CN109444304A - 一种非布司他及其相关杂质的hplc检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及药物分析技术领域，具体涉及非布司他中间体杂质检测方法，所述检测方法采用高效液相色谱法进行测定，具体检测方法如下：配制三氟乙酸溶液(流动相A)、色谱级乙腈(流动相B)、稀释剂、样品液；运用高效液相色谱仪对制备的样品液中非布司他进行检测，条件如下：流速：0.8mL/min～1.2mL/min；柱温：30℃～40℃；进样量：50μL；检测波长：215nm；色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶；色谱柱洗脱程序：在0到8分钟内，流动相A：B为40：60；在8分钟到30分钟，流动相A：B为40：60～30:70；在30分钟到35分钟，流动相A：B为30：70；在35.1分钟到40分钟，流动相A：B为30：70～40：60。本发明提供的检测方法可以有效的分离出非布司他5个中间体杂质和非布司他。

Description

一种非布司他及其相关杂质的HPLC检测方法

技术领域

本发明涉及药物分析技术领域，具体涉及非布司他5个中间体杂质的检测方法。

背景技术

非布司他为新一代非嘌呤类选择性黄嘌呤氧化酶抑制剂,是一种治疗痛风的新药，在治疗高尿酸血症及其引起的痛风方面具有良好的疗效及安全性。根据现有的非布司他经典合成工艺，非布司他经过6步反应，最后重结晶得到成品，在合成的过程中总共有5个中间体产生。因此，为了得到合格的非布司他原料药，在合成原料药的过程中必须严格有效的控制非布司他中间体的残留，避免过多未反应的中间体带入原料药形成杂质。

非布司他API以及制剂需要重点关注对羟基硫代苯甲酰胺、2-(4-羟基苯基)-4-甲基-5-噻唑甲酸乙酯、2-(3-甲酰基-4-羟基苯基)-4-甲基-5-噻唑甲酸乙酯、2-(3-氰基-4-羟基苯基)-4-甲基-5-噻唑甲酸乙酯、2-(3-氰基-4-异丁氧基苯基)-4-甲基-5-噻唑甲酸等相关杂质。若针对非布司他的测试方法可以有效检测上述的5种主要的相关杂质，将有助于非布司他质量的评估和验证。

然而，目前的检测方法，非布司他上述的5个中间体杂质的控制是采用不同的色谱条件进行的，尚未发现有同时能够检测非布司他5个中间体杂质的文献报道。

因此，急需开发一种能够同时有效控制非布司他5个中间体杂质的色谱检测方法，制定出简单、灵敏的检测方法，以便反应中控及为后续能够持续稳定的得到合格的非布司他原料药提供重要依据。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供一种同时有效控制非布司他5个杂质的检测方法，该方法简便，步骤少，测试结果准确，能快速的检测出杂质的含量，方法稳定可靠。

一种非布司他的HPLC检测方法，将待测非布司他溶解得待测溶液；随后采用HPLC对其进行测定；

HPLC测定条件为：

色谱柱：C18反相柱；

流速：0.8mL/min～1.2mL/min；

柱温：30℃～40℃；

检测波长：210～215nm；

流动相A为体积百分比为0.02～0.08％的三氟乙酸水溶液；

流动相B为乙腈；

洗脱程序为：

时间/min	流动相A/体积％	流动相B/体积％
			0	40	60
8	40	60
			30	30	70
35	30	70
			35.1	40	60
40	40	60

本发明中，通过所述的色谱条件可以有效分析非布司他及其相关杂质。本发明所述的测试方法，柱温、流速以及流动相A三氟乙酸浓度对非布司他中间体杂质、非布司他之间的分离度有很大影响，通过进一步研究发现，经过调节适当的三氟乙酸溶液浓度，再通过不同比例的比例组成进行梯度洗脱，可达到非布司他、非布司他中间体杂质之间的准确分离。本发明洗脱梯度为：在0到8分钟内，流动相比例为三氟乙酸溶液比乙腈为60：40，在8分钟到30分钟，三氟乙酸溶液比乙腈为40：60～30：70，在30分钟到35分钟，三氟乙酸溶液比乙腈为30：70，；在35.1分钟到40分钟，然后将洗脱剂比例30：70～40：60，此条件下进行梯度洗脱，非布司他及非布司他5个中间体杂质分离度均大于1.5，符合要求。并且本方法对非布司他杂质的定量限可达到100ppm，具有较高的灵敏度，可以高质量严格控制非布司他5个中间体杂质。

本发明中，待测非布司他中允许含有对羟基硫代苯甲酰胺、2-(4-羟基苯基)-4-甲基-5-噻唑甲酸乙酯、2-(3-甲酰基-4-羟基苯基)-4-甲基-5-噻唑甲酸乙酯、2-(3-氰基-4-羟基苯基)-4-甲基-5-噻唑甲酸乙酯、2-(3-氰基-4-异丁氧基苯基)-4-甲基-5-噻唑甲酸中的至少一种的杂质。

进一步优选，本发明所述的制备方法可以适用于含有对羟基硫代苯甲酰胺、2-(4-羟基苯基)-4-甲基-5-噻唑甲酸乙酯、2-(3-甲酰基-4-羟基苯基)-4-甲基-5-噻唑甲酸乙酯、2-(3-氰基-4-羟基苯基)-4-甲基-5-噻唑甲酸乙酯和2-(3-氰基-4-异丁氧基苯基)-4-甲基-5-噻唑甲酸五种相关杂质的非布司他的测定。相较于现有方法，采用本发明HPLC参数下的方法进行测试，可以实现非布司他5个中间体杂质的合理分离，目标物之间互不干扰，实现一次处理出全部结果，精度高，检测限低。

本发明中，所述的稀释剂为流动相A和乙腈的混合溶液，其中，流动相A和乙腈的体积比为60:40。

所述的待测溶液中，待测非布司他的浓度为0.09～0.11mg/mL；进一步优选为0.1mg/mL。

所述的色谱柱为C18,250*4.6，5um。也即是，本发明方法，特别适用的色谱柱为填充颗粒度为5um，长度为250mm，内径为4.6mm的C18反相柱。

本发明的检测方法中检测波长和进样量对检测结果中非布司他5个中间体杂质的灵敏度有很大影响，通过研究发现，经过二极管阵列扫描，发现非布司他中间体杂质在210～215nm有较大吸收。

作为优选，检测坡长为215nm。优选的进样量为40～60μL。

研究发现，在215nm的检测波长下杂质有最大吸收波长，且进样量为50μL，在该条件下，杂质的检测限能够达到20ppm。

所述流动相A的配制：量取1000ml纯化水加0.2～0.8ml三氟乙酸，混匀，超声脱气，即得。

研究发现，通过设置流动相A三氟乙酸溶液的浓度和不同比例的流动相，可实现非布司他和非布司他5个中间体杂质之间的准确分离。

作为优选，所述的流动相A为体积百分比为0.06％的三氟乙酸水溶液。

所述流动相B的配制：色谱级乙腈，超声脱气，即得。

本发明一种优选的非布司他及其所述5个中间体杂质的检测方法，具体检测步骤为：

1)三氟乙酸溶液的配制：量取1000ml纯化水加0.2～0.8ml三氟乙酸，混匀，待用；

2)稀释剂的配制：将步骤1)所得三氟乙酸溶液与乙腈按体积比60：40混合后得到稀释剂，待用；

3)流动相A的配制：三氟乙酸溶液；

4)流动相B的配制：乙腈；

5)样品液的制备：称取非布司他样品，加稀释剂配制成浓度为每毫升含0.1mg的非布司他中间体样品液，待用；

6)检测：运用高效液相色谱仪对步骤5)制备的样品液中非布司他进行检测，工作条件如下：

流速：0.8mL/min～1.2ml/min；

柱温：30℃～40℃；

进样量：50μL；

检测波长：215nm

色谱柱：C18，250*4.6mm，5um；

色谱柱洗脱程序：

时间/min	流动相A/体积％	乙腈
			0	40	60
8	40	60
			30	30	70
35	30	70
			35.1	40	60
40	40	60

