CN115541730A - 一种保护氨基酸对映异构体的测定方法 - Google Patents

一种保护氨基酸对映异构体的测定方法 Download PDF

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CN115541730A CN202210755838.6A CN202210755838A CN115541730A CN 115541730 A CN115541730 A CN 115541730A CN 202210755838 A CN202210755838 A CN 202210755838A CN 115541730 A CN115541730 A CN 115541730A
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Abstract

本发明涉及一种保护氨基酸对映异构体的测定方法。与现有技术相比，本发明通用性较强，色谱方法比较稳定，灵敏度较高，耐用性较好，且对起始物料中两种保护氨基酸的对映异构体检测皆适用；使用的溶剂正己烷，无水乙醇和三氟乙酸均为常用试剂，容易获得。不同试验室进行该色谱条件分析方法转移，均满足要求。

Description

一种保护氨基酸对映异构体的测定方法
技术领域
本发明涉及药物分析技术领域，具体涉及一种保护氨基酸对映异构体的测定方法。
背景技术
醋酸西曲瑞克，又常称为西曲瑞克，是一种有效的黄体酮释放激素抑制素受体拮抗剂，它能控制卵巢的刺激作用，预防不成熟卵泡过早排出，帮助受孕；西曲瑞克单剂量方案可减少注射次数，更方便使用。目前国内注射用醋酸西曲瑞克仅有原研药品在售，竞争格局良好，是辅助生殖相关指南推荐用药，临床前景较好。醋酸西曲瑞克一种合成的十肽，其化学名称为：N-乙酰-3-(2-萘)-D-丙氨酰-p-氯-D-苯丙氨酰-3-(3-吡啶基)-D-丙氨酰-L-丝氨酰-L-酪氨酰-N5-氨甲酰-D-鸟氨酰-L-亮氨酰-L-精氨酰-L-脯氨酰-D-丙氨酰胺醋酸盐。
其结构式为：
Figure BDA0003719534160000011
可以看出，醋酸西曲瑞克肽链中含有多个手性中心，而这些手性中心是由合成醋酸西曲瑞克的多个氨基酸起始原料引进的。这些氨基酸起始原料中均存在对映异构体杂质风险，若对起始原料的手性杂质不加以控制，会引入到终产品中，导致终产品精制困难，难以达到质控标准，生产成本增加。
因此，开发出能有效检出氨基酸对映异构体的分析方法，对醋酸西曲瑞克的生产和提纯具有重要的指导意义，并建立严格的质控标准，从而对降低终产品提纯难度、提高产品质量有积极意义。
目前对于多肽保护氨基酸对映体的测定分析方法文献较少，专利CN111505161A公开了一种保护氨基酸对映异构体检测方法，是采用反相色谱方法对Fmoc保护氨基酸的对映体进行测定，使用的色谱柱为纤维素-三(3，5-二甲基苯基氨基甲酸酯)色谱柱，流动相为0.1％三氟乙酸水溶液-乙腈体系。申请人尝试用该方法检测醋酸西曲瑞克的多个氨基酸起始原料，发现并不适用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种保护氨基酸对映异构体的测定方法，该色谱条件对醋酸西曲瑞克的两种保护氨基酸起始物料的对映异构体检测皆适用。能够实现主峰与对映异构体的有效分离，分离效果突出，专属性好。
实现上述发明目的的技术方案是：
本发明提供一种保护氨基酸对映异构体的测定方法，包括以下步骤：
(1)样品配制：
供试品溶液制备：精密称取供试品10mg，置20ml量瓶中，用稀释剂溶解并稀释至刻度线，摇匀，即得；
对照品溶液制备：精密称取保护氨基酸对映异构体，用稀释剂溶解并稀释成浓度为0.03mg/ml的溶液，作为对照品贮备液；精密量取对照品贮备液1ml，置20ml量瓶中，用稀释剂溶解并稀释至刻度线，摇匀，即得；
灵敏度溶液制备：精密量取对照品溶液3ml，置10ml量瓶中，用稀释剂溶解并稀释至刻度线，摇匀，即得；
