CN115541733A - 一种反相色谱法测定保护氨基酸对映异构体的方法 - Google Patents
一种反相色谱法测定保护氨基酸对映异构体的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN115541733A CN115541733A CN202210832827.3A CN202210832827A CN115541733A CN 115541733 A CN115541733 A CN 115541733A CN 202210832827 A CN202210832827 A CN 202210832827A CN 115541733 A CN115541733 A CN 115541733A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- solution
- fmoc
- amino acid
- diluent
- pal
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 41
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 title claims abstract description 28
- 238000004366 reverse phase liquid chromatography Methods 0.000 title claims abstract description 11
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims abstract description 29
- 108700008462 cetrorelix Proteins 0.000 claims abstract description 16
- KFEFLCOCAHJBEA-ANRVCLKPSA-N cetrorelix acetate Chemical compound CC(O)=O.C([C@@H](C(=O)N[C@H](CCCNC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@H](C)C(N)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](CC=1C=NC=CC=1)NC(=O)[C@@H](CC=1C=CC(Cl)=CC=1)NC(=O)[C@@H](CC=1C=C2C=CC=CC2=CC=1)NC(C)=O)C1=CC=C(O)C=C1 KFEFLCOCAHJBEA-ANRVCLKPSA-N 0.000 claims abstract description 15
- 229960001865 cetrorelix acetate Drugs 0.000 claims abstract description 13
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 claims abstract description 11
- 239000007858 starting material Substances 0.000 claims abstract description 11
- BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N methanoic acid Natural products OC=O BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 10
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 70
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 claims description 41
- 238000007865 diluting Methods 0.000 claims description 33
- JQLPMTXRCLXOJO-OAQYLSRUSA-N (2r)-2-(9h-fluoren-9-ylmethoxycarbonylamino)-3-pyridin-3-ylpropanoic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)O)NC(=O)OCC1C2=CC=CC=C2C2=CC=CC=C21)C1=CC=CN=C1 JQLPMTXRCLXOJO-OAQYLSRUSA-N 0.000 claims description 26
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 22
- 238000005303 weighing Methods 0.000 claims description 20
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 claims description 19
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 18
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 17
- 239000012467 final product Substances 0.000 claims description 13
- 239000000047 product Substances 0.000 claims description 12
- 239000012088 reference solution Substances 0.000 claims description 11
- 239000012085 test solution Substances 0.000 claims description 11
- NBMSMZSRTIOFOK-GOSISDBHSA-N (2r)-5-(carbamoylamino)-2-(9h-fluoren-9-ylmethoxycarbonylamino)pentanoic acid Chemical compound C1=CC=C2C(COC(=O)N[C@H](CCCNC(=O)N)C(O)=O)C3=CC=CC=C3C2=C1 NBMSMZSRTIOFOK-GOSISDBHSA-N 0.000 claims description 9
- 238000010828 elution Methods 0.000 claims description 9
- 238000002347 injection Methods 0.000 claims description 8
- 239000007924 injection Substances 0.000 claims description 8
- SBTVLCPCSXMWIQ-UHFFFAOYSA-N (3,5-dimethylphenyl) carbamate Chemical compound CC1=CC(C)=CC(OC(N)=O)=C1 SBTVLCPCSXMWIQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 238000010812 external standard method Methods 0.000 claims description 5
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 5
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 230000005526 G1 to G0 transition Effects 0.000 claims description 4
- -1 amino acid enantiomers Chemical class 0.000 claims description 3
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 claims description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 3
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 claims description 3
- 239000013074 reference sample Substances 0.000 claims description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 claims 1
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 19
- 238000000926 separation method Methods 0.000 abstract description 13
- HBAQYPYDRFILMT-UHFFFAOYSA-N 8-[3-(1-cyclopropylpyrazol-4-yl)-1H-pyrazolo[4,3-d]pyrimidin-5-yl]-3-methyl-3,8-diazabicyclo[3.2.1]octan-2-one Chemical class C1(CC1)N1N=CC(=C1)C1=NNC2=C1N=C(N=C2)N1C2C(N(CC1CC2)C)=O HBAQYPYDRFILMT-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 7
- OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 4-(3-methoxyphenyl)aniline Chemical compound COC1=CC=CC(C=2C=CC(N)=CC=2)=C1 OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 abstract description 3
- 235000019253 formic acid Nutrition 0.000 abstract description 3
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 abstract description 2
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 abstract 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 abstract 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 24
- 239000013558 reference substance Substances 0.000 description 20
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 15
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 12
- LINBWYYLPWJQHE-UHFFFAOYSA-N 3-(9h-fluoren-9-ylmethoxycarbonylamino)propanoic acid Chemical compound C1=CC=C2C(COC(=O)NCCC(=O)O)C3=CC=CC=C3C2=C1 LINBWYYLPWJQHE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 8
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 7
- PBCJIPOGFJYBJE-UHFFFAOYSA-N acetonitrile;hydrate Chemical compound O.CC#N PBCJIPOGFJYBJE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 description 4
- 239000012488 sample solution Substances 0.000 description 4
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- 125000003088 (fluoren-9-ylmethoxy)carbonyl group Chemical group 0.000 description 2
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- UFWIBTONFRDIAS-UHFFFAOYSA-N Naphthalene Chemical compound C1=CC=CC2=CC=CC=C21 UFWIBTONFRDIAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- RJKFOVLPORLFTN-LEKSSAKUSA-N Progesterone Chemical compound C1CC2=CC(=O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H](C(=O)C)[C@@]1(C)CC2 RJKFOVLPORLFTN-LEKSSAKUSA-N 0.000 description 2
- 229960003230 cetrorelix Drugs 0.000 description 2
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- IDGUHHHQCWSQLU-UHFFFAOYSA-N ethanol;hydrate Chemical compound O.CCO IDGUHHHQCWSQLU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 238000009210 therapy by ultrasound Methods 0.000 description 2
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 2
- JQLPMTXRCLXOJO-NRFANRHFSA-N (2s)-2-(9h-fluoren-9-ylmethoxycarbonylamino)-3-pyridin-3-ylpropanoic acid Chemical compound C([C@@H](C(=O)O)NC(=O)OCC1C2=CC=CC=C2C2=CC=CC=C21)C1=CC=CN=C1 JQLPMTXRCLXOJO-NRFANRHFSA-N 0.000 description 1
- 125000003349 3-pyridyl group Chemical group N1=C([H])C([*])=C([H])C([H])=C1[H] 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000003325 follicular Effects 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 238000010829 isocratic elution Methods 0.000 description 1
- 238000012417 linear regression Methods 0.000 description 1
- 238000004811 liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 230000002611 ovarian Effects 0.000 description 1
- 238000005220 pharmaceutical analysis Methods 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 230000008092 positive effect Effects 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 230000002028 premature Effects 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 229960003387 progesterone Drugs 0.000 description 1
- 239000000186 progesterone Substances 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 239000002464 receptor antagonist Substances 0.000 description 1
- 229940044551 receptor antagonist Drugs 0.000 description 1
- 230000003252 repetitive effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 239000012086 standard solution Substances 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
- G01N30/02—Column chromatography
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01D—SEPARATION
- B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
- B01D15/08—Selective adsorption, e.g. chromatography
- B01D15/26—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism
- B01D15/38—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism involving specific interaction not covered by one or more of groups B01D15/265 - B01D15/36
- B01D15/3833—Chiral chromatography
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01D—SEPARATION
- B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
- B01D15/08—Selective adsorption, e.g. chromatography
- B01D15/42—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the development mode, e.g. by displacement or by elution
- B01D15/424—Elution mode
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
- G01N30/02—Column chromatography
- G01N30/26—Conditioning of the fluid carrier; Flow patterns
- G01N30/28—Control of physical parameters of the fluid carrier
- G01N30/34—Control of physical parameters of the fluid carrier of fluid composition, e.g. gradient
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
- G01N30/02—Column chromatography
- G01N2030/022—Column chromatography characterised by the kind of separation mechanism
- G01N2030/027—Liquid chromatography
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
Abstract
本发明提供一种反相色谱法测定保护氨基酸对映异构体的方法。本发明可行性较好，色谱方法比较稳定，灵敏度较高，检测限为0.075μg/ml，主成分和对映异构体的分离度均符合要求，且不同仪器不同试验人员和不同实验室耐用性较好；色谱体系中使用的乙腈，甲酸等试剂的毒性较小，对检测人员的伤害大大减少；并且乙腈和甲酸为实验室检测常用试剂，价格便宜，为企业后期正常检测控制成本。该色谱条件对醋酸西曲瑞克的两种保护氨基酸起始物料的对映异构体检测皆适用。
Description
技术领域
本发明涉及药物分析技术领域，具体涉及一种反相色谱法测定保护氨基酸对映异构体的方法。
背景技术
醋酸西曲瑞克，又常称为西曲瑞克，是一种有效的黄体酮释放激素抑制素受体拮抗剂，它能控制卵巢的刺激作用，预防不成熟卵泡过早排出，帮助受孕；西曲瑞克单剂量方案可减少注射次数，更方便使用。目前国内注射用醋酸西曲瑞克仅有原研药品在售，竞争格局良好，是辅助生殖相关指南推荐用药，临床前景较好。醋酸西曲瑞克一种合成的十肽，其化学名称为：N-乙酰-3-(2-萘)-D-丙氨酰-p-氯-D-苯丙氨酰-3-(3-吡啶基)-D-丙氨酰-L-丝氨酰-L-酪氨酰-N5-氨甲酰-D-鸟氨酰-L-亮氨酰-L-精氨酰-L-脯氨酰-D-丙氨酰胺醋酸盐。
其结构式为：
可以看出，醋酸西曲瑞克肽链中含有多个手性中心，而这些手性中心是由合成醋酸西曲瑞克的多个氨基酸起始原料引进的。这些氨基酸起始原料中均存在对映异构体杂质风险，若对起始原料的手性杂质不加以控制，会引入到终产品中，导致终产品精制困难，难以达到质控标准，生产成本增加。
因此，开发出能有效检出氨基酸对映异构体的分析方法，对醋酸西曲瑞克的生产和提纯具有重要的指导意义，并建立严格的质控标准，从而对降低终产品提纯难度、提高产品质量有积极意义。
目前对于多肽保护氨基酸对映体的测定分析方法文献较少，专利CN111505161A公开了一种保护氨基酸对映异构体检测方法，是采用反相色谱方法对Fmoc保护氨基酸的对映体进行测定，使用的色谱柱为纤维素-三(3，5-二甲基苯基氨基甲酸酯)色谱柱，流动相为0.1％三氟乙酸水溶液-乙腈体系。申请人尝试用该方法检测醋酸西曲瑞克的多个氨基酸起始原料，发现并不适用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种反相色谱法测定保护氨基酸对映异构体的方法，该色谱条件对醋酸西曲瑞克的两种保护氨基酸起始物料的对映异构体检测皆适用。能够实现主峰与对映异构体的有效分离，分离效果突出，专属性好。
实现上述发明目的的技术方案是：
本发明提供一种反相色谱法测定保护氨基酸对映异构体的方法，包括以下步骤：
(1)样品配制：
供试品溶液制备：精密称取供试品10mg，置20ml量瓶中，用稀释剂溶解并稀释至刻度线，摇匀，即得；
对照品溶液制备：精密称取保护氨基酸对映异构体，用稀释剂溶解并稀释成浓度为0.05mg/ml的溶液，作为对照品贮备液；精密量取对照品贮备液2ml，置20ml量瓶中，用稀释剂溶解并稀释至刻度线，摇匀，即得；
灵敏度溶液制备：精密量取对照品溶液1ml，置10ml量瓶中，用稀释剂溶解并稀释至刻度线，摇匀，即得；
系统适用性溶液制备：精密称取供试品10mg，置20ml量瓶中，加入对照品贮备液2ml，用稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀，即得；
(2)色谱条件设置：
色谱柱：纤维素-三(3，5-二甲基苯基氨基甲酸酯)手性固定相为色谱柱；
流动相：以水-乙腈-甲酸(70：30：0.1)为流动相A，乙腈-水(90：10)为流动相B进行梯度洗脱；
柱温：30～40℃；
流速：0.3～1.0ml/min；
进样体积：5～20μl；
检测波长：260～270nm；
(3)检测和计算：
精密量取系统适用性溶液，灵敏度溶液、对照品溶液和供试品溶液，分别注入液相色谱仪，记录色谱图；通过外标法计算主峰和对映异构体的峰面积。
根据本发明实施方案，所述稀释剂为无水乙醇和水的混合溶液，其中无水乙醇和水体积比为50：50。
根据本发明实施方案，按照下表进行梯度洗脱：
根据本发明实施方案，柱温为30～40℃；例如：30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃，优选为30℃。
根据本发明实施方案，流速为0.3～1.0ml/min；例如：0.3ml/min、0.4ml/min、0.5ml/min、0.6ml/min、0.7ml/min、0.8ml/min、0.9ml/min、1.0ml/min，优选为1.0ml/min。
根据本发明实施方案，进样体积为5～20μl；例如：5μl、6μl、8μl、10μl、12μl、14μl、16μl、18μl、20μl；优选为10μl。
根据本发明实施方案，检测波长为260～270nm；例如：260nm、261nm、262nm、263nm、264nm、265nm、266nm、267nm、268nm、269nm、270nm；优选为264nm。
根据本发明实施方案，所述灵敏度溶液中，峰高的信噪比大于10。
根据本发明实施方案，所述保护氨基酸选自Fmoc-D-3-Pal-OH。
本发明还提供一种利用上述反相色谱法测定保护氨基酸对映异构体的方法测定醋酸西曲瑞克起始原料药中保护氨基酸的含量，所述保护氨基酸选自Fmoc-D-3-Pal-OH，其对应异构体的含量不高于0.5％。