本发明的有益效果

本发明提供一种非布司他5个中间体杂质的检测方法，可以有效的分离非布司他和非布司他5个中间体杂质，该方法极大的提高了杂质检测方法的稳定性，从而可以简单、快速、稳定的检测非布司他5个中间体杂质，从而有效的保证非布司他的质量稳定性。该方法简便，步骤少，测试结果准确，能快速的检测出杂质的含量，方法稳定可靠；信噪比大于30，杂质信号不易被干扰，灵敏度较高；可以检测到含量在100ppm的非布司他中间体杂质，说明本发明的技术方案可以有效、灵敏的检测非布司他5个中间体杂质。

通过高效液相色谱法检测非布司他5个中间体杂质，采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，这种色谱柱在液相色谱中较为常用，加入适当比例的乙腈，可以保护色谱柱的稳定性和使用寿命，提高了色谱柱的耐用性。

所测化合物线性范围为30～300ng/mL，相关系数R²≥0.999，检出限为10ng/mL，RSD≤2.1％。方法简便、快速、准确，稳定可靠，各项技术指标均满足检测需要。

本发明提供的操作方法简单，可操作性强，精密度高，重现性好，有效保证数据的准确性，成本低，适合工业应用。

附图说明

图1是优选实施例1检测得到的高效液相色谱图。

具体实施方式

为使本领域技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步描述。

以下实施例中高效液相的流动相中乙腈为色谱纯乙腈。实施例中无特殊说明，实施例中的温度为设定温度，允许温度误差为±3℃。

本检测方法为药物分析领域的外标法，以下实验过程和试验方法中的操作方式，没有进行详细说明的，均采用标准操作流程，例如溶液配制，系统适用性试验的操作方法。

实施例1：非布司他5个中间体杂质的检测方法

1)色谱条件

仪器：Waters e2695+2489高效液相色谱仪；

色谱柱：C18,250*4.6mm，5um；

柱温：30℃；

流动相的流速：1.0mL/min；

检测波长：215nm。

三氟乙酸溶液：量取1000ml纯化水加0.4ml三氟乙酸，混匀，即得；

流动相A：三氟乙酸溶液

流动相B：乙腈

稀释剂：三氟乙酸溶液--乙腈(体积比60：40)

按照下表1进行梯度洗脱；

表1：梯度洗脱程序的条件

时间(min)	流动相A(v％)	流动相B(v％)
			0	40	60
8	40	60
			30	30	70
35	30	70
			35.1	40	60
40	40	60

2)样品配制

样品溶液配制：称取非布司他，加稀释剂超声使溶解，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得。非布司他浓度为每1ml含0.1mg非布司他样品溶液。

3)检测方法

精密量取供试品溶液50μL，注入高效液相色谱仪中，色谱图如图1所示。

4)计算

按照面积归一法，以样品色谱图中各色谱峰峰面积百分比计，计算样品溶液中杂质含量。

5)实验结果

非布司他5个中间体杂质具体名称如表2所示

表2：杂质信息表

杂质名称	CAS号	化学名
			中间体I杂质	25984-63-8	对羟基硫代苯甲酰胺
中间体II杂质	161797-99-5	2-(4-羟基苯基)-4-甲基-5-噻唑甲酸乙酯
			中间体III杂质	161798-01-2	2-(3-甲酰基-4-羟基苯基)-4-甲基-5-噻唑甲酸乙酯
中间体IV杂质	161798-02-3	2-(3-氰基-4-羟基苯基)-4-甲基-5-噻唑甲酸乙酯
			中间体V杂质	160844-75-7	2-(3-氰基-4-异丁氧基苯基)-4-甲基-5-噻唑甲酸

根据非布司他中有关物质现状的比较分析，可以确定非布司他5个中间体杂质及非布司他洗脱时间如表2所示。

表2：HPLC色谱图保留时间表

杂质名称	保留时间\min
		中间体I杂质	3.862
中间体II杂质	16.135
		中间体III杂质	23.562
中间体IV杂质	18.615
		中间体V杂质	33.689
非布司他	20.670

色谱图结果：

按照上述色谱条件得到，杂质的色谱峰具有如图1所示的色谱图。

分析结果：

对图1色谱图中的杂质峰进行分析，结果见表3。

表3：实施例1HPLC色谱图中杂质的分析结果

从表3可以看出，在该色谱系统中非布司他中间体杂质及非布司之间保留时间差别明显，可以有效分离，符合要求。该色谱条件下信噪比大于40，杂质信号不易被干扰，灵敏度较高；说明本发明的技术方案可以有效、灵敏的检测非布司他5个中间体杂质。

实施例2：非布司他5个中间体杂质的检测方法

具体参照实施例1的检测方法进行，与实施例1不同之处在于：

1)流动相的流速1.2mL/min。

2)杂质确认：非布司他5个中间体具体杂质名称如表2所示

3)实验结果：

根据非布司他5个中间体杂质定位分析，可以确定非布司他5个中间体杂质及非布司他，具体如实施例1中的表2所示。

对色谱图中5个中间体杂质和非布司他主峰进行分析，结果见表4，检测结果表明非布司他5个中间体杂质和非布司他分离良好。

表4：实施例2HPLC色谱图中杂质的分析结果

从表4可以看出，在该色谱系统中非布司他中间体杂质及非布司之间保留时间差别明显，可以有效分离，符合要求。该色谱条件下信噪比大于40，杂质信号不易被干扰，灵敏度较高；说明本发明的技术方案可以有效、灵敏的检测非布司他5个中间体杂质。

实施例3：非布司他5个中间体杂质的检测方法

参照实施例1的检测方法进行，与实施例1不同之处在于：

1)流动相：

三氟乙酸溶液：量取1000ml纯化水加0.2ml三氟乙酸，混匀，即得。

流动相A：三氟乙酸溶液

流动相B：乙腈

稀释剂：三氟乙酸溶液-乙腈(60：40)

2)杂质确认：非布司他5个中间体具体杂质名称如表2所示

3)实验结果

根据非布司他5个中间体杂质定位分析，可以确定非布司他5个中间体杂质及非布司他，具体如实施例1中的表2所示。

对色谱图中的杂质峰和主峰进行分析，结果见表5，检测结果表明非布司他5个中间体杂质及非布司他分离良好。

表5：实施例3HPLC色谱图中杂质的分析结果

从表5可以看出，在该色谱系统中非布司他中间体杂质及非布司之间保留时间差别明显，可以有效分离，符合要求。该色谱条件下信噪比大于40，杂质信号不易被干扰，灵敏度较高；说明本发明的技术方案可以有效、灵敏的检测非布司他5个中间体杂质。

实施例4：非布司他5个中间体杂质的检测方法

参照实施例1的检测方法进行，与实施例1不同之处在于：

1)流动相：

三氟乙酸溶液：量取1000ml纯化水加0.8ml三氟乙酸，混匀，即得。

流动相A：三氟乙酸溶液

流动相B：乙腈

稀释剂：三氟乙酸溶液-乙腈(60：40)

2)杂质确认：非布司他5个中间体具体杂质名称如表2所示

3)实验结果

根据非布司他5个中间体杂质定位分析，可以确定非布司他5个中间体杂质及非布司他，具体如实施例1中的表2所示。

对色谱图中的杂质峰和主峰进行分析，结果见表6，检测结果表明非布司他中间体及非布司他分离良好。

表6：实施例4HPLC色谱图中杂质的分析结果

从表6可以看出，在该色谱系统中非布司他中间体杂质及非布司之间保留时间差别明显，可以有效分离，符合要求。该色谱条件下信噪比大于40，杂质信号不易被干扰，灵敏度较高；说明本发明的技术方案可以有效、灵敏的检测非布司他5个中间体杂质。

实施例5：非布司他5个中间体杂质的检测方法

参照实施例1的检测方法进行检测，与实施例1不同之处在于：

柱温为35℃

实验结果

根据非布司他5个中间体杂质定位分析，可以确定非布司他5个中间体杂质及非布司他，具体如实施例1中的表2所示。

分析结果：

对色谱图中的杂质峰和主峰进行分析，结果见表7，检测结果表明非布司他中间体及非布司他分离良好。

表7：实施例4HPLC色谱图中杂质的分析结果

从表7可以看出，在该色谱系统中非布司他中间体杂质及非布司之间保留时间差别明显，可以有效分离，符合要求。该色谱条件下信噪比大于40，杂质信号不易被干扰，灵敏度较高；说明本发明的技术方案可以有效、灵敏的检测非布司他5个中间体杂质。

通过实施例1～5的检测方法发现，不同流速、柱温以及三氟乙酸(pH)的用量对5非布司他中间体杂质和非布司他之间的分离度有较大影响，通过进一步研究发现，经过调节适当的三氟乙酸溶液浓度，再通过不同的比例组成进行梯度洗脱，可达到非布司他5个中间体杂质和非布司他之间的准确分离，最后确认三氟乙酸浓度为0.06％，洗脱梯度为：在0到8分钟内，流动相比例为三氟乙酸溶液比乙腈为60：40，在8分钟到30分钟，三氟乙酸溶液比乙腈为40：60～30：70，在30分钟到35分钟，三氟乙酸溶液比乙腈为30：70；在35.1分钟到40分钟，然后将洗脱剂比例30：70～40：60，此条件下进行梯度洗脱，非布司他中间体杂质及非布司他之间的分离度均大于1.5，符合要求。并且本方法对非布司他中间体杂质的定量限可达到100ppm，具有较高的灵敏度，可以高质量严格控制非布司他中5个中间体杂质。

方法学考察：

按照本领域常规试验方式对该检测方法进行方法学考察，主要考察该检测方法的检测限、确定对非布司他中间体杂质的含量测定线性区间、制备杂质定量标准曲线，检验方法的重复性和溶液稳定性。

检测线考察：称取非布司他中间体I、II、III、IV、V杂质适量，分别用稀释剂溶解并稀释成适当浓度，取溶液检测，根据检测图谱中各峰信噪比，再对溶液进行稀释，当信噪比为3时具有检测限，信噪比为10时具有定量限。

线性考察：称取非布司他中间体I、II、III、IV、V杂质适量，分别溶解并稀释成0.01μg/mL～0.15μg/mL的6个不同溶液，按照色谱条件各个溶液进样3针，记录色谱图。

重复性考察：称取非布司他中间体I、II、III、IV、V杂质和非布司他适量，配制成含非布司他0.1mg/mL的溶液，同法配制6份，按照色谱条件各个溶液进样1针，记录色谱图。

溶液稳定性考察：取重复性溶液分别在0、2、4、8、12、18、24小时，按照色谱条件进样，记录色谱图。

具体结果见下表9。

表9：方法学考察结果

由上述表9可知，本发明实施例1～5的检测方法，可以用于控制非布司他5个中间体杂质。

对于非布司他中间体I杂质检测限为10ng/mL；定量限为10ng/mL；重复性RSD为2.2％≦3％，符合要求，重复性良好；溶液在24小时内稳定。

对于非布司他中间体II杂质检测限为10ng/mL；定量限为10ng/mL，；重复性RSD为2.0％≦3％，符合要求，重复性良好；溶液在24小时内稳定。

对于非布司他中间体III杂质检测限为10ng/mL；定量限为10ng/mL；重复性RSD为1.9％≦3％，符合要求，重复性良好；溶液在24小时内稳定。

对于非布司他中间体IV杂质检测限为10ng/mL；定量限为10ng/mL；重复性RSD为2.2％≦3％，符合要求，重复性良好；溶液在24小时内稳定。

对于非布司他中间体V杂质检测限为10ng/mL；定量限为10ng/mL；重复性RSD为2.1％≦3％，符合要求，重复性良好；溶液在24小时内稳定。

本发明提供的非布司他中间体杂质检测方法，可以有效的分离非布司他中间体杂质与非布司他主成分峰，该方法极大的提高了非布司他中间体杂质的检测灵敏度，从而可以简单、快速、稳定的检测非布司他中间体杂质，更有效的控制非布司他的质量，避免了未检出可能带来的工艺风险。该方法对非布司他中间体I、II、III、IV、V杂质检测限均为20ng/mL，相当于20ppm；定量限均为10ng/mL，相当于100ppm；重复性RSD均小于等于3％，符合要求，重复性良好；溶液在24小时内稳定，适于应用于原料药质量控制。

可以理解的是，以上实施方式仅仅是为了说明本发明的原理而采用的示例性实施方式，然而本发明并不局限于此。对于本领域内的普通技术人员而言，在不脱离本发明的精神和实质的情况下，可以做出各种变型和改进，这些变型和改进也视为被包含在本发明的保护范围内。

Claims (10)

1.一种非布司他的HPLC检测方法，其特征在于，将待测非布司他溶解得待测溶液；随后采用HPLC对其进行测定；

HPLC测定条件为：

色谱柱：C18反相柱；

流速：0.8mL/min～1.2mL/min；

柱温：30℃～40℃；

检测波长：210～215nm；

流动相A为体积百分比为0.02～0.08％的三氟乙酸水溶液；

流动相B为乙腈；

洗脱程序为：

时间/min 流动相A/体积％ 流动相B/体积％ 0 40 60 8 40 60 30 30 70 35 30 70 35.1 40 60 40 40 60

2.如权利要求1所述的非布司他的HPLC检测方法，其特征在于，待测非布司他中允许含有对羟基硫代苯甲酰胺、2-(4-羟基苯基)-4-甲基-5-噻唑甲酸乙酯、2-(3-甲酰基-4-羟基苯基)-4-甲基-5-噻唑甲酸乙酯、2-(3-氰基-4-羟基苯基)-4-甲基-5-噻唑甲酸乙酯、2-(3-氰基-4-异丁氧基苯基)-4-甲基-5-噻唑甲酸中的至少一种的杂质。

3.如权利要求2所述的非布司他的HPLC检测方法，其特征在于，所述的待测非布司他中含有对羟基硫代苯甲酰胺、2-(4-羟基苯基)-4-甲基-5-噻唑甲酸乙酯、2-(3-甲酰基-4-羟基苯基)-4-甲基-5-噻唑甲酸乙酯、2-(3-氰基-4-羟基苯基)-4-甲基-5-噻唑甲酸乙酯和2-(3-氰基-4-异丁氧基苯基)-4-甲基-5-噻唑甲酸杂质。

4.如权利要求1所述的非布司他的HPLC检测方法，其特征在于，所述的稀释剂为流动相A和乙腈的混合溶液，其中，流动相A和乙腈的体积比为60:40。

5.如权利要求1所述的非布司他的HPLC检测方法，其特征在于，所述的待测溶液中，待测非布司他的浓度为0.09～0.11g/mL。

6.如权利要求5所述的非布司他的HPLC检测方法，其特征在于，进样量为40～60μL。

7.如权利要求1所述的非布司他的HPLC检测方法，其特征在于，所述的色谱柱为C18，250*4.6mm，5um。

8.如权利要求1所述的非布司他的HPLC检测方法，其特征在于，所述的流动相A为体积百分比为0.06％的三氟乙酸水溶液。

9.如权利要求1所述的非布司他的HPLC检测方法，其特征在于，所述的检测坡长为215nm。

10.如权利要求1所述的非布司他的HPLC检测方法，其特征在于，具体检测步骤为：

1)三氟乙酸溶液的配制：量取1000ml纯化水加0.2～0.8ml三氟乙酸，混匀，待用；

2)稀释剂的配制：将步骤1)所得三氟乙酸溶液与乙腈按体积比60：40混合后得到稀释剂，待用；

3)流动相A的配制：将步骤1)所得三氟乙酸溶液超声脱气，即得，待用；

4)流动相B的配制：色谱级乙腈，超声脱气，待用；

5)样品液的制备：称取非布司他样品，加稀释超声使溶解，用稀释剂配制成浓度为0.1mg/mL的非布司他样品溶液，待用；

6)检测：运用高效液相色谱仪对步骤5)制备的样品液进行检测，工作条件如下：

步骤6)色谱条件中流动相A和流动相B的初始体积比为50：50～65：35

流速：0.8mL/min～1.2mL/min；

柱温：30℃～40℃；

进样量：50μL；

检测波长：215nm；

色谱柱：C18，250*4.6mm，5um；

色谱柱洗脱具体程序：

时间/min 流动相A/v％ 流动相B/v％ 0 40 60 8 40 60 30 30 70 35 30 70 35.1 40 60 40 40 60

。