CN117030876A - 富马酸伏诺拉生起始物料的有关物质的检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于药物分析技术领域，具体涉及富马酸伏诺拉生起始物料的有关物质的检测方法。选择合适的色谱柱，改变流动相体系及洗脱梯度比例，使2‑氟苯乙酮、2‑溴‑2'‑氟乙酰苯、[2‑(2‑氟苯基)‑2‑氧代乙基]丙二腈、2‑氯‑5‑(2‑氟苯基)‑1H‑吡咯‑3‑甲腈、5‑苯基‑1H‑吡咯‑3‑甲腈、5‑(3‑氟苯基)‑1H‑吡咯‑3‑甲腈和5‑(4‑氟苯基)‑1H‑吡咯‑3‑甲腈7种杂质在样品5‑(2‑氟苯基)‑1H‑吡咯‑3‑甲腈中的含量可以在一次色谱行为中呈现，便于生产过程中产品质量的控制，具有简单易行，准确性及精密度高、稳定性及重现性好的优点。

Description

富马酸伏诺拉生起始物料的有关物质的检测方法
技术领域
本发明属于药物分析技术领域，具体涉及富马酸伏诺拉生起始物料的有关物质的检测方法。
背景技术
富马酸伏诺拉生(Vonoprazan Fumarate)，其化学名为1-[5-(2-氟苯基)-1-(吡啶-3-磺酰基)-1H-吡咯-3-基]-N-甲基甲胺单富马酸盐，分子式：C21H20FN3O6S，分子量：461.46。
其结构式为：
富马酸伏诺拉生主要是通过阻断H+，K+-ATP酶的K+通道，竞争性阻滞K+与该酶的结合，可长时间停留于胃壁细胞，从而快速抑制胃酸的分泌，为反流性食管炎患者提供了全新的治疗选择。主要用于治疗胃酸相关疾病，包括胃溃疡、十二指肠溃疡、反流性食管炎、预防服用低剂量阿司匹林期间胃溃疡或十二指肠溃疡的复发、预防服用非甾体类抗炎药期间胃溃疡以及辅助幽门螺杆菌根除用于如下情况：胃溃疡、十二指肠溃疡、胃黏膜相关淋巴组织（MALT）淋巴瘤、特发性血小板减少性紫癜、早期胃癌内窥镜切除术后、幽门螺杆菌胃炎。
目前为止，没有公开的富马酸伏诺拉生起始物料（5-(2-氟苯基)-1H-吡咯-3-甲腈）有关物质的检测方法。结合富马酸伏诺拉生工艺路线，对可能存在的工艺杂质、降解产物进行了全面分析：
5-(2-氟苯基)-1H-吡咯-3-甲腈作为起始物料，其工艺生产过程中可能存在杂质：2-氟苯乙酮（记为杂质1）、2-溴-2'-氟乙酰苯（记为杂质2）、[2-(2-氟苯基)-2-氧代乙基]丙二腈（记为杂质3）、2-氯-5-(2-氟苯基)-1H-吡咯-3-甲腈（记为杂质4）、5-苯基-1H-吡咯-3-甲腈（记为杂质5）、5-(3-氟苯基)-1H-吡咯-3-甲腈（记为杂质6）和5-(4-氟苯基)-1H-吡咯-3-甲腈（记为杂质7）。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提供一种富马酸伏诺拉生起始物料的有关物质的检测方法，便于生产过程中产品质量的控制，简单易行，准确性和精密度高，稳定性和重现性良好。
本发明所述的富马酸伏诺拉生起始物料的有关物质的检测方法，包括以下操作步骤：
1）色谱条件：
色谱柱：Thermo AcclaimTM polar advantage Ⅱ C18柱，4.6×250mm，5μm；
检测波长：254nm；
进样量：10µL；
流动相A：体积比为30:70的乙腈-0.05%磷酸水溶液；流动相B：乙腈；
流动相A和流动相B以不同的体积比，按下表进行梯度洗脱：
2）溶液配制：
精密称取5-(2-氟苯基)-1H-吡咯-3-甲腈的有关物质适量于同一容量瓶中，加乙腈溶解并稀释成浓度为2.5μg/mL的溶液，作为对照品溶液；
精密称取5-(2-氟苯基)-1H-吡咯-3-甲腈样品约5mg，置10mL量瓶中，加乙腈溶解并稀释至刻度，摇匀，作为样品溶液。
3）测定方法：精密量取对照品溶液和样品溶液各10μL注入液相色谱仪，记录色谱图，按面积归一化法以峰面积计算。
优选的，步骤1）中流动相流速：1.0mL/min。
优选的，步骤1）中柱温：30℃。
优选的，富马酸伏诺拉生起始物料有关物质分别为2-氟苯乙酮、2-溴-2'-氟乙酰苯、[2-(2-氟苯基)-2-氧代乙基]丙二腈、2-氯-5-(2-氟苯基)-1H-吡咯-3-甲腈、5-苯基-1H-吡咯-3-甲腈、5-(3-氟苯基)-1H-吡咯-3-甲腈和5-(4-氟苯基)-1H-吡咯-3-甲腈。
本发明通过对方法的专属性、精密度、检测限与定量限、线性、范围、耐用性的方法学研究，表明方法可用于富马酸伏诺拉生中已知杂质的检测，能正确指导富马酸伏诺拉生的生产。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明选择合适的色谱柱，改变流动相体系及洗脱梯度比例，使2-氟苯乙酮、2-溴-2'-氟乙酰苯、[2-(2-氟苯基)-2-氧代乙基]丙二腈、2-氯-5-(2-氟苯基)-1H-吡咯-3-甲腈、5-苯基-1H-吡咯-3-甲腈、5-(3-氟苯基)-1H-吡咯-3-甲腈和5-(4-氟苯基)-1H-吡咯-3-甲腈7种杂质在样品5-(2-氟苯基)-1H-吡咯-3-甲腈中的含量可以在一次色谱行为中呈现，便于生产过程中产品质量的控制，具有简单易行，准确性及精密度高、稳定性及重现性好的优点。
附图说明
图1、富马酸伏诺拉生起始物料（5-(2-氟苯基)-1H-吡咯-3-甲腈）及有关物质色谱峰定位图；
图2、杂质1线性曲线；
图3、杂质2线性曲线；
图4、杂质3线性曲线；
图5、杂质4线性曲线；
图6、杂质5线性曲线；
图7、杂质6线性曲线；
图8、杂质7线性曲线；
图9、5-(2-氟苯基)-1H-吡咯-3-甲腈线性曲线一；
图10、5-(2-氟苯基)-1H-吡咯-3-甲腈线性曲线二；
图11、批号20201005样品检测谱图；
图12、批号XD28062001样品检测谱图；
图13、批号XD28062002样品检测谱图。
具体实施方式
本发明所述的富马酸伏诺拉生起始物料的有关物质的检测方法，包括以下操作步骤：
1）色谱条件：
色谱柱：Thermo AcclaimTM polar advantage Ⅱ C18柱，4.6×250mm，5μm；
流速：1.0mL/min；
检测波长：254nm；
柱温：30℃；
进样量：10µL；
流动相A：体积比为30:70的乙腈-0.05%磷酸水溶液；流动相B：乙腈；
流动相A和流动相B以不同的体积比，按下表进行梯度洗脱：
2）溶液配制：
精密称取5-(2-氟苯基)-1H-吡咯-3-甲腈的有关物质适量于同一容量瓶中，加乙腈溶解并稀释成浓度为2.5μg/ml的溶液，作为对照品溶液；
精密称取5-(2-氟苯基)-1H-吡咯-3-甲腈样品约5mg，置10mL量瓶中，加乙腈溶解并稀释至刻度，摇匀，作为样品溶液。
3）测定方法：精密量取对照品溶液和样品溶液各10μL注入液相色谱仪，记录色谱图，按面积归一化法以峰面积计算。
富马酸伏诺拉生起始物料有关物质分别为2-氟苯乙酮、2-溴-2'-氟乙酰苯、[2-(2-氟苯基)-2-氧代乙基]丙二腈、2-氯-5-(2-氟苯基)-1H-吡咯-3-甲腈、5-苯基-1H-吡咯-3-甲腈、5-(3-氟苯基)-1H-吡咯-3-甲腈和5-(4-氟苯基)-1H-吡咯-3-甲腈。
下面以具体实施例对本发明做进一步说明，实施例中所用试剂参数如下：
乙腈：色谱纯，厂家：北京百灵威科技有限公司，批号：LGB0U57。
磷酸：色谱纯，厂家：天津市科密欧化学试剂有限公司，批号：20190715。
2-氟苯乙酮(杂质1)：山东轩德医药科技有限公司，批号：20200315，含量：99.20%；
2-溴-2'-氟乙酰苯（杂质2）：HIC，批号：XH20-2758，含量：98.59%；
[2-（2-氟苯基）-2-氧代乙基]丙二腈（杂质3）：山东轩德医药科技有限公司，批号：20200820，含量：99.77%；
2-氯-5-（2-氟苯基）-1H-吡咯-3-甲腈（杂质4）：山东轩德医药科技有限公司，批号：XD28041801，含量：98.98%；
5-苯基-1H-吡咯-3-甲腈-(杂质5)：QCC，批号：12-AUG-2--110，含量：99.76%；
5-（3-氟苯基）-1H-吡咯-3-甲腈（杂质6）：深圳卓越生物，批号：20201207，含量：99.65%；
5-（4-氟苯基）-1H-吡咯-3-甲腈（杂质7）：深圳卓越生物，批号：20201207，含量：99.23%；
5-(2-氟苯基)-1H-吡咯-3-甲腈：山东轩德医药科技有限公司，批号：20201005、XD28062001、XD28062002。
实施例1
1、色谱条件：
色谱柱：Thermo AcclaimTM polar advantage Ⅱ C18柱，4.6×250mm，5μm；
流速：1.0mL/min；
检测波长：254nm；
柱温：30℃；
进样量：10µL；
溶剂：乙腈；
流动相A：体积比为30:70的乙腈-0.05%磷酸水溶液；流动相B：乙腈；
流动相A和流动相B以不同的体积比，按下表进行梯度洗脱：
2、专属性
2.1溶液配制
（1）空白溶液：乙腈。
（2）杂质1溶液：称取杂质1 4.748mg于20mL容量瓶中，加乙腈溶解并稀释至刻度，得杂质1储备液；取该溶液0.5mL，用乙腈稀释至50mL，摇匀。
（3）杂质2溶液：称取杂质2 0.984mg于20mL容量瓶中，加乙腈溶解并稀释至刻度，得杂质2储备液；取该溶液1.0mL，用乙腈稀释至20mL，摇匀。
（4）杂质3溶液：称取杂质3 1.066mg于20mL容量瓶中，加乙腈溶解并稀释至刻度，得杂质3储备液；取该溶液1.0mL，用乙腈稀释至20mL，摇匀。
（5）杂质4溶液：称取杂质4 1.162mg于20mL容量瓶中，加乙腈溶解并稀释至刻度，得杂质4储备液；取该溶液1.0mL，用乙腈稀释至20mL，摇匀。
（6）杂质5溶液：称取杂质5 0.990mg于20mL容量瓶中，加乙腈溶解并稀释至刻度，得杂质5储备液；取该溶液1.0mL，用乙腈稀释至20mL，摇匀。
（7）杂质6溶液：称取杂质6 1.226mg于20mL容量瓶中，加乙腈溶解并稀释至刻度，得杂质6储备液；取该溶液1.0mL，用乙腈稀释至20mL，摇匀。
（8）杂质7溶液：称取杂质7 1.052mg于20mL容量瓶中，加乙腈溶解并稀释至刻度，得杂质7储备液；取该溶液1.0mL，用乙腈稀释至20mL，摇匀。
（9）杂质混合溶液：精密量取杂质1储备液0.2mL，杂质2、杂质3、杂质4、杂质5、杂质6、杂质7储备液各1.0mL，于同一20mL容量瓶中，用乙腈稀释至刻度，摇匀。
（10）杂质和样品混合溶液：称取样品5.195mg，置于10ml容量瓶中，用杂质混合溶液溶解并稀释至刻度，摇匀。
取溶液（1）~（10）各10μL，注入液相色谱仪，分别进样，记录图谱（见图1），结果见表1。
2.2评价标准：空白溶液在5-(2-氟苯基)-1H-吡咯-3-甲腈峰和各杂质峰处应无显著干扰；根据各杂质溶液图谱确定各杂质峰的保留时间；各杂质与5-(2-氟苯基)-1H-吡咯-3-甲腈峰分离度应符合要求。
表1专属性结果
2.3结果：空白溶液在5-(2-氟苯基)-1H-吡咯-3-甲腈峰和各杂质峰处均无显著干扰；杂质1的保留时间为13.496min，杂质2的保留时间为21.655min，杂质3的保留时间为15.483min，杂质4的保留时间为47.906min，杂质5的保留时间为29.022min，杂质6的保留时间为36.121min，杂质7的保留时间为33.486min；各杂质之间及杂质与5-(2-氟苯基)-1H-吡咯-3-甲腈峰的分离度均大于1.5，符合要求。
3、精密度
3.1重复性
3.1.1溶液配制
空白溶液：溶剂；
杂质混合溶液：
杂质1溶液：称取杂质12.694mg于20ml容量瓶中，加乙腈溶解并稀释至刻度，得杂质1储备液；杂质2~7溶液：分别称取杂质22.402mg、杂质32.093mg、杂质42.090mg、杂质52.085mg、杂质62.075mg、杂质72.100mg于20mL容量瓶中，加乙腈溶解并稀释至刻度，得杂质2~7储备液；
精密量取杂质1储备液0.4ml，杂质2~7储备液0.5mL，于同一20mL容量瓶中，用乙腈稀释至刻度，摇匀。
重复性测试液：称取样品约5mg，置于10ml容量瓶中，用溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀。同法制备6份。
3.1.2测定
分别取空白溶液、杂质混合溶液及重复性测试液按照色谱条件进样，记录图谱，结果见表2。
3.1.3评价标准
测试液中，各杂质结果的极差均应不大于0.05%，总杂质结果的极差应不大于0.1%，5-(2-氟苯基)-1H-吡咯-3-甲腈归一化含量结果的RSD应不大于2%。
表2重复性测试结果
3.1.4结果
测试液中，杂质1、杂质2、杂质3及杂质7均未检出，杂质4及杂质5结果的极差均为0，杂质6结果的极差为0.01%，最大单杂结果的极差为0，均不大于0.05%，总杂质结果的极差为0.01%，不大于0.1%；5-(2-氟苯基)-1H-吡咯-3-甲腈归一化含量结果的RSD为0.005%，均符合要求。
3.2中间精密度
3.2.1溶液配制
空白溶液：溶剂；
杂质混合溶液：
杂质1溶液：称取杂质12.690mg于20mL容量瓶中，加乙腈溶解并稀释至刻度，得杂质1储备液；杂质2~7溶液：分别称取杂质22.387mg、杂质32.099mg、杂质42.106mg、杂质52.082mg、杂质62.059mg、杂质72.121mg于20mL容量瓶中，加乙腈溶解并稀释至刻度，得杂质2~7储备液。
精密量取杂质1储备液0.4ml，杂质2~7储备液0.5mL，于同一20mL容量瓶中，用乙腈稀释至刻度，摇匀。
中间精密度测试液：称取样品约5mg，置于10mL容量瓶中，用溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀。同法制备6份。
3.2.2测定
分别取空白溶液、杂质混合溶液及中间精密度测试液按照色谱条件进样，记录图谱，结果见表3。
表3中间精密度测试结果
3.2.3评价标准
测试液中，各杂质结果的极差均应不大于0.05%，总杂质结果的极差应不大于0.1%，5-(2-氟苯基)-1H-吡咯-3-甲腈归一化含量结果的RSD应不大于2%；与重复性结果比较，各杂质结果的极差均应不大于0.05%，总杂质结果的极差应不大于0.1%，5-(2-氟苯基)-1H-吡咯-3-甲腈归一化含量结果的RSD应不大于2%。
3.2.4结果：测试液中，杂质1、杂质2、杂质3及杂质7均未检出，杂质4、杂质5、杂质6结果的极差为0，最大单个杂质结果的极差为0.01%，均不大于0.05%，总杂质结果的极差为0.01%，不大于0.1%；5-(2-氟苯基)-1H-吡咯-3-甲腈归一化含量结果的RSD为0.005%，不大于2%，均符合要求。与重复性结果相比较，杂质4、杂质5结果的极差为0，杂质6、最大单个杂质结果的极差为0.01%，均不大于0.05%，总杂质结果的极差为0.02%，不大于0.1%；5-(2-氟苯基)-1H-吡咯-3-甲腈归一化含量结果的RSD为0.007%，不大于2%，均符合要求。
4、检测限与定量限
4.1溶液制备
空白溶液：乙腈；
定量限测试液：
（1）杂质1储备液：称取杂质14.847mg于20ml容量瓶中，加乙腈溶解并稀释至刻度，取该溶液0.5mL，用乙腈稀释至50mL，摇匀。
（2）杂质2储备液：称取杂质22.032mg于20mL容量瓶中，加乙腈溶解并稀释至刻度，取该溶液0.5mL，用乙腈稀释至20mL，摇匀。
（3）杂质3储备液：称取杂质32.121mg于20mL容量瓶中，加乙腈溶解并稀释至刻度，取该溶液0.5mL，用乙腈稀释至20mL，摇匀。
（4）杂质4储备液：称取杂质42.298mg于20mL容量瓶中，加乙腈溶解并稀释至刻度，取该溶液0.5ml，用乙腈稀释至20ml，摇匀。
（5）杂质5储备液：称取杂质52.097mg于20mL容量瓶中，加乙腈溶解并稀释至刻度，取该溶液0.5mL，用乙腈稀释至20mL，摇匀。
（6）杂质6储备液：称取杂质62.184mg于20mL容量瓶中，加乙腈溶解并稀释至刻度，取该溶液0.5mL，用乙腈稀释至20mL，摇匀。
（7）杂质7储备液：称取杂质72.098mg于20mL容量瓶中，加乙腈溶解并稀释至刻度，取该溶液0.5mL，用乙腈稀释至20mL，摇匀。
（8）5-(2-氟苯基)-1H-吡咯-3-甲腈储备液：称取5-(2-氟苯基)-1H-吡咯-3-甲腈5.168mg于10mL容量瓶中，加乙腈溶解并稀释至刻度，取该溶液1.0ml，用乙腈稀释至200ml，摇匀。
量取上述杂质1储备液1.0mL、杂质2储备液1.0mL、杂质3储备液0.8mL、杂质4储备液0.5mL、杂质5储备液1.0mL、杂质6储备液1.0mL、杂质7储备液1.4mL和5-(2-氟苯基)-1H-吡咯-3-甲腈储备液1.0mL，于同一20mL容量瓶中，加乙腈稀释至刻度，摇匀。
杂质混合检测限测试液：取定量限测试液2.5mL加乙腈稀释至10mL。
5-(2-氟苯基)-1H-吡咯-3-甲腈检测限测试液：取定量限测试液2.0mL加乙腈稀释至10ml。
4.2测定
当待测组分的信噪比为2~3时，对应的浓度为该组分的最小检测浓度；当待测组分的信噪比为10~20时，对应的浓度为该组分的最小定量浓度。分别取空白溶液、定量限溶液、检测限溶液，在色谱条件下分别进样，记录图谱，结果见表4。
4.3评价标准：各目标峰定量限峰面积的RSD均应不大于10%。
表4检测限与定量限
4.4结果
杂质1的检测限浓度为0.030μg/mL，检测限为60ppm；定量限浓度为0.120μg/mL，定量限为240ppm，定量限的峰面积的RSD为2.6%；杂质2的检测限浓度为0.031μg/mL，检测限为63ppm；定量限浓度为0.125μg/mL，定量限为250pm，定量限的峰面积的RSD为2.8%；杂质3的检测限浓度为0.026μg/mL，检测限为53ppm；定量限浓度为0.106μg/mL，定量限为212ppm，定量限的峰面积的RSD为8.5%；杂质4的检测限浓度为0.018μg/mL，检测限为36ppm；定量限浓度为0.071μg/mL，定量限为142ppm，定量限的峰面积的RSD为2.0%；杂质5的检测限浓度为0.033μg/mL，检测限为65ppm；定量限浓度为0.131μg/mL，定量限为261ppm，定量限的峰面积的RSD为6.0%；杂质6的检测限浓度为0.034μg/mL，检测限为68ppm；定量限浓度为0.136μg/mL，定量限为272ppm，定量限的峰面积的RSD为4.3%；杂质7的检测限浓度为0.046μg/mL，检测限为91ppm；定量限浓度为0.182μg/mL，定量限为364ppm，定量限的峰面积的RSD为1.2%；5-(2-氟苯基)-1H-吡咯-3-甲腈的检测限浓度为0.026μg/mL，检测限为52ppm；定量限浓度为0.129μg/mL，定量限为258ppm，定量限的峰面积的RSD为4.7%；均符合要求。
5、线性：考察在设计范围内，峰响应与浓度直接成正比的程度。
5.1溶液制备
空白溶液：溶剂。
线性测试溶液：
杂质与5-(2-氟苯基)-1H-吡咯-3-甲腈：
（1）杂质1储备液：称取杂质14.997mg于20mL容量瓶中，加乙腈溶解并稀释至刻度，摇匀。
（2）杂质2储备液：称取杂质22.006mg于20mL容量瓶中，加乙腈溶解并稀释至刻度，摇匀。
（3）杂质3储备液：称取杂质32.196mg于20mL容量瓶中，加乙腈溶解并稀释至刻度，摇匀。
（4）杂质4储备液：称取杂质42.273mg于20mL容量瓶中，加乙腈溶解并稀释至刻度，摇匀。
（5）杂质5储备液：称取杂质52.127mg于20mL容量瓶中，加乙腈溶解并稀释至刻度，摇匀。
（6）杂质6储备液：称取杂质62.212mg于20mL容量瓶中，加乙腈溶解并稀释至刻度，摇匀。
（7）杂质7储备液：称取杂质72.085mg于20mL容量瓶中，加乙腈溶解并稀释至刻度，摇匀。
（8）5-(2-氟苯基)-1H-吡咯-3-甲腈储备液：称取5-(2-氟苯基)-1H-吡咯-3-甲腈25.35mg于50mL容量瓶中，加乙腈溶解并稀释至刻度，摇匀。
线性测试溶液①：配制方法同定量限溶液。
线性测试溶液②：取线性测试溶液⑤1.0ml，用乙腈稀释至10mL，摇匀。。
线性测试溶液③：取线性测试溶液⑤2.0ml，用乙腈稀释至10mL，摇匀。
线性测试溶液④：取线性测试溶液⑤5.0ml，用乙腈稀释至10mL，摇匀。
线性测试溶液⑤：取上述杂质1储备液0.4mL、杂质2储备液1.0mL、杂质3储备液1.0mL、杂质4储备液1.0mL、杂质5储备液1.0mL、杂质6储备液1.0mL、杂质7储备液1.0mL、5-(2-氟苯基)-1H-吡咯-3-甲腈储备液0.2mL，用乙腈稀释至20mL，摇匀。
5-(2-氟苯基)-1H-吡咯-3-甲腈线性：
线性测试溶液①：取线性测试溶液④2.0ml，用乙腈稀释至10mL，摇匀。
线性测试溶液②：取线性测试溶液④5.0ml，用乙腈稀释至10mL，摇匀。
线性测试溶液③：取线性测试溶液④8.0ml，用乙腈稀释至10mL，摇匀。
线性测试溶液④：即上述5-(2-氟苯基)-1H-吡咯-3-甲腈储备液。
线性测试溶液⑤：称取5-(2-氟苯基)-1H-吡咯-3-甲腈6.163mg于10mL容量瓶中，加乙腈溶解并稀释至刻度，摇匀。
5.2测定
按照色谱条件分别取上述线性测试液进样，记录图谱，再以以峰面积对浓度作曲线，用最小二乘法计算回归方程及相关系数，线性曲线见图2~10，结果见表5。
5.3评价标准：在相应范围内，线性关系数R2均应≥0.99。
表5线性测定数据
5.4结果
杂质1浓度在0.124μg/mL~4.957μg/mL（相当于样品的0.025%～0.99%）范围内，线性相关系数R2为0.9994；杂质2浓度在0.124μg/mL～4.944μg/mL（相当于样品的0.025%～0.99%）范围内，线性相关系数R2为0.9998；杂质3浓度在0.110μg/mL～5.477μg/mL（相当于样品的0.022%～1.10%）范围内，线性相关系数R2为0.9999；杂质4浓度在0.070μg/mL~5.625μg/mL（相当于样品的0.014%～1.12%）范围内，线性相关系数R2为0.9999；杂质5浓度在0.133μg/mL~5.305μg/mL（相当于样品的0.027%～1.06%）范围内，线性相关系数R2为0.9999；杂质6浓度在0.138μg/mL~5.511μg/mL（相当于样品的0.028%～1.10%）范围内，线性相关系数R2为0.9998；杂质7浓度在0.181μg/mL~5.172μg/mL（相当于样品的0.036%～1.03%）范围内，线性相关系数R2为0.9999；5-(2-氟苯基)-1H-吡咯-3-甲腈浓度在0.127μg/mL~5.070μg/mL（相当于样品的0.025%～1.01%）范围内，线性相关系数R2为0.9999；均符合要求。
5.5范围
通过以上对精密度、线性的测试，可以确定杂质1浓度在0.124μg/mL~4.957μg/mL（相当于样品的0.025%～0.99%）范围内；杂质2浓度在0.124μg/mL～4.944μg/mL（相当于样品的0.025%～0.99%）范围内；杂质3浓度在0.110μg/mL～5.477μg/mL（相当于样品的0.022%～1.10%）范围内；杂质4浓度在0.070μg/mL~5.625μg/mL（相当于样品的0.014%～1.12%）范围内；杂质5浓度在0.133μg/mL~5.305μg/mL（相当于样品的0.027%～1.06%）范围内；杂质6浓度在0.138μg/mL~5.511μg/mL（相当于样品的0.028%～1.10%）范围内；杂质7浓度在0.181μg/mL~5.172μg/mL（相当于样品的0.036%～1.03%）范围内；5-(2-氟苯基)-1H-吡咯-3-甲腈浓度在0.127μg/mL~5.070μg/mL（相当于样品的0.025%～1.01%）范围内，该分析方法都是适用的，得到的结果是准确可靠的。
6、耐用性
耐用性测试液：
空白溶液：溶剂。
杂质混合溶液：杂质1溶液：称取杂质12.664mg于20mL容量瓶中，加乙腈溶解并稀释至刻度，得杂质1储备液；杂质2~7溶液：分别称取杂质22.375mg、杂质32.114mg、杂质42.070mg、杂质52.082mg、杂质62.064mg、杂质72.121mg于20mL容量瓶中，加乙腈溶解并稀释至刻度，得杂质2~7储备液。
精密量取杂质1储备液0.4ml，杂质2~7储备液0.5mL，于同一20mL容量瓶中，用乙腈稀释至刻度，摇匀。
样品溶液：称取样品约5mg，置于10mL量瓶中，加溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀。
样品+杂质混合溶液：称取样品约5mg，置于10mL量瓶中，加杂质混合溶液溶解并稀释至刻度，摇匀。
6.1放置时间的影响
6.1.1测试：取空白溶液进样1针；分别在放置0h、2h、4.5h、6.5h、9h、12h、24h、49.5h，取杂质混合溶液进样1针、样品溶液进样1针，按照色谱条件进样，记录图谱，计算各溶液色谱图中各色谱峰峰面积的相对标准偏差，结果见表6。
6.1.2评价标准：若杂质混合溶液图谱中，各杂质峰面积的RSD应不大于2.0%，样品溶液中各杂质结果的极差应不大于0.05%，总杂质结果的极差应不大于0.1%，5-(2-氟苯基)-1H-吡咯-3-甲腈归一化含量结果的RSD应不大于2%，则可以认为有关物质项下杂质混合溶液及样品溶液在放置49.5小时内是稳定的。
表6放置时间的测试结果
6.1.3结果
溶液放置49.5小时，杂质混合溶液中杂质1峰面积的RSD为0.49%，杂质2峰面积的RSD为1.09%，杂质3峰面积的RSD为1.53%，杂质4峰面积的RSD为0.47%，杂质5峰面积的RSD为0.46%，杂质6峰面积的RSD为0.39%，杂质7峰面积的RSD为0.74%，均不大于2.0%；样品溶液中杂质1、杂质2、杂质3和杂质7未检出，杂质4结果的极差为0，杂质5结果的极差为0，杂质6结果的极差为0.01%，最大单个杂质结果的极差为0，均不大于0.05%；总杂质结果的极差为0.01%，不大于0.1%，5-(2-氟苯基)-1H-吡咯-3-甲腈归一化含量结果的RSD为0.005%，不大于2%，均符合要求，因此样品溶液在放置49.5小时内是稳定的。
6.2在既定色谱条件的基础上，改变流速、柱温、色谱柱
流速：将初始流速变化±5%；
柱温：将柱温调节±2℃；
色谱柱：将色谱柱更换为Phenomenex Luna® Omega Polar C18 4.6×250mm，5μm；
精密量取上述对照品和样品溶液各10μLl注入液相色谱仪，记录色谱图。结果如表7、8所示记录图谱，结果如表7。
表7 耐用性结果
6.2.1评价标准
各条件下，空白溶液在5-(2-氟苯基)-1H-吡咯-3-甲腈峰和各杂质峰处应无显著干扰，样品溶液中在5-(2-氟苯基)-1H-吡咯-3-甲腈峰及各杂质峰附近应无显著干扰；对照溶液中各杂质的分离度应大于1.5；混合溶液中，各杂质结果的极差均应不大于0.05%，总杂质结果的极差应不大于0.1%，5-(2-氟苯基)-1H-吡咯-3-甲腈归一化含量结果的RSD应不大于2%。
6.2.2结果
在柱温±2℃、柱流速变化±5%条件下，空白溶液在5-(2-氟苯基)-1H-吡咯-3-甲腈峰和各杂质峰处无显著干扰；样品溶液中在5-(2-氟苯基)-1H-吡咯-3-甲腈峰及各杂质峰附近无显著干扰，杂质4结果的极差为0，杂质5、杂质6、最大单个杂质结果的极差为0.01%，均不大于0.05%，总杂质结果的极差为0.03%，不大于0.1%，5-(2-氟苯基)-1H-吡咯-3-甲腈归一化含量结果的RSD为0.01%，不大于2%；混合溶液中，各杂质的分离度均大于1.5，该分析方法耐用性良好。
更换色谱柱后，杂质峰分离度不符合要求，因此，5-(2-氟苯基)-1H-吡咯-3-甲腈的分析检测应采用固定色谱柱。
7、样品检测
按分析方法，取3批样品按照方法规定的色谱条件进行检验，计算供试品中已知杂质的含量，结果见表8，符合质量标准，所得图谱见图11~图13。
表8样品测定结果
杂质1、杂质2、杂质3、杂质7均未检出。
验证总结
通过对该分析方法的专属性、检测限、定量限、精密度、线性、耐用性的验证，各项验证的结果均符合验证方案的指标要求，充分证明了采用该分析方法得到的分析结果是可靠的。

Claims (4)

1.一种富马酸伏诺拉生起始物料的有关物质的检测方法，其特征在于，包括以下操作步骤：
1）色谱条件：
色谱柱：Thermo AcclaimTM polar advantage Ⅱ C18柱，4.6×250mm，5μm；
检测波长：254nm；
进样量：10µL；
流动相A：体积比为30:70的乙腈-0.05%磷酸水溶液；流动相B：乙腈；
流动相A和流动相B以不同的体积比，按下表进行梯度洗脱：
2）溶液配制：
精密称取5-(2-氟苯基)-1H-吡咯-3-甲腈的有关物质适量于同一容量瓶中，加乙腈溶解并稀释成浓度为2.5μg/mL的溶液，作为对照品溶液；
精密称取5-(2-氟苯基)-1H-吡咯-3-甲腈样品约5mg，置10mL量瓶中，加乙腈溶解并稀释至刻度，摇匀，作为样品溶液；
3）测定方法：精密量取对照品溶液和样品溶液各10μL注入液相色谱仪，记录色谱图，按面积归一化法以峰面积计算。
2.根据权利要求1所述的富马酸伏诺拉生起始物料的有关物质的检测方法，其特征在于，步骤1）中流动相流速：1.0mL/min。
3.根据权利要求1所述的富马酸伏诺拉生起始物料的有关物质的检测方法，其特征在于，步骤1）中柱温：30℃。
4.根据权利要求1所述的富马酸伏诺拉生起始物料的有关物质的检测方法，其特征在于，富马酸伏诺拉生起始物料有关物质分别为2-氟苯乙酮、2-溴-2'-氟乙酰苯、[2-(2-氟苯基)-2-氧代乙基]丙二腈、2-氯-5-(2-氟苯基)-1H-吡咯-3-甲腈、5-苯基-1H-吡咯-3-甲腈、5-(3-氟苯基)-1H-吡咯-3-甲腈和5-(4-氟苯基)-1H-吡咯-3-甲腈。
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