本发明的有益效果是：
1、本发明采用的流动相是乙腈，为常用极性试剂，很少与样品会发生反应，洗脱能力较好，且色谱系统压力较小。同时流动相系统中使用甲酸酸性添加剂尽量控制在0.2％以下，从而避免了因为长期使用酸性流动相而造成手性色谱柱和仪器被腐蚀的问题。
2、本发明对醋酸西曲瑞克起始物料一种保护氨基酸Fmoc-D-3-Pal-OH中可能的降解杂质和工艺杂质，如Fmoc-D-3-Pal-D-3-Pal-OH、Fmoc-β-Ala-D-3-Pal-OH、Fmoc-β-Ala-OH、Fmoc-Osu和H-D-3-Pal-OH等进行了杂质峰定位，本发明采用了梯度洗脱的方式进行检测，通过优化设置合理的洗脱条件，使这些杂质能够准确定位，与对映异构体Fmoc-L-3-Pal-OH的分离度符合要求，并且能快速被洗脱出来；不干扰样品中对映异构体的检测，并且不影响同一色谱系统其它批次样品的检测。避免了对映异构体Fmoc-L-3-Pal-OH与样品中其它杂质不完全分离，与主峰分离度不符合要求而影响峰面积积分，导致检测结果不准确的问题。
3、本发明通过对流动相配比、对照品溶液以及洗脱条件进行综合设计和优化，本发明的分析方法在液相色谱系统运行过程中，基线平稳，空白溶剂和其它杂质基本无干扰本品中对映异构体的检测，杂质分离效果突出，专属性好，试验数据证明，检出限可达到0.075μg/ml，灵敏度极高，检测结果可为产品研发、生产和提纯提供可靠有效的信息，为建立保护氨基酸质控标准打下了坚实基础，为终产品的质量控制起到了积极作用。
附图说明
图1为实施例1中Fmoc-D-3-Pal-OH及对映异构体系统适用性谱图。
图2为实施例2中Fmoc-D-Cit-OH及对映异构体系统适用性谱图。
图3为对比例中Fmoc-D-3-Pal-OH及对映异构体系统适用性谱图及对映异构体系统适用性谱图。
图4为实施例3中对映异构体Fmoc-L-3-Pal-OH的线性趋势图。
具体实施方式
下面结合具体实施例和附图对本发明作进一步详述，以下实施例只是描述性的，不是限定性的，不能以此限定本发明的保护范围，如无特别说明，所用原料均可通过市售或自制获得。
实施例1(反相)(XQRK-SM-8)
一种反相色谱法测定醋酸西曲瑞克起始原料Fmoc-D-3-Pal-OH对映异构体的方法，具体包含如下步骤：
(1)色谱条件设置：采用以纤维素-三(3，5-二甲基苯基氨基甲酸酯)手性固定相为色谱柱，柱长25cm，内径4.6mm，膜厚5μm；柱温为30℃，以水-乙腈-甲酸(70：30：0.1)为流动相A，乙腈-水(90：10)为流动相B，按照下表1进行梯度洗脱；流速为每分钟1.0ml，柱温为30℃，检测波长为264nm，进样体积10μl。
(2)供试品溶液制备：取本品约10mg，精密称定，置20ml量瓶中，加溶剂乙醇-水(50:50)溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。
(3)对照品溶液制备：取对映异构体Fmoc-L-3-Pal-OH对照品适量，精密称定，加溶剂溶解并稀释成每1ml含0.05mg的溶液，作为对照品贮备液；精密量取对照品贮备液1ml，置20ml量瓶中，用溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀，即得；
(4)灵敏度溶液制备：精密量取对照品溶液1ml，置10ml量瓶中，用溶剂稀释至刻度，摇匀，即得；
(5)系统适用性溶液制备：取本品约10mg，精密称定，置20ml量瓶中，加入对照品贮备液1ml，溶解并稀释至刻度，摇匀，即得；
(6)检测：精密量取系统适用性溶液，灵敏度溶液、对照品溶液和供试品溶液，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。系统适用性溶液中Fmoc-D-3-Pal-OH和Fmoc-L-3-Pal-OH依次出峰，对映异构体Fmoc-L-3-Pal-OH与其相邻峰分离度应符合要求；灵敏度溶液中，峰高的信噪比应大于10。
(7)供试品溶液色谱图中，如有与Fmoc-L-3-Pal-OH保留时间一致的色谱峰，按外标法以峰面积计算，不得过0.5％。
表1梯度洗脱程序
表2 Fmoc-D-3-Pal-OH和Fmoc-L-3-Pal-OH化学结构式
表3
| 化合物名称 | Fmoc-D-3-Pal-OH | Fmoc-L-3-Pal-OH |
| 出峰时间min | 8.372 | 15.334 |
| 峰面积比％ | 99.52 | 0.48 |
| 分离度 | / | 8.1 |
从图2的色谱图和表3的结果可以得到，对映异构体Fmoc-L-3-Pal-OH和主成分Fmoc-D-3-Pal-OH的分离度为8.1，大于1.5，说明本发明能将Fmoc-D-3-Pal-OH及对映异构体Fmoc-L-3-Pal-OH有效分离。
实施例2(反相)(XQRK-SM-5)
一种反相色谱法测定醋酸西曲瑞克起始原料Fmoc-D-Cit-OH对映异构体的方法，具体包含如下步骤：
(1)色谱条件设置：采用以纤维素-三(3，5-二甲基苯基氨基甲酸酯)手性固定相为色谱柱，柱长25cm，内径4.6mm，膜厚5μm；柱温为30℃，以水-乙腈-甲酸(70：30：0.1)为流动相A，乙腈-水(90：10)为流动相B，按照下表3进行梯度洗脱；流速为每分钟1.0ml，柱温为30℃，检测波长为264nm，进样体积10μl。
(2)供试品溶液制备：取本品约10mg，精密称定，置20ml量瓶中，加溶剂乙醇-水(50:50)溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。
(3)对照品溶液制备：取对映异构体Fmoc-L-Cit-OH对照品适量，精密称定，加溶剂溶解并稀释成每1ml含0.05mg的溶液，作为对照品贮备液；精密量取对照品贮备液2ml，置20ml量瓶中，用溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀，即得；
(4)灵敏度溶液制备：精密量取对照品溶液1ml，置10ml量瓶中，用溶剂稀释至刻度，摇匀，即得；
(5)系统适用性溶液制备：取本品约10mg，精密称定，置20ml量瓶中，加入对照品贮备液2ml，溶解并稀释至刻度，摇匀，即得；
(6)检测：精密量取系统适用性溶液，灵敏度溶液、对照品溶液和供试品溶液，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。系统适用性溶液中Fmoc-D-Cit-OH和Fmoc-L-Cit-OH依次出峰，对映异构体Fmoc-L-Cit-OH与其相邻峰分离度应符合要求；灵敏度溶液中，峰高的信噪比应大于10。
(7)供试品溶液色谱图中，如有与Fmoc-L-Cit-OH保留时间一致的色谱峰，按外标法以峰面积计算，不得过1.0％。
表3梯度洗脱程序
表4 Fmoc-D-Cit-OH和Fmoc-L-Cit-OH化学结构式
表5
| 化合物名称 | Fmoc-D-Cit-OH | Fmoc-L-Cit-OH |
| 出峰时间min | 18.915 | 24.229 |
| 峰面积比％ | 99.03 | 0.97 |
| 分离度 | N/A | 5.3 |
从图3的色谱图和表5的结果可以得到，对映异构体Fmoc-L-Cit-OH和主成分Fmoc-D-Cit-OH的分离度为5.3，大于1.5，说明本发明能将Fmoc-D-Cit-OH及对映异构体Fmoc-L-Cit-OH有效分离。
对比例
专利CN111505161A中采用纤维素-三(3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯)为色谱柱，以三氟乙酸：水＝1:1000为流动相A，柱温25℃，乙腈为流动相B，流动相A：流动相B＝80：20(V/V)进行等度洗脱25min，对Fmoc系列保护氨基酸的对映异构体进行检测。本发明通过重复试验条件发现，该液相条件和样品检测时，基线波动大，且本发明中Fmoc基团保护氨基酸在上述条件下，主成分和其对映异构体未能有效的分开，见图3为Fmoc-D-3-Pal-OH及对映异构体系统适用性谱图。因此无法对起始物料中的对映异构体进行定量分析和准确检测多批次样品中的含量。这样的流动相对醋酸西曲瑞克的多个保护氨基酸的对映异构体检测不适用，需在此基础上继续优化色谱条件。
实施例3
本发明采用外标法计算对映异构体的含量，并且对该方法进行一系列的方法学验证，包括线性，检测限定量限，重复性，准确度，中间精密度，溶液放置稳定性和耐用性试验；结果表明该方法专属性强，准确度高，可以用于检测物料Fmoc-D-3-Pal-OH中对映异构体Fmoc-L-3-Pal-OH的含量。
一、方法学验证：
1、专属性
溶液配制：
1)空白溶剂：稀释剂。
2)Fmoc-D-3-Pal-OH定位溶液：取Fmoc-D-3-Pal-OH工作对照品约10mg，置20ml量瓶中，加稀释剂约5ml，超声使其溶解，用稀释剂稀释至刻度，摇匀即得。
3)Fmoc-L-3-Pal-OH定位溶液：取Fmoc-L-3-Pal-OH对照品约10mg，置20ml量瓶中，加稀释剂约5ml，超声使其溶解，用稀释剂稀释至刻度，摇匀即得。
4)Fmoc-D-3-Pal-D-3-Pal-OH定位溶液：取Fmoc-D-3-Pal-D-3-Pal-OH杂质对照品约2mg，置10ml量瓶中，加稀释剂约5ml，超声使其溶解，用稀释剂稀释至刻度，摇匀即得。
5)Fmoc-β-Ala-D-3-Pal-OH定位溶液：取Fmoc-β-Ala-D-3-Pal-OH杂质对照品约2mg，置10ml量瓶中，加稀释剂约5ml，超声使其溶解，用稀释剂稀释至刻度，摇匀即得。
6)Fmoc-β-Ala-OH定位溶液：取Fmoc-β-Ala-OH杂质对照品约2mg，置10ml量瓶中，加稀释剂约5ml，超声使其溶解，用稀释剂稀释至刻度，摇匀即得。
7)Fmoc-Osu定位溶液：取Fmoc-Osu杂质约2mg，置10ml量瓶中，加稀释剂约5ml，超声使其溶解，用稀释剂稀释至刻度，摇匀即得。
8)H-D-3-Pal-OH定位溶液：取H-D-3-Pal-OH杂质约2mg，置10ml量瓶中，加稀释剂约5ml，超声使其溶解，用稀释剂稀释至刻度，摇匀即得。
9)混合溶液：精密移取上述峰定位溶液各1.0ml，置同一20ml量瓶，用稀释剂稀释至刻度，摇匀即得。混合溶液中各个成分之间的分离度结果见下表6。
表6
空白溶剂对本品中对映异构体检测无干扰；另外杂质Fmoc-D-3-Pal-D-3-Pal-OH、Fmoc-β-Ala-D-3-Pal-OH、Fmoc-β-Ala-OH、Fmoc-Osu、H-D-3-Pal-OH对本品对映异构体Fmoc-L-3-Pal-OH测定均无干扰，本发明方法专属性较好。
2、线性和范围
线性溶液的配制：分别精密量取对映异构体Fmoc-L-3-Pal-OH贮备液适量，配制成浓度为0.5050、1.5149、2.5249、5.0497、6.0597、7.5746、10.0994μg/ml的一系列线性浓度溶液。分别注入液相色谱仪，记录色谱图。以Fmoc-L-3-Pal-OH浓度(μg/ml)为横坐标、以峰面积为纵坐标进行线性回归。
表7
由表5中结果得出对映异构体Fmoc-L-3-Pal-OH的浓度与峰面积的线性方程为y＝33305.1362x-2503.6633，相关系数r＝0.9997，Y轴截距与100％响应值比值绝对值为1.5，均符合试验要求。说明Fmoc-L-3-Pal-OH在0.5050-10.0994μg/ml范围内线性良好。
3、检测限和定量限
精密量取Fmoc-L-3-Pal-OH对照品溶液1ml，置10ml量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得定量限溶液(LOQ溶液)；计算LOQ溶液连续进样6次对映异构体Fmoc-D-3-Pal-OH峰的信噪比(S/N)，及峰面积的RSD。
精密量取定量限溶液3ml，置10ml量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得检测限溶液(LOD溶液)；计算LOD溶液进样1次对映异构体Fmoc-D-3-Pal-OH峰的信噪比(S/N)。结果见下表8。
表8
结果表明Fmoc-L-3-Pal-OH的6份定量限溶液S/N值均大于10，最小值为27；6份峰面积的RSD为4.5％，符合要求。Fmoc-L-3-Pal-OH的检测限溶液S/N值为9，大于3，均符合要求，说明本方法灵敏度较好。
4、准确度
供试品溶液制备：精密称取供试品10mg，置20ml量瓶中，用稀释剂溶解并稀释至刻度线，摇匀，即得；
对照品溶液制备：精密称取保护氨基酸对映异构体，用稀释剂溶解并稀释成浓度为0.05mg/ml的溶液，作为对照品贮备液；精密量取对照品贮备液1ml，置10ml量瓶中，用稀释剂溶解并稀释至刻度线，摇匀，即得；
定量限准确度溶液：称取Fmoc-D-3-Pal-OH约10mg，置20ml量瓶，加入稀释剂约5ml，超声使溶解，精密加入对照品贮备液0.2ml，后用稀释剂稀释至刻度，摇匀即得；平行配制3份，各进1针。
100％限度准确度溶液：称取Fmoc-D-3-Pal-OH约10mg，置20ml量瓶，加入稀释剂约5ml，超声使溶解，精密加入对照品贮备液2.0ml，后用稀释剂稀释至刻度，摇匀即得；平行配制3份，各进1针。
