CