CN115856156A - 一种多肽保护氨基酸对映异构体的测定方法 - Google Patents

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CN115856156A CN202310004045.5A CN202310004045A CN115856156A CN 115856156 A CN115856156 A CN 115856156A CN 202310004045 A CN202310004045 A CN 202310004045A CN 115856156 A CN115856156 A CN 115856156A
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赵娴
汤婷婷
芮美琪
张倩颖
沙向阳
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Abstract

本发明涉及一种多肽保护氨基酸对映异构体的测定方法。与现有技术相比，没有采用正相色谱柱，以正己烷、异丙醇/乙醇作为流动相体系来测定对映异构体；而是采用表面涂敷纤维素‑三（4‑甲基苯甲酸酯）填料的反相手性色谱柱，以醋酸铵溶液‑乙腈作为流动相，进行梯度洗脱；该色谱条件下，对映异构体和主成分能够有效分离，采用缓冲盐作为流动相，目标峰峰形尖锐，易于判断和检测；且该流动相体系中所用醋酸铵和乙腈均为常规试剂，易于获取，降低了检测成本。

Description

一种多肽保护氨基酸对映异构体的测定方法
技术领域
本发明涉及药物分析技术领域，具体涉及一种多肽保护氨基酸对映异构体的测定方法。
醋酸西曲瑞克，又常称为西曲瑞克，是一种有效的黄体酮释放激素抑制素受体拮抗剂，它能控制卵巢的刺激作用，预防不成熟卵泡过早排出，帮助受孕；西曲瑞克单剂量方案可减少注射次数，更方便使用。目前国内注射用醋酸西曲瑞克仅有原研药品在售，竞争格局良好，是辅助生殖相关指南推荐用药，临床前景较好。醋酸西曲瑞克一种合成的十肽，其化学名称为：N-乙酰-3-(2-萘)-D-丙氨酰-p-氯-D-苯丙氨酰-3-(3-吡啶基)-D-丙氨酰-L-丝氨酰-L-酪氨酰-N5-氨甲酰-D-鸟氨酰-L-亮氨酰-L-精氨酰-L-脯氨酰-D-丙氨酰胺醋酸盐。
其结构式为：
Figure BDA0004035429630000011
可以看出，醋酸西曲瑞克肽链中含有多个手性中心，而这些手性中心是由合成醋酸西曲瑞克的多个氨基酸起始原料引进的。这些氨基酸起始原料中均存在对映异构体杂质风险，若对起始原料的手性杂质不加以控制，会引入到终产品中，导致终产品精制困难，难以达到质控标准，生产成本增加。
因此，开发出能有效检出氨基酸对映异构体的分析方法，对醋酸西曲瑞克的生产和提纯具有重要的指导意义，并建立严格的质控标准，从而对降低终产品提纯难度、提高产品质量有积极意义。
目前对于多肽保护氨基酸对映体的测定分析方法文献较少，专利CN111505161A公开了一种保护氨基酸对映异构体检测方法，是采用反相色谱方法对Fmoc保护氨基酸的对映体进行测定，使用的色谱柱为纤维素-三(3，5-二甲基苯基氨基甲酸酯)色谱柱，流动相为0.1％三氟乙酸水溶液-乙腈体系。申请人尝试用该方法检测醋酸西曲瑞克的多个氨基酸起始原料，发现并不适用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种多肽保护氨基酸对映异构体的分析方法，该色谱条件对醋酸西曲瑞克的一种保护氨基酸起始物料的对映异构体检测皆适用。能够实现主峰与对映异构体的有效分离，分离效果突出，专属性好。
实现上述发明目的的技术方案是：
本发明提供一种多肽保护氨基酸对映异构体的测定方法，包括以下步骤：
(1)样品配制：
供试品溶液制备：精密称取供试品10mg，置20ml量瓶中，用稀释剂溶解并稀释至刻度线，摇匀，即得；
对照品溶液制备：精密称取保护氨基酸对映异构体，用稀释剂溶解并稀释成浓度为0.03mg/ml的溶液，作为对照品贮备液；精密量取对照品贮备液1ml，置20ml量瓶中，用稀释剂溶解并稀释至刻度线，摇匀，即得；
灵敏度溶液制备：精密量取对照品溶液2ml，置10ml量瓶中，用稀释剂溶解并稀释至刻度线，摇匀，即得；
系统适用性溶液制备：精密称取供试品10mg，置20ml量瓶中，加入对照品贮备液1ml，用稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀，即得；
(2)色谱条件设置：
色谱柱：硅胶表面涂敷有纤维素-三(4-甲基苯甲酸酯)手性固定相为色谱柱；
流动相：以5mmol/L醋酸铵溶液(乙酸调节pH至4.5)为流动相A，以乙腈为流动相B进行梯度洗脱；
柱温：20～30℃；
流速：0.3～1.0ml/min；
进样体积：1～10μl；
检测波长：260～270nm；
(3)检测和计算：
精密量取系统适用性溶液、对照品溶液和供试品溶液，分别注入液相色谱仪，记录色谱图；通过外标法计算主峰和对映异构体的峰面积。
根据本发明实施方案所述稀释剂为乙腈溶液。
根据本发明实施方案按照下表进行梯度洗脱：
Figure BDA0004035429630000031
根据本发明实施方案，柱温为20～30℃；例如：20℃、21℃、22℃、23℃、24℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃，优选为25℃。
根据本发明实施方案，流速为0.3～1.0ml/min；例如：0.3ml/min、0.4ml/min、0.5ml/min、0.6ml/min、0.7ml/min、0.8ml/min、0.9ml/min、1.0ml/min，优选为1.0ml/min。
根据本发明实施方案，进样体积为1～10μl；例如：1μl、3μl、5μl、7μl、9μl、10μl；优选为10μl。
根据本发明实施方案，检测波长为260～270nm；例如：260nm、261nm、262nm、263nm、264nm、265nm、266nm、267nm、268nm、269nm、270nm；优选为264nm。
根据本发明实施方案，所述保护氨基酸为Fmoc-Tyr(tBu)-OH。
本发明还提供一种多肽保护氨基酸对映异构体的测定方法用于测定醋酸西曲瑞克起始原料药中保护氨基酸的纯度，所述保护氨基酸为Fmoc-Tyr(tBu)-OH，其对应异构体的含量不高于0.3％。
本发明的有益效果是：
1、本发明采用的流动相是为醋酸铵和乙腈，为常用缓冲盐和极性试剂，很少与样品会发生反应，洗脱能力较好，且色谱系统压力较小。同时流动相系统中未使用三氟乙酸和甲酸等酸性添加剂，从而避免了因为长期使用酸性流动相而造成手性色谱柱和仪器被腐蚀的问题。
2、本发明对醋酸西曲瑞克起始物料一种保护氨基酸Fmoc-Tyr(tBu)-OH中可能的降解杂质和工艺杂质，如酪氨酸，Fmoc-Tyr(tBu)-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-β-Ala-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-β-Ala-OH、Fmoc-Osu和H-Tyr(tBu)-OH等进行了杂质峰定位，本发明采用了梯度洗脱的方式进行检测，通过优化设置合理的洗脱条件，使这些杂质能够准确定位，与对映异构体Fmoc-D-Tyr(tBu)-OH的分离度符合要求，并且能快速被洗脱出来；不干扰样品中对映异构体的检测，并且不影响同一色谱系统其它批次样品的检测。避免了对映异构体Fmoc-D-Tyr(tBu)-OH与样品中其它杂质不完全分离，与主峰分离度不符合要求而影响峰面积积分，导致检测结果不准确的问题。
3、本发明通过对流动相配比、对照品溶液以及洗脱条件进行综合设计和优化，本发明的分析方法在液相色谱系统运行过程中，基线平稳，空白溶剂和其它杂质基本无干扰本品中对映异构体的检测，杂质分离效果突出，专属性好，试验数据证明，检出限可达到0.0449μg/ml，灵敏度极高，检测结果可为产品研发、生产和提纯提供可靠有效的信息，为建立保护氨基酸质控标准打下了坚实基础，为终产品的质量控制起到了积极作用。
附图说明
图1为实施例1中Fmoc-Tyr(tBu)-OH及对映异构体系统适用性谱图。
图2为对比例中Fmoc-Tyr(tBu)-OH及对映异构体系统适用性谱图。
图3为实施例2中Fmoc-D-Tyr(tBu)-OH的线性趋势图。
具体实施方式
下面结合具体实施例和附图对本发明作进一步详述，以下实施例只是描述性的，不是限定性的，不能以此限定本发明的保护范围，如无特别说明，所用原料均可通过市售或自制获得。
实施例1(反相)(XQRK-SM-6)
醋酸西曲瑞克起始原料Fmoc-Tyr(tBu)-OH对映异构体检测方法，具体包含如下步骤：
(1)色谱条件设置：采用以硅胶表面涂敷有纤维素-三(4-甲基苯甲酸酯)填料为色谱柱，柱长15cm，内径4.6mm，膜厚5μm；柱温为25℃，流速为每分钟1.0ml/min，进样体积10μl，检测波长264nm，以5mmol/L醋酸铵溶液(乙酸调节pH至4.5)为流动相A，乙腈为流动相B，按照下表1进行梯度洗脱。
(2)供试品溶液制备：取本品约10mg，精密称定，置20ml量瓶中，加4ml乙腈溶解，加溶剂稀释至刻度，摇匀，即得；
(3)对照品溶液制备：取Fmoc-D-Tyr(tBu)-OH对照品约10mg，精密称定，置20ml量瓶中，加4ml乙腈溶解，加溶剂稀释至刻度，摇匀；精密量取适量，加溶剂稀释成每1ml含0.03mg的溶液，作为对照品贮备液；精密量取对照品贮备液1ml，置20ml量瓶中，用溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀即得；
(4)灵敏度溶液制备：精密量取对照品溶液2ml，置10ml量瓶中，用稀释剂溶解并稀释至刻度线，摇匀，即得；
(5)系统适用性溶液制备：取本品约10mg，精密称定，置20ml量瓶中，加4ml乙腈溶解，加入对照品贮备液1ml，加溶剂稀释至刻度，摇匀，即得。
(5)检测：精密量取系统适用性溶液，灵敏度溶液、供试品溶液和对照品溶液，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。系统适用性溶液中Fmoc-D-Tyr(tBu)-OH和Fmoc-Tyr(tBu)-OH依次出峰，Fmoc-D-Tyr(tBu)-OH与其相邻峰分离度应符合要求。
(7)供试品溶液色谱图中，如有与Fmoc-D-Tyr(tBu)-OH保留时间一致的色谱峰，按外标法以峰面积计算，不得过0.3％。
表1色谱条件梯度洗脱程序
Figure BDA0004035429630000051
表2 Fmoc-Tyr(tBu)-OH和Fmoc-D-Tyr(tBu)-OH化学结构式
Figure BDA0004035429630000052
表3
化合物名称 Fmoc-D-Tyr(tBu)-OH Fmoc-Tyr(tBu)-OH
出峰时间min 13.195 14.421
峰面积比％ 0.30 99.70
分离度 / 4.1
从图1的色谱图和表3的结果可以得到，对映异构体Fmoc-D-Tyr(tBu)-OH和主成分Fmoc-Tyr(tBu)-OH的分离度为4.1，大于1.5，说明本发明能将Fmoc-Tyr(tBu)-OH及对映异构体Fmoc-D-Tyr(tBu)-OH有效分离。
对比例
专利CN111505161A中采用纤维素-三(3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯)为色谱柱，以三氟乙酸：水＝1:1000为流动相A，柱温25℃，乙腈为流动相B，流动相A：流动相B＝80：20(V/V)进行等度洗脱25min，对Fmoc系列保护氨基酸的对映异构体进行检测。本发明通过重复试验条件发现，该液相条件和样品检测时，主成分和其对映异构体虽然能有效的分开，但是目标峰峰形不够尖锐，且灵敏度不高，不容易判断和识别；见图2为Fmoc-Tyr(tBu)-OH及对映异构体系统适用性谱图。因此无法对起始物料中的对映异构体进行定量分析和准确检测多批次样品中的含量。这样的色谱条件对醋酸西曲瑞克的多个保护氨基酸的对映异构体定量检测不适用，需继续摸索色谱方法。
实施例2
本发明采用外标法计算对映异构体的含量，并且对该方法进行一系列的方法学验证，包括线性，检测限定量限，重复性，准确度，中间精密度，溶液放置稳定性和耐用性试验；结果表明该方法专属性强，准确度高，可以用于检测物料Fmoc-Tyr(tBu)-OH中对映异构体Fmoc-D-Tyr(tBu)-OH的含量。
一、方法学验证：
1、专属性
溶液配制：
1)空白溶剂：同稀释剂，乙腈-水(60:40)。
2)系统适用性溶液：取本品约10mg，精密称定，置20ml量瓶中，精密量取对照品储备液1ml，置同一量瓶中，加乙腈4ml溶解后，加溶剂稀释至刻度，摇匀。
3)杂质混合储备液：分别精密称取杂质对照品H-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-β-Ala-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-β-Ala-OH、酪氨酸、杂质Fmoc-OSu各约5mg，置同一50ml量瓶中，加10ml乙腈溶解后，用溶剂稀释至刻度，摇匀。(约0.1mg/ml)
4)混合溶液：本品约10mg，精密称定，置20ml量瓶中，精密量取杂质混合储备液2ml，加溶剂稀释至刻度，摇匀。(约0.01mg/ml)
表4
Figure BDA0004035429630000071
空白溶剂对本品中对映异构体检测无干扰；另外在该色谱条件下，杂质酪氨酸，Fmoc-Tyr(tBu)-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-β-Ala-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-β-Ala-OH、Fmoc-Osu、H-Tyr(tBu)-OH对本品对映异构体Fmoc-D-Tyr(tBu)-OH测定均无干扰，说明本发明方法专属性较好。
2、线性和范围
线性溶液的配制：分别精密量取对映异构体Fmoc-D-Tyr(tBu)-OH贮备液适量，配制成浓度为0.1497、0.4492、0.7487、1.4975、2.2462μg/ml的一系列线性浓度溶液。分别注入液相色谱仪，记录色谱图。以Fmoc-D-Tyr(tBu)-OH浓度(μg/ml)为横坐标、以峰面积为纵坐标进行线性回归。
表5
Figure BDA0004035429630000072
由表4中结果得出对映异构体Fmoc-D-Tyr(tBu)-OH的浓度与峰面积的线性方程为y＝23.6921x+0.1271，相关系数r＝0.9999，Y轴截距与100％响应值比值绝对值为0.6，均符合试验要求。说明Fmoc-D-Tyr(tBu)-OH在0.1497～2.2462μg/ml范围内线性良好。
3、检测限和定量限
精密量取Fmoc-D-Tyr(tBu)-OH对照品溶液1ml，置10ml量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得定量限溶液(LOQ溶液)；计算LOQ溶液连续进样6次对映异构体Fmoc-D-Tyr(tBu)-OH峰的信噪比(S/N)，及峰面积的RSD。
精密量取定量限溶液3ml，置10ml量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得检测限溶液(LOD溶液)；计算LOD溶液进样1次对映异构体Fmoc-D-Tyr(tBu)-OH峰的信噪比(S/N)。结果见下表6。
表6
Figure BDA0004035429630000081
/>
结果表明Fmoc-D-Tyr(tBu)-OH的6份定量限溶液S/N值均大于10，最小值为49；6份峰面积的RSD为1.0％，符合要求。Fmoc-D-Tyr(tBu)-OH的检测限溶液S/N值为17，大于3，均符合要求，说明本方法灵敏度较好。
4、准确度
供试品溶液制备：精密称取供试品10mg，置20ml量瓶中，用稀释剂溶解并稀释至刻度线，摇匀，即得；
对照品溶液制备：精密称取保护氨基酸对映异构体，用稀释剂溶解并稀释成浓度为0.03mg/ml的溶液，作为对照品贮备液；精密量取对照品贮备液1ml，置10ml量瓶中，用稀释剂溶解并稀释至刻度线，摇匀，即得；
定量限准确度溶液：称取Fmoc-Tyr(tBu)-OH约10mg，置20ml量瓶，加入稀释剂约5ml，超声使溶解，精密加入对照品贮备液0.1ml，后用稀释剂稀释至刻度，摇匀即得；平行配制3份，各进1针。
100％限度准确度溶液：称取Fmoc-Tyr(tBu)-OH约10mg，置20ml量瓶，加入稀释剂约5ml，超声使溶解，精密加入对照品贮备液1.0ml，后用稀释剂稀释至刻度，摇匀即得；平行配制3份，各进1针。
150％限度准确度溶液：称取Fmoc-Tyr(tBu)-OH约10mg，置20ml量瓶，加入稀释剂约5ml，超声使溶解，精密加入对照品贮备液1.5ml，后用稀释剂稀释至刻度，摇匀即得；平行配制3份，各进1针。
根据公式回收率(％)＝(A-B)/C×100％，其中A为测得量，B为本底量，C为加入量来计算；计算结果见下表7。
表7
Figure BDA0004035429630000091
低中高浓度水平的回收率分别为114.3～115.2％和102.8～103.8％以及103.0～103.3％，9份低中高水平回收率的RSD为5.4％。均符合要求，说明本法准确度较好。
5、重复性
称取Fmoc-Tyr(tBu)-OH约10mg，置20ml量瓶，加入稀释剂约5ml，超声使溶解，精密加入对照品贮备液1.0ml，后用稀释剂稀释至刻度，摇匀即得；平行配制6份，各进1针；结果见下表8。
表8
Figure BDA0004035429630000092
6份重复性溶液的含量值RSD为0.5％，符合要求，说明本方法重复性较好。
6、中间精密度
将重复性项下结果作为第一人的实验结果。
同一批样品，由不同试验人员不同天在不同台仪器同法进行测定。按重复性项下方法配制6份中间精密度溶液。
表9
Figure BDA0004035429630000101
表10
Figure BDA0004035429630000102
6份中间精密度溶液测得含量的RSD值为0.3％，12份溶液测得含量的RSD值为1.6％，均小于10％，符合要求。
7、溶液放置稳定性
取对照品溶液，室温条件下放置，分别在0小时、4小时、12小时、17小时测定对映异构体Fmoc-D-Tyr(tBu)-OH峰面积，计算各时间点对照品溶液中对映异构体峰面积相对于0h的变化值，考察溶液稳定性，见表11。
取加标供试品溶液，室温条件下放置，分别在0小时、5小时、11小时、16小时测定对映异构体Fmoc-D-Tyr(tBu)-OH峰面积，计算各时间点加标供试品溶液中对映异构体含量，及相对于0h时含量的变化值，考察溶液稳定性，见表12。
表11
时间(h) 峰面积 变化值(％)
0 35.905 -
4 35.969 0.2
12 35.727 0.5
17 36.040 0.4
表12
时间(h) 峰面积 含量(％) 变化值(％)
0 36.366 0.285 -
5 36.419 0.286 0.4
11 36.319 0.285 0.0
16 36.361 0.285 0.0
由上表格得出，对照品溶液在室温放置4h、12h、17h，与0h峰面积的变化值最大为0.5％，说明对照品溶液在室温下放置17小时稳定。加标供试品溶液在室温放置5h、11h、16h，与0h含量的变化值最大为0.4％，说明加标供试品溶液室温下放置16小时稳定。
8、耐用性试验
当仪器色谱参数发生些微变化，如流动相缓冲盐的pH值、柱温和流速发生变化时，考察空白溶剂是否干扰本品检测，系统适用性溶液中，对映异构体和主峰之间的分离度应不低于1.5；以及改变色谱条件后，加标供试品溶液中对映异构体含量与正常色谱条件变化值应小于10％；结果见下表13。
表13
Figure BDA0004035429630000111
当仪器色谱参数变化后，各色谱条件下，空白溶剂均不干扰对映异构体Fmoc-D-Tyr(tBu)-OH的测定；各色谱条件下，系统适用性溶液分离度在1.5～2.3之间，均符合要求。改变条件后，加标供试品溶液中对映异构体检出量与拟定条件测定结果变化值在0.0％～0.7％之间，均小于10％范围内。说明本方法耐用性较好。

Claims (10)

1.一种多肽保护氨基酸对映异构体的测定方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）样品配制：
供试品溶液制备：精密称取供试品10mg，置20ml量瓶中，用稀释剂溶解并稀释至
刻度线，摇匀，即得；
对照品溶液制备：精密称取保护氨基酸对映异构体，用稀释剂溶解并稀释成浓度为
0.03mg/ml的溶液，作为对照品贮备液；精密量取对照品贮备液1ml，置20ml量瓶中，用稀释剂溶解并稀释至刻度线，摇匀，即得；
灵敏度溶液制备：精密量取对照品溶液2ml，置10ml量瓶中，用稀释剂溶解并稀释至刻度线，摇匀，即得；
系统适用性溶液制备：精密称取供试品10mg，置20ml量瓶中，加入对照品贮备液1ml，用稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀，即得；
（2）色谱条件设置：
色谱柱：硅胶表面涂敷有纤维素-三（4-甲基苯甲酸酯）手性固定相为色谱柱；
流动相：以5mmol/L醋酸铵溶液（乙酸调节pH至4.5）为流动相A，以乙腈为流动相B进行梯度洗脱；
柱温：20~30℃；
流速：0.3~1.0ml/min；
进样体积：1~10µl；
检测波长：260~270nm；
（3）检测和计算：
精密量取系统适用性溶液，灵敏度溶液、对照品溶液和供试品溶液，分别注入液相色谱仪，记录色谱图；通过外标法计算主峰和对映异构体的峰面积。
2.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于，所述稀释剂为乙腈溶液。
3.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于，按照下表进行梯度洗脱：
时间（min） 流动相A(%) 流动相B(%) 0 70 30 25 30 70 30 30 70 30.1 70 30 37 70 30
。
4.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于，所述柱温为25℃。
5.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于，所述流速为1.0ml/min。
6.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于，所述进样体积为10μl。
7.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于，所述波长为264nm。
8.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于，所述灵敏度溶液中，峰高的信噪比大于10。
9.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于，所述保护氨基酸为Fmoc-Tyr(tBu)-OH。
10.利用权利要求1~9任一项所述方法测定醋酸西曲瑞克起始原料药中保护氨基酸的纯度，其特征在于，所述保护氨基酸为Fmoc-Tyr(tBu)-OH，其对应异构体的含量不高于0.3%。
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