200％限度准确度溶液：称取Fmoc-D-3-Pal-OH约10mg，置20ml量瓶，加入稀释剂约5ml，超声使溶解，精密加入对照品贮备液4.0ml，后用稀释剂稀释至刻度，摇匀即得；平行配制3份，各进1针。
根据公式回收率(％)＝(A-B)/C×100％，其中A为测得量，B为本底量，C为加入量来计算；计算结果见下表9。
表9
低中高浓度水平的回收率分别为83.7～89.1％和103.5～104.2％以及104.1～104.8％，9份低中高水平回收率的RSD为8.8％。均符合要求，说明本法准确度较好。
5、重复性
称取Fmoc-3-Pal-OH约10mg，置20ml量瓶，加入稀释剂约5ml，超声使溶解，精密加入对照品贮备液1.0ml，后用稀释剂稀释至刻度，摇匀即得；平行配制6份，各进1针；结果见下表10。
表10
6份重复性溶液的含量值RSD为0.8％，符合要求，说明本方法重复性较好。
6、中间精密度
将重复性项下结果作为第一人的实验结果。
同一批样品，由不同试验人员不同天在不同台仪器同法进行测定。按重复性项下方法配制6份中间精密度溶液。
表11
表12
6份中间精密度溶液测得含量的RSD值为1.4％，12份溶液测得含量的RSD值为0％，均小于10％，符合要求。
7、溶液放置稳定性
取加标供试品溶液，室温条件下放置，分别在0小时、5小时、9小时、15小时测定对映异构体Fmoc-L-3-Pal-OH峰面积，计算峰面积RSD，考察溶液稳定性。
表13
由上表格得出，加标溶液在室温下放置不同时间，Fmoc-L-3-Pal-OH的峰面积RSD为1.1％，说明加标供试品溶液在室温下放置15小时内稳定。
8、耐用性试验
当仪器色谱参数发生些微变化，如流动相水和乙腈配比、波长、柱温和流速发生变化时，考察空白溶剂是否干扰本品检测，系统适用性溶液中Fmoc-L-3-Pal-OH与前后色谱峰分离度，灵敏度溶液S/N值，以及加标供试品溶液与拟定条件下的检出量RSD值，是否符合要求。结果见下表14和15。
表14
表15
当仪器色谱参数变化后，灵敏度溶液的S/N值均大于10；Fmoc-L-3-Pal-OH对映体与前后杂质的分离度均符合要求；不同条件下，加标供试品溶液中Fmoc-L-3-Pal-OH与拟定色谱条件的RSD均小于10.0％；说明本方法耐用性较好。
Claims (10)
1.一种反相色谱法测定保护氨基酸对映异构体的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）样品配制：
供试品溶液制备：精密称取供试品10mg，置20ml量瓶中，用稀释剂溶解并稀释至
刻度线，摇匀，即得；
对照品溶液制备：精密称取保护氨基酸对映异构体，用稀释剂溶解并稀释成浓度为
0.05mg/ml的溶液，作为对照品贮备液；精密量取对照品贮备液2ml，置20ml量瓶中，用稀释剂溶解并稀释至刻度线，摇匀，即得；
灵敏度溶液制备：精密量取对照品溶液1ml，置10ml量瓶中，用稀释剂溶解并稀释至刻度线，摇匀，即得；
系统适用性溶液制备：精密称取供试品10mg，置20ml量瓶中，加入对照品贮备液2ml，用稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀，即得；
（2）色谱条件设置：
色谱柱：纤维素-三（3，5-二甲基苯基氨基甲酸酯）手性固定相为色谱柱；
流动相：以水-乙腈-甲酸（70：30：0.1）为流动相A，乙腈-水（90：10）为流动相B进行梯度洗脱；
柱温：25~40℃；
流速：0.3~1.5ml/min；
进样体积：5~20µl；
检测波长：260~270nm；
（3）检测和计算：
精密量取系统适用性溶液，灵敏度溶液、对照品溶液和供试品溶液，分别注入液相色谱仪，记录色谱图；通过外标法计算主峰和对映异构体的峰面积。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述稀释剂为无水乙醇和水的混合溶液，其中无水乙醇和水体积比为50：50。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，按照下表进行梯度洗脱：
。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述柱温为28~32℃。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述流速为0.98~1.02ml/min。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述进样体积为10μl。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述波长为263~265nm。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述灵敏度溶液中，峰高的信噪比大于10。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述保护氨基酸选自Fmoc-D-3-Pal-OH、Fmoc-D-Cit-OH中一种。
10.利用权利要求1~9任一项所述方法测定醋酸西曲瑞克起始原料药中保护氨基酸的纯度，其特征在于，所述保护氨基酸选自Fmoc-D-3-Pal-OH、Fmoc-D-Cit-OH中一种，其对应异构体的含量不高于0.5%。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202210832827.3A CN115541733B (zh) | 2022-07-14 | 2022-07-14 | 一种反相色谱法测定保护氨基酸对映异构体的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202210832827.3A CN115541733B (zh) | 2022-07-14 | 2022-07-14 | 一种反相色谱法测定保护氨基酸对映异构体的方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN115541733A true CN115541733A (zh) | 2022-12-30 |
| CN115541733B CN115541733B (zh) | 2024-08-09 |
Family
ID=84724298