系统适用性溶液制备：精密称取供试品10mg，置20ml量瓶中，加入对照品贮备液1ml，溶解并稀释至刻度，摇匀，即得；
(2)色谱条件设置：
色谱柱：多糖衍生物类手性色谱柱；
流动相：以无水乙醇-正己烷-三氟乙酸(60:40:0.1)为流动相A，正己烷为流动相B进行梯度洗脱；
柱温：30～40℃；
流速：0.3～1.0ml/min；
进样体积：5～20μl；
检测波长：260～270nm；
(3)检测和计算：
精密量取系统适用性溶液，灵敏度溶液、对照品溶液和供试品溶液，分别注入液相色谱仪，记录色谱图；通过外标法计算主峰和对映异构体的峰面积。
根据本发明实施方案，所述稀释剂为无水乙醇、正己烷、三氟乙酸的混合溶液，其中无水乙醇、正己烷、三氟乙酸的体积比为60:40:0.1。
根据本发明实施方案，按照下表进行梯度洗脱：
Figure BDA0003719534160000031
根据本发明实施方案，柱温为30～40℃；例如：30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃，优选为40℃。
根据本发明实施方案，流速为0.3～1.0ml/min；例如：0.3ml/min、0.4ml/min、0.5ml/min、0.6ml/min、0.7ml/min、0.8ml/min、0.9ml/min、1.0ml/min，优选为1.0ml/min。
根据本发明实施方案，进样体积为1～10μl；例如：1μl、3μl、5μl、7μl、9μl、10μl；优选为5μl。
根据本发明实施方案，检测波长为260～270nm；例如：260nm、261nm、262nm、263nm、264nm、265nm、266nm、267nm、268nm、269nm、270nm；优选为264nm。
根据本发明实施方案，所述灵敏度溶液中，峰高的信噪比大于10。
根据本发明实施方案，所述保护氨基酸选自Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Pro-OH中的一种。
本发明还提供一种保护氨基酸对映异构体的测定方法用于测定醋酸西曲瑞克起始原料药中保护氨基酸的含量，所述保护氨基酸选自Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Pro-OH中的一种，其对映异构体的含量不高于0.3％。
本发明的有益效果是：
1、本发明采用的流动相是正己烷，无水乙醇，正己烷为惰性试剂，很少与样品会发生反应；选择无水乙醇作为极性试剂，洗脱能力较好，且色谱系统压力较小。同时流动相系统中使用三氟乙酸酸性添加剂尽量控制在0.2％以下，从而避免了因为长期使用酸性流动相而造成手性色谱柱和仪器被腐蚀的问题。
2、本发明对醋酸西曲瑞克起始物料一种保护氨基酸Fmoc-Ser(tBu)-OH中可能的降解杂质和工艺杂质，如Fmoc-β-Ala-Ser(tBu)-OH，Fmoc-Ser(tBu)-Ser(tBu)-OH，Fmoc-Osu和Fmoc-β-Ala-OH等进行了杂质峰定位，本发明采用了梯度洗脱的方式进行检测，通过优化设置合理的梯度洗脱条件，使这些杂质能够准确定位，与对映异构体Fmoc-D-Ser(tBu)-OH的分离度符合要求，并且能快速被洗脱出来；不干扰样品中对映异构体的检测，并且不影响同一色谱系统其它批次样品的检测。避免了对映异构体Fmoc-D-Ser(tBu)-OH与样品中其它杂质不完全分离，与主峰分离度不符合要求而影响峰面积积分，导致检测结果不准确的问题。
3、本发明通过对流动相配比、对照品溶液以及梯度洗脱条件进行综合设计和优化，本发明的分析方法在液相色谱系统运行过程中，基线平稳，空白溶剂和其它杂质基本无干扰本品中对映异构体的检测，杂质分离效果突出，专属性好，试验数据证明，检出限可达到0.027％，灵敏度极高，检测结果可为产品研发、生产和提纯提供可靠有效的信息，为建立保护氨基酸质控标准打下了坚实基础，为终产品的质量控制起到了积极作用。
附图说明
图1为实施例1中Fmoc-Ser(tBu)-OH及对映异构体系统适用性谱图。
图2为实施例2中Fmoc-Pro-OH及对映异构体系统适用性谱图。
图3为对比例中Fmoc-Pro-OH及对映异构体系统适用性谱图。
图4为实施例3中对映异构体Fmoc-D-Ser(tBu)-OH的线性趋势图。
具体实施方式
下面结合具体实施例和附图对本发明作进一步详述，以下实施例只是描述性的，不是限定性的，不能以此限定本发明的保护范围，如无特别说明，所用原料均可通过市售或自制获得。
实施例1(正相)(XQRK-SM-7)
醋酸西曲瑞克起始原料Fmoc-Ser(tBu)-OH对映异构体检测方法，具体包含如下步骤：
(1)色谱条件设置：采用多糖衍生物类手性色谱柱(推荐色谱柱Cellulose-SZ)，柱长25cm，内径4.6mm，膜厚5μm；柱温为40℃，以无水乙醇-正己烷-三氟乙酸(60:40:0.1)为流动相A，正己烷为流动相B，按下表1进行梯度洗脱；流速为每分钟1.0ml；检测波长为264nm，进样体积5μl。
(2)供试品溶液制备：取本品适量，精密称定，加溶剂无水乙醇-正己烷-三氟乙酸(60:40:0.1)溶解并定量稀释制成每1ml中约含0.5mg的溶液；
(3)对照品溶液制备：取对映异构体Fmoc-D-Ser(tBu)-OH对照品适量，精密称定，加溶剂溶解并定量稀释成每1ml含0.03mg的溶液，作为对照品贮备液；精密量取对照品贮备液1ml，置20ml量瓶中，用溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀，即得；
(4)灵敏度溶液制备：精密量取对照品溶液3ml，置10ml量瓶中，用溶剂稀释至刻度，摇匀，即得；
(5)系统适用性溶液制备：取本品约10mg，精密称定，置20ml量瓶中，精密量取对照品储备液0.3ml，用溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀；
(6)检测：精密量取系统适用性溶液，灵敏度溶液、对照品溶液、和供试品溶液，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。系统适用性溶液中Fmoc-Ser(tBu)-OH和Fmoc-D-Ser(tBu)-OH依次出峰，分离度应符合要求；灵敏度溶液中，Fmoc-D-Ser(tBu)-OH峰高的信噪比应大于10。
(7)供试品溶液色谱图中，如有与Fmoc-D-Ser(tBu)-OH保留时间一致的色谱峰，按外标法以峰面积计算，不得过0.3％。小于灵敏度溶液Fmoc-D-Ser(tBu)-OH色谱峰峰面积0.3倍(0.027％)的峰忽略不计。
表1梯度洗脱程序
Figure BDA0003719534160000051
表2Fmoc-Ser(tBu)-OH和Fmoc-D-Ser(tBu)-OH化学结构式
Figure BDA0003719534160000052
Fmoc-Ser(tBu)-OH及对映异构体Fmoc-D-Ser(tBu)-OH系统适用性检测结果如表3，对应附图1。
表3
Figure BDA0003719534160000053
Figure BDA0003719534160000061
从图1的色谱图和表3的结果可以得到，对映异构体Fmoc-D-Ser(tBu)-OH和主成分Fmoc-Ser(tBu)-OH的分离度为4.1，大于1.5，说明本发明能将Fmoc-Ser(tBu)-OH及对映异构体Fmoc-D-Ser(tBu)-OH有效分离。
实施例2(正相)(XQRK-SM-2)
醋酸西曲瑞克起始原料Fmoc-Pro-OH对映异构体检测方法，具体包含如下步骤：
(1)色谱条件设置：采用多糖衍生物类手性色谱柱(推荐色谱柱Cellulose-SZ)，柱长25cm，内径4.6mm，膜厚5μm；柱温为40℃，以无水乙醇-正己烷-三氟乙酸(60:40:0.1)为流动相A，正己烷为流动相B，按下表3进行梯度洗脱；流速为每分钟1.0ml；检测波长为264nm，进样体积5μl；
(2)供试品溶液制备：取本品约10mg，精密称定，置20ml量瓶中，加溶剂无水乙醇-正己烷-三氟乙酸(60:40:0.1)溶解并稀释至刻度，摇匀，即得；
(3)对照品溶液制备：取对映异构体Fmoc-D-Pro-OH对照品适量，精密称定，加溶剂溶解并稀释成每1ml含0.03mg的溶液，作为对照品贮备液；精密量取对照品贮备液1ml，置20ml量瓶中，用溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀，即得；
(4)灵敏度溶液制备：精密量取对照品溶液3ml，置10ml量瓶中，用溶剂稀释至刻度，摇匀，即得；
(5)系统适用性溶液制备：取本品约10mg，精密称定，置20ml量瓶中，加入对照品贮备液1ml，溶解并稀释至刻度，摇匀，即得；
(6)检测：精密量取系统适用性溶液，灵敏度溶液、对照品溶液和供试品溶液，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。系统适用性溶液中Fmoc-Pro-OH和Fmoc-D-Pro-OH依次出峰，对映异构体Fmoc-D-Pro-OH与其相邻峰分离度应符合要求；灵敏度溶液中，峰高的信噪比应大于10。
(7)供试品溶液色谱图中，如有与Fmoc-D-Pro-OH保留时间一致的色谱峰，按外标法以峰面积计算，不得过0.3％。小于灵敏度溶液主峰面积0.3倍(0.027％)的峰忽略不计。
表4梯度洗脱程序
Figure BDA0003719534160000062
Figure BDA0003719534160000071
表5Fmoc-Pro-OH和Fmoc-D-Pro-OH化学结构式
Figure BDA0003719534160000072
Fmoc-Pro-OH及对映异构体Fmoc-D-Pro-OH系统适用性检测结果如表6，对应附图2。
表6
化合物名称 Fmoc-Pro-OH Fmoc-D-Pro-OH
出峰时间min 6.274 8.831
峰面积比％ 99.67 0.33
分离度 / 10.9
从图2的色谱图和表6的结果可以得到，对映异构体Fmoc-D-Pro-OH和主成分Fmoc-Pro-OH的分离度为10.9，大于1.5，说明本发明能将Fmoc-Pro-OH及对映异构体Fmoc-D-Pro-OH有效分离。
对比例
专利CN111505161A中采用纤维素-三(3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯)为色谱柱，以三氟乙酸：水＝1:1000为流动相A，柱温25℃，乙腈为流动相B，流动相A：流动相B＝80：20(V/V)进行等度洗脱25min，对Fmoc系列保护氨基酸的对映异构体进行检测。本发明通过重复试验条件发现，该液相条件和样品检测时，本发明中Fmoc基团保护氨基酸在上述条件下，目标峰拖尾现象比较严重，见图3为Fmoc-Pro-OH及对映异构体Fmoc-D-Pro-OH混合溶液色谱图。因此无法对起始物料中的对映异构体进行定量分析和准确检测多批次样品中的含量。这样的色谱柱和流动相对醋酸西曲瑞克的多个保护氨基酸的对映异构体检测不适用，通用性不强。
实施例3
本发明采用外标法计算Fmoc-Ser(tBu)-OH中对映异构体Fmoc-D-Ser(tBu)-OH的含量，并且对该方法进行一系列的方法学验证，包括线性，检测限定量限，重复性，准确度，中间精密度，溶液放置稳定性和耐用性试验；结果表明该方法专属性强，准确度高，可以用于检测物料Fmoc-Ser(tBu)-OH中对映异构体Fmoc-D-Ser(tBu)-OH的含量。
一、方法学验证：
1、专属性
溶液配制：
1)空白溶剂：稀释剂。
2)Fmoc-D-Ser(tBu)-OH对照品贮备液：取Fmoc-D-Ser(tBu)-OH对照品约3mg，置100ml量瓶中，用稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀。
3)Fmoc-Ser(tBu)-Ser(tBu)-OH定位溶液：取Fmoc-Ser(tBu)-Ser(tBu)-OH杂质对照品约2mg，置10ml量瓶中，用稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀。
4)Fmoc-β-Ala-Ser(tBu)-OH定位溶液：取Fmoc-β-Ala-Ser(tBu)-OH杂质对照品约2mg，置10ml量瓶中，用稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀。
5)Fmoc-β-Ala-OH定位溶液：取Fmoc-β-Ala-OH杂质对照品约2mg，置10ml量瓶中，加稀释剂约3ml，超声1min后振摇使其溶解，用稀释剂稀释至刻度，摇匀即得。
6)Fmoc-Osu定位溶液：取Fmoc-Osu杂质约2mg，置10ml量瓶中，加稀释剂约3ml，超声1min后振摇使其溶解，用稀释剂稀释至刻度，摇匀即得。
7)Fmoc-Ser(tBu)-OH定位溶液：取Fmoc-Ser(tBu)-OH约10mg，置20ml量瓶中，加稀释剂约5ml，超声5min后使其溶解，用稀释剂稀释至刻度，摇匀即得。
9)混合溶液：
称取Fmoc-Ser(tBu)-OH约10mg，置20ml量瓶，加稀释剂约5ml振摇使其溶解后，精密加入对映异构体Fmoc-D-Ser(tBu)-OH对照品贮备液1.0ml，以及上述其余5个杂质峰定位溶液各0.5ml。用稀释剂稀释至刻度，摇匀即得。混合溶液中各个成分之间的分离度结果见下表7。
表7
Figure BDA0003719534160000081
Figure BDA0003719534160000091
空白溶剂对本品中对映异构体检测无干扰；其它杂质Fmoc-β-Ala-Ser(tBu)-OH，Fmoc-β-Ala-OH，Fmoc-Ser(tBu)-Ser(tBu)-OH和Fmoc-Osu，对本品对映异构体Fmoc-D-Ser(tBu)-OH的检测均无干扰，本发明方法专属性较好。
2、线性和范围
线性溶液的配制：分别精密量取对映异构体Fmoc-D-Ser(tBu)-OH贮备液适量，配制成浓度为0.4515、0.7524、1.5049、2.2573、3.0097μg/ml的一系列线性浓度溶液。分别注入液相色谱仪，记录色谱图。以Fmoc-D-Ser(tBu)-OH浓度(μg/ml)为横坐标、以峰面积为纵坐标进行线性回归。
表8
Figure BDA0003719534160000092
由表8中结果得出对映异构体Fmoc-D-Ser(tBu)-OH的浓度与峰面积的线性方程为y＝0.2737x-0.0097，相关系数r＝0.9997，Y轴截距与100％响应值比值绝对值为2.4，均符合试验要求。说明Fmoc-D-Ser(tBu)-OH在0.4515～3.0097μg/ml范围内线性良好。
3、检测限和定量限
精密量取Fmoc-D-Ser(tBu)-OH对照品储备液0.1ml，置20ml量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得定量限溶液(LOQ溶液)；计算LOQ溶液连续进样6次对映异构体Fmoc-D-Ser(tBu)-OH峰的信噪比(S/N)，及峰面积的RSD。
精密量取定量限溶液3ml，置10ml量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得检测限溶液(LOD溶液)；计算LOD溶液进样1次对映异构体Fmoc-D-Ser(tBu)-OH峰的信噪比(S/N)。结果见下表9。
表9
Figure BDA0003719534160000101
结果表明Fmoc-D-Ser(tBu)-OH的6份定量限溶液S/N值均大于10，最小值为20；6份峰面积的RSD为1.4％，符合要求。Fmoc-D-Ser(tBu)-OH的检测限溶液S/N值为6，大于3，均符合要求，说明本方法灵敏度较好。
4、准确度
供试品溶液制备：精密称取供试品10mg，置20ml量瓶中，用稀释剂溶解并稀释至刻度线，摇匀，即得；
对照品溶液制备：精密称取保护氨基酸对映异构体，用稀释剂溶解并稀释成浓度为0.03mg/ml的溶液，作为对照品贮备液；精密量取对照品贮备液1ml，置20ml量瓶中，用稀释剂溶解并稀释至刻度线，摇匀，即得；
定量限准确度溶液：称取Fmoc-Ser(tBu)-OH约10mg，置20ml量瓶，加入稀释剂约5ml，超声使溶解，精密加入对照品贮备液0.3ml，后用稀释剂稀释至刻度，摇匀即得；平行配制3份，各进1针。
100％限度准确度溶液：称取Fmoc-Ser(tBu)-OH约10mg，置20ml量瓶，加入稀释剂约5ml，超声使溶解，精密加入对照品贮备液1.0ml，后用稀释剂稀释至刻度，摇匀即得；平行配制3份，各进1针。
200％限度准确度溶液：称取Fmoc-Ser(tBu)-OH约10mg，置20ml量瓶，加入稀释剂约5ml，超声使溶解，精密加入对照品贮备液2.0ml，后用稀释剂稀释至刻度，摇匀即得；平行配制3份，各进1针。
根据公式回收率(％)＝(A-B)/C×100％，其中A为测得量，B为本底量，C为加入量来计算；计算结果见下表10。
表10
Figure BDA0003719534160000111
低中高浓度水平的回收率分别为96.3～93.8％、95.2～99.4％以及97.7～100.0％，9份低中高水平回收率的RSD为2.9％，均符合要求，说明本法准确度较好。
5、重复性
称取Fmoc-Ser(tBu)-OH约10mg，置20ml量瓶，加入稀释剂约5ml，超声使溶解，精密加入对照品贮备液1.0ml，后用稀释剂稀释至刻度，摇匀即得；平行配制6份，各进1针；结果见下表11。
表11
Figure BDA0003719534160000112
6份重复性溶液的含量值RSD为2.9％，符合要求，说明本方法重复性较好。
6、中间精密度
将重复性项下结果作为第一人的实验结果。
同一批样品，由不同试验人员不同天在不同台仪器同法进行测定。按重复性项下方法配制6份中间精密度溶液。
表12
Figure BDA0003719534160000121
表13
Figure BDA0003719534160000122
6份中间精密度溶液测得含量的RSD值为2.4％，12份溶液测得含量的RSD值为2.6％，均小于10％，符合要求。
7、溶液放置稳定性
取对映异构体Fmoc-D-Ser(tBu)-OH对照品溶液和加标供试品溶液，室温条件下放置，分别在0小时、6小时、12小时和24小时考察Fmoc-D-Ser(tBu)-OH的峰面积，以不同时间与0小时峰面积比值考察溶液稳定性。
表14
Figure BDA0003719534160000123
由上表格得出，对照品溶液和加标溶液在室温下放置不同时间，Fmoc-D-Ser(tBu)-OH的峰面积与0时相比，比值最大为106.3％和105.7％，各个时间点峰面积与0时比值均在90.0～110.0％之间，说明对照品溶液和加标供试品溶液在室温下放置24小时内稳定。
8、耐用性试验
当仪器色谱参数发生些微变化，如流动相正己烷和无水乙醇配比、三氟乙酸含量、柱温和流速发生变化时，考察空白溶剂是否干扰本品检测，系统适用性溶液中Fmoc-D-Ser(tBu)-OH与前后色谱峰分离度，灵敏度溶液S/N值，以及加标供试品溶液与拟定条件下的检出量RSD值，是否符合要求。结果见下表15和16。
表15
Figure BDA0003719534160000131
表16
变化参数 含量(％) 比值(％)
拟定条件 0.33 100
无水乙醇-正己烷(59:41) 0.36 105.5
无水乙醇-正己烷(61:39) 0.34 99.0
三氟乙酸(0.09％) 0.33 99.2
三氟乙酸(0.01％) 0.33 97.2
流速：0.9ml/min 0.32 98.2
流速:1.1ml/min 0.33 102.3
柱温：38℃ 0.32 97.3
柱温：42℃ 0.31 96.0
当仪器色谱参数变化后，灵敏度溶液的S/N值均大于10；Fmoc-D-Ser(tBu)-OH对映体与前后杂质的分离度均符合要求；不同条件下，加标供试品溶液中Fmoc-D-Ser(tBu)-OH与拟定色谱条件的测定结果比值在96.0％-105.5％之间，均在90％-110％范围内；说明本方法耐用性较好。

Claims (10)

1.一种保护氨基酸对映异构体的测定方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）样品配制：
供试品溶液制备：精密称取供试品10mg，置20ml量瓶中，用稀释剂溶解并稀释至
刻度线，摇匀，即得；
对照品溶液制备：精密称取保护氨基酸对映异构体，用稀释剂溶解并稀释成浓度为
0.03mg/ml的溶液，作为对照品贮备液；精密量取对照品贮备液1ml，置20ml量瓶中，用稀释剂溶解并稀释至刻度线，摇匀，即得；
灵敏度溶液制备：精密量取对照品溶液3ml，置10ml量瓶中，用稀释剂溶解并稀释至刻度线，摇匀，即得；
系统适用性溶液制备：精密称取供试品10mg，置20ml量瓶中，加入对照品贮备液1ml，溶解并稀释至刻度，摇匀，即得；
（2）色谱条件设置：
色谱柱：多糖衍生物类手性色谱柱；
流动相：以无水乙醇-正己烷-三氟乙酸（60:40:0.1）为流动相A，正己烷为流动相B进行梯度洗脱；
柱温：30~40℃；
流速：0.3~1.0ml/min；
进样体积：1~10µl；
检测波长：260~270nm；
（3）检测和计算：
精密量取系统适用性溶液，灵敏度溶液、对照品溶液和供试品溶液，分别注入液相色谱仪，记录色谱图；通过外标法计算主峰和对映异构体的峰面积。
2.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于，所述稀释剂为无水乙醇、正己烷、三氟乙酸的混合溶液，其中无水乙醇、正己烷、三氟乙酸的体积比为60:40:0.1。
3.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于，按照下表进行梯度洗脱：
时间（min） 流动相A(%) 流动相B(%) 0 20 80 12 20 80 12.1 100 0 18 100 0 18.1 20 80
。
4.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于，所述柱温为35~45℃。
5.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于，所述流速为0.95~1.05ml/min。
6.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于，所述进样体积为5μl。
7.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于，所述波长为261~267nm。
8.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于，所述灵敏度溶液中，峰高的信噪比大于10。
9.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于，所述保护氨基酸选自Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Pro-OH中的一种。
10.利用权利要求1~9任一项所述方法测定醋酸西曲瑞克起始原料药中保护氨基酸的纯度，其特征在于，所述保护氨基酸选自Fmoc-Ser (tBu)-OH、Fmoc-Pro-OH中的一种，其对映异构体的含量不高于0.3%。
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