法的专属性良好。
2.定量限与检测限评价
检测方法包括：
(1)制备对照品溶液：取富马酸替诺福韦艾拉酚胺对照品100mg，用稀释剂稀释至10mL，作为对照品溶液；
(2)制备定位溶液：取对映异构体对照品、非对映异构体1对照品、非对映异构体2对照品、非对映异构体3对照品、非对映异构体4对照品、非对映异构体5对照品各适量，分别用稀释剂稀释至每1mL中含各异构体为100μg的溶液；
(3)制备定量限溶液：取对照品溶液与各异构体定位溶液各适量，用稀释剂稀释至富马酸替诺福韦艾拉酚胺对照品与各异构体色谱峰信噪比大于10时，即为定量限溶液；平行配制6份定量限溶液；
(4)制备检测限溶液：取定量限溶液3.3mL用稀释剂稀释至10mL，作为检测限溶液；平行配制3份检测限溶液；
(5)取6份定量限溶液和3份检测限溶液各20μL，分别注入高效液相色谱仪中进行检测，色谱条件与实施例1相同，记录色谱图。
检测结果如下：
非对映异构体1定量限为0.21μg/mL，相当于供试品浓度(1.0mg/mL)的0.021％；检测限为0.070μg/mL，相当于供试品浓度(1.0mg/mL)的0.007％，符合要求。
非对映异构体5定量限为0.27μg/mL，相当于供试品浓度(1.0mg/mL)的0.027％；检测限为0.089μg/mL，相当于供试品浓度(1.0mg/mL)的0.009％，符合要求。
非对映异构体3定量限为0.25μg/mL，相当于供试品浓度(1.0mg/mL)的0.025％；检测限为0.081μg/mL，相当于供试品浓度(1.0mg/mL)的0.008％，符合要求。
富马酸替诺福韦艾拉酚胺定量限为0.35μg/mL，相当于供试品浓度(1.0mg/mL)的0.035％；检测限为0.12μg/mL，相当于供试品浓度(1.0mg/mL)的0.012％，符合要求。
非对映异构体4定量限为0.45μg/mL，相当于供试品浓度(1.0mg/mL)的0.045％；检测限为0.15μg/mL，相当于供试品浓度(1.0mg/mL)的0.015％，符合要求。
对映异构体定量限为0.44μg/mL，相当于供试品浓度(1.0mg/mL)的0.044％；检测限为0.14μg/mL，相当于供试品浓度(1.0mg/mL)的0.014％，符合要求。
非对映异构体2定量限为0.79μg/mL，相当于供试品浓度(1.0mg/mL)的0.079％；检测限为0.26μg/mL，相当于供试品浓度(1.0mg/mL)的0.026％，符合要求。
3.溶液稳定性评价
检测方法包括：
(1)制备供试品溶液：取富马酸替诺福韦艾拉酚胺样品适量，用稀释剂稀释至每1mL中含富马酸替诺福韦艾拉酚胺1mg，作为供试品溶液；
(2)制备对照溶液：取供试品溶液0.5mL，用稀释剂稀释至100mL，作为对照溶液；
(3)将供试品溶液与对照溶液于室温下放置，于0h、3h、7h、12h、18h分别量取供试品溶液和对照溶液各20μL，分别注入高效液相色谱仪中进行检测，色谱条件与实施例1相同，记录色谱图。
对色谱图中的数据进行分析，结果如表2和表3所示：
表2供试品溶液稳定性试验结果
表3对照溶液稳定性试验结果
| 时间(h) | 对照溶液峰面积 |
| 0 | 198977 |
| 3 | 196690 |
| 7 | 198981 |
| 12 | 194071 |
| 18 | 193997 |
| 平均值 | 196543 |
| RSD(％) | 1.26 |
由检测结果可知：
对照溶液于室温下放置18小时，主成分富马酸替诺福韦艾拉酚胺峰面积RSD值为1.26，小于2％，符合要求。供试品溶液于室温下放置18小时，各异构体检出情况基本一致。说明对照品溶液于室温下放置18小时稳定，供试品溶液于室温下放置18小时稳定。
4.线性与范围评价
检测方法包括：
(1)制备对照品贮备液：取对映异构体对照品、非对映异构体1对照品，非对映异构体2对照品、非对映异构体4对照品、非对映异构体5对照品和富马酸替诺福韦艾拉酚胺对照品各适量，分别用稀释剂稀释至每1mL含对映异构体对照品、非对映异构体1对照品，非对映异构体2对照品、非对映异构体4对照品、非对映异构体5对照品和富马酸替诺福韦艾拉酚胺对照品0.1mg；
(2)制备定量限溶液：取对映异构体对照品贮备液45μL、非对映异构体1对照品贮备液20μL、非对映异构体2对照品贮备液80μL、非对映异构体4对照品贮备液45μL，非对映异构体5对照品贮备液30μL和富马酸替诺福韦艾拉酚胺对照品贮备液35μL混合，再用稀释剂稀释至10mL；
(3)制备线性溶液1(相当于供试品浓度的20％)：取对映异构体对照品贮备液40μL、非对映异构体1对照品贮备液40μL、非对映异构体2对照品贮备液40μL、非对映异构体4对照品贮备液40μL，非对映异构体5对照品贮备液40μL、富马酸替诺福韦艾拉酚胺对照品贮备液100μL混合，再用稀释剂稀释至10mL；
(4)制备线性溶液2(相当于供试品浓度的50％)：取对映异构体对照品贮备液100μL、非对映异构体1对照品贮备液100μL、非对映异构体2对照品贮备液100μL、非对映异构体4对照品贮备液100μL，非对映异构体5对照品贮备液100μL、富马酸替诺福韦艾拉酚胺对照品贮备液250μL混合，再用稀释剂稀释至10mL；
(5)制备线性溶液3(相当于供试品浓度的100％)：取对映异构体对照品贮备液200μL、非对映异构体1对照品贮备液200μL、非对映异构体2对照品贮备液200μL、非对映异构体4对照品贮备液200μL，非对映异构体5对照品贮备液200μL、富马酸替诺福韦艾拉酚胺对照品贮备液500μL混合，再用稀释剂稀释至10mL；
(6)制备线性溶液4(相当于供试品浓度的200％)：取对映异构体对照品贮备液400μL、非对映异构体1对照品贮备液400μL、非对映异构体2对照品贮备液400μL、非对映异构体4对照品贮备液400μL，非对映异构体5对照品贮备液400μL、富马酸替诺福韦艾拉酚胺对照品贮备液1000μL混合，再用稀释剂稀释至10mL；
(7)取线性溶液1-4和定量限溶液各15μL，分别注入高效液相色谱仪中进行检测，色谱条件与实施例1相同，记录色谱图。
以浓度(C)为横坐标(X轴)，以峰面积(A)为纵坐标(Y轴)，进行线性回归分析。
检测结果如下：
对映异构体在0.45μg/mL-4.04μg/mL(定量限-相当于供试品浓度的200％)浓度范围内，线性方程为y＝32339.3919x+1870.7539，相关系数r为0.9956，大于0.9950，表明峰面积与浓度呈良好的线性关系。
非对映异构体1在0.21μg/mL-4.17μg/mL(定量限-相当于供试品浓度的200％)浓度范围内，线性方程为y＝31561.6754x-530.3018，相关系数r为0.9998，大于0.9950，表明峰面积与浓度呈良好的线性关系。
非对映异构体2在0.79μg/mL-3.95μg/mL(定量限-相当于供试品浓度的200％)浓度范围内，线性方程为y＝28630.5076x-3027.4885，相关系数r为0.9971，大于0.9950，表明峰面积与浓度呈良好的线性关系。
非对映异构体4在0.46μg/mL-4.07μg/mL(定量限-相当于供试品浓度的200％)浓度范围内，线性方程为y＝30337.4126x-877.2614，相关系数r为0.9999，大于0.9950，表明峰面积与浓度呈良好的线性关系。
非对映异构体5在0.31μg/mL-4.17μg/mL(定量限-相当于供试品浓度的200％)浓度范围内，线性方程为y＝28871.0142x-98.4727，相关系数r为0.9995，大于0.9950，表明峰面积与浓度呈良好的线性关系。
富马酸替诺福韦艾拉酚胺在0.37μg/mL-10.47μg/mL(定量限-相当于供试品浓度的200％)浓度范围内，线性方程为y＝29465.1117x-2365.6721，相关系数r为0.9992，大于0.9950，表明峰面积与浓度呈良好的线性关系。
5.进样精密度评价
检测方法包括：
(1)制备对照溶液：取富马酸替诺福韦艾拉酚胺样品适量，用稀释剂稀释至每1mL中含富马酸替诺福韦艾拉酚胺1mg，作为供试品溶液；取供试品溶液0.5mL，用稀释剂稀释至100mL，作为对照溶液；
(2)取对照溶液20μL注入高效液相色谱仪中进行检测，色谱条件与实施例1相同，连续进样6次，记录色谱图。
对色谱图中的数据进行分析，结果如表4所示：
表4异构体测定方法进样精密度考察试验结果
| 名称 | 保留时间(分钟) | 峰面积 |
| 精密度1 | 19.593 | 171536 |
| 精密度2 | 19.597 | 170065 |
| 精密度3 | 19.594 | 169625 |
| 精密度4 | 19.589 | 169478 |
| 精密度5 | 19.588 | 168776 |
| 精密度6 | 19.589 | 168221 |
| 平均值 | 19.592 | 169617 |
| RSD(％) | 0.02 | 0.68 |
由检测结果可知：
对照溶液连续进样6次，主成分富马酸替诺福韦艾拉酚胺保留时间与峰面积的RSD值分别为0.02％和0.68％，均小于1.0％，表明进样精密度良好。
6.重复性评价
检测方法包括：
(1)取富马酸替诺福韦艾拉酚胺样品6份，制备供试品溶液6份，制备方法为：取富马酸替诺福韦艾拉酚胺样品适量，用稀释剂稀释至每1mL中含富马酸替诺福韦艾拉酚胺1mg，作为供试品溶液；
(2)制备对照溶液6份，制备方法为：取供试品溶液各0.5mL，用稀释剂稀释至100mL，作为对照溶液；
(3)取6份供试品溶液和6份对照溶液各20μL，分别注入高效液相色谱仪中进行检测，色谱条件与实施例1相同，记录色谱图。
对色谱图中的数据进行分析，结果如表5所示：
表5异构体测定方法重复性考察试验结果
由检测结果可知：
平行配制的6份供试品溶液中各异构体检出情况基本一致，总杂含量基本一致，表明富马酸替诺福韦艾拉酚胺及其异构体的分离测定方法的重复性良好。
7.准确度评价
检测方法包括：
(1)制备对照品贮备液：取对映异构体对照品、非对映异构体1对照品，非对映异构体2对照品、非对映异构体4对照品和非对映异构体5对照品各适量，分别用稀释剂稀释至每1mL含对映异构体对照品、非对映异构体1对照品，非对映异构体2对照品、非对映异构体4对照品和非对映异构体5对照品0.1mg；
(2)制备对照品溶液：取对映异构体对照品贮备液、非对映异构体1对照品贮备液、非对映异构体2对照品贮备液、非对映异构体4对照品贮备液、非对映异构体5对照品贮备液各0.2mL混合，用稀释剂稀释至10mL；
(3)制备100％回收率供试品溶液：取富马酸替诺福韦艾拉酚胺样品11.21mg，加入对映异构体对照品贮备液、非对映异构体1对照品贮备液、非对映异构体2对照品贮备液、非对映异构体4对照品贮备液、非对映异构体5对照品贮备液各0.2mL混合，然后用稀释剂稀释至10mL；
(4)取对照品溶液与100％回收率供试品溶液各15μL，分别注入高效液相色谱仪中进行检测，色谱条件与实施例1相同，记录色谱图。
回收率按照如下公式计算：
对色谱图中的数据进行分析，结果如表6-10所示：
表6对映异构体准确度考察结果
表7非对映异构体1准确度考察结果
表8非对映异构体2准确度考察结果
表9非对映异构体4准确度考察结果
表10非对映异构体5准确度考察结果
由检测结果可知：
在相当于供试品浓度的100％，对映异构体、非对映异构体1，非对映异构体2、非对映异构体4、非对映异构体5的平均回收率分别为104.1％、105.0％、100.8％、104.5％、99.9％，回收率均在90％～108％之间；RSD值分别为3.37％、6.79％、2.07％、2.02％、4.47％，均小于8.0％，表明富马酸替诺福韦艾拉酚胺及其异构体的分离测定方法的准确度良好。
8.耐用性评价
考察在柱温变化-5℃、流速变化±0.2mL/分钟、检测波长变化±5nm及不同流动相比例变化±2％的微小变化时，富马酸替诺福韦艾拉酚胺及其异构体的分离测定方法的耐用性。
检测方法包括：
(1)制备系统适用性溶液：取富马酸替诺福韦艾拉酚胺对照品、对映异构体对照品、非对映异构体1对照品、非对映异构体2对照品、非对映异构体3对照品、非对映异构体4对照品、非对映异构体5对照品各适量，用稀释剂稀释至每1mL中含富马酸替诺福韦艾拉酚胺1mg、各个异构体各5μg的混合溶液，作为系统适用性溶液；
(2)精密量取系统适用性20μL，注入高效液相色谱仪中进行检测，连续进样6次，色谱条件与实施例1相同，记录色谱图。
对色谱图中的数据进行分析，结果如表11所示：
表11异构体测定方法耐用性考察试验结果
由检测结果可知：
对色谱条件进行微小变化时(柱温变化-5℃、流速变化±0.2mL/分钟、检测波长变化±5nm及不同流动相比例变化±2％)，各相邻色谱峰之间分离度均大于1.5，系统适用性良好，表明富马酸替诺福韦艾拉酚胺及其异构体的分离测定方法的耐用性良好。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种富马酸替诺福韦艾拉酚胺及其异构体的分离测定方法，其特征在于，所用色谱柱为手性色谱柱，流动相为正己烷、乙醇、甲醇和二乙胺的混合溶液，其中正己烷、乙醇、甲醇和二乙胺的体积比为70-77：18-22：5-10：0.1；
所述异构体为以下富马酸替诺福韦艾拉酚胺异构体的一种或多种：
2.根据权利要求1所述的分离测定方法，其特征在于，所述手性色谱柱以表面涂敷有直链淀粉-三(3,5-二甲苯基氨基甲酸酯)的硅胶为填充剂。
3.根据权利要求2所述的分离测定方法，其特征在于，所述色谱柱柱长为250mm，内径为4.6mm，填充料粒径为5μm。
4.根据权利要求1所述的分离测定方法，其特征在于，所述方法中样品的稀释剂为正己烷、乙醇和甲醇的混合溶液，其中正己烷、乙醇和甲醇的体积比为75：20：5。
5.根据权利要求1-4任一所述的分离测定方法，其特征在于，所述分离测定方法为正相高效液相色谱法，包括：
取富马酸替诺福韦艾拉酚胺样品制成供试品溶液，取供试品溶液稀释成对照溶液，取富马酸替诺福韦艾拉酚胺对照品及六种异构体对照品制成系统适用性溶液；
分别将供试品溶液、对照溶液和系统适用性溶液注入高效液相色谱仪中进行检测；
将供试品溶液产生的色谱图的杂质峰和主成分峰面积比较，按照主成分自身对照法计算各有关物质的含量。
6.根据权利要求5所述的分离测定方法，其特征在于，所述高效液相色谱的测定条件包括：色谱柱柱温为30-40℃；色谱柱进样量为15-20μL；流动相流速为0.8-1.2mL/min；检测器采用紫外检测器，检测波长为255-265nm。
7.根据权利要求5所述的分离测定方法，其特征在于，每1mL所述供试品溶液中含有富马酸替诺福韦艾拉酚胺样品1mg。
8.根据权利要求5所述的分离测定方法，其特征在于，每1mL所述对照溶液中含有富马酸替诺福韦艾拉酚胺样品5μg。
9.根据权利要求5所述的分离测定方法，其特征在于，每1mL所述系统适用性溶液中含有富马酸替诺福韦艾拉酚胺对照品1mg、各个异构体对照品各5μg。
10.一种如权利要求1-9中任一所述的分离测定方法在富马酸替诺福韦艾拉酚胺成分分析、含量检测中的应用。
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