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202210832827.3A Active CN115541733B (zh) | 2022-07-14 | 2022-07-14 | 一种反相色谱法测定保护氨基酸对映异构体的方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN115541733B (zh) |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN111505161A (zh) * | 2020-05-11 | 2020-08-07 | 成都市科隆化学品有限公司 | 一种保护氨基酸对映异构体检测方法 |
| US20210121517A1 (en) * | 2019-10-24 | 2021-04-29 | Sun Pharmaceutical Industries Limited | Stable parenteral dosage form of cetrorelix acetate |
| CN112881571A (zh) * | 2021-02-22 | 2021-06-01 | 江苏沿海化学品检测技术服务有限公司 | 一种高效液相色谱法的Fmoc-L-Hyp(tbu)-OH及其异构体的手性检测方法 |
-
2022
- 2022-07-14 CN CN202210832827.3A patent/CN115541733B/zh active Active
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20210121517A1 (en) * | 2019-10-24 | 2021-04-29 | Sun Pharmaceutical Industries Limited | Stable parenteral dosage form of cetrorelix acetate |
| CN111505161A (zh) * | 2020-05-11 | 2020-08-07 | 成都市科隆化学品有限公司 | 一种保护氨基酸对映异构体检测方法 |
| CN112881571A (zh) * | 2021-02-22 | 2021-06-01 | 江苏沿海化学品检测技术服务有限公司 | 一种高效液相色谱法的Fmoc-L-Hyp(tbu)-OH及其异构体的手性检测方法 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| KYUNG-AH LEE 等: "Enantioseparation of N-fluorenylmethoxycarbonyl α-amino acids on polysaccharide-derived chiral stationary phases by reverse mode liquid chromatography", JOURNAL OF PHARMACEUTICAL AND BIOMEDICAL ANALYSIS, vol. 46, 17 January 2008 (2008-01-17), pages 914, XP022552162 * |
| 孙宝丹 等: "HPLC法测定2种保护组氨酸衍生物中的对映体", 中国医药工业杂志, vol. 52, no. 10, 31 December 2021 (2021-12-31), pages 1366 - 1370 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN115541733B (zh) | 2024-08-09 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN109444304A (zh) | 一种非布司他及其相关杂质的hplc检测方法 | |
| CN113390983B (zh) | 一种同时测定富马酸伏诺拉生中3种杂质的检测方法 | |
| CN115541731A (zh) | 一种保护氨基酸对映异构体的分析方法 | |
| CN107991415B (zh) | 用液相色谱法同时分离测定复方氨基酸注射液18aa中焦谷氨酸和蛋氨酸亚砜杂质的方法 | |
| CN114689737B (zh) | 一种s-邻氯苯甘氨酸甲酯酒石酸盐有关物质的分析方法 | |
| CN115541733A (zh) | 一种反相色谱法测定保护氨基酸对映异构体的方法 | |
| CN116297978A (zh) | Hplc法分离测定泊沙康唑z3及其杂质与溶剂的方法 | |
| CN115541730B (zh) | 一种保护氨基酸对映异构体的测定方法 | |
| CN114354789B (zh) | 一种同时测定卡博替尼类似物及其有关物质的方法 | |
| CN114216988B (zh) | 一种4-（甲基氨基）-1-（3-吡啶基）-1-丁酮盐酸有关物质的检验方法 | |
| CN115856156A (zh) | 一种多肽保护氨基酸对映异构体的测定方法 | |
| CN115541734B (zh) | 一种正相色谱法测定保护氨基酸对映异构体的方法 | |
| CN113848271A (zh) | 一种检测盐酸左西替利嗪口服溶液中有关物质的方法 | |
| CN114280191A (zh) | 一种双半胱氨酸及其制剂中有关物质的检测方法 | |
| CN109239214B (zh) | 一种沙库比曲钠中沙库比曲异构体检验方法 | |
| CN114518413A (zh) | 一种卡托普利原料药中脯氨酸的含量测定方法 | |
| CN108037221B (zh) | 用液相色谱法同时分离测定复方氨基酸注射液18aa中蛋氨酸亚砜和蛋氨酸砜杂质的方法 | |
| CN115128184B (zh) | 一种利用hplc外标法测定盐酸普拉克索原料中硫脲含量的方法 | |
| CN115372489B (zh) | 一种盐酸替扎尼定有关物质的检测方法 | |
| CN114577913B (zh) | 一种雷贝拉唑钠中雷贝拉唑氯化物的检测方法 | |
| CN107091895B (zh) | 采用hplc分离测定利奥西呱原料药中有关物质的方法 | |
| CN112394112B (zh) | 一种检测硫酸羟氯喹中羟氯喹氮氧化物杂质含量的方法 | |
| CN114487136A (zh) | 一种富马酸二甲酯中多个杂质的检测方法 | |
| CN118330070A (zh) | 马来酸阿伐曲泊帕有关物质的超高效液相色谱测定方法 | |
| CN118010869A (zh) | 一种生长抑素降解杂质的检测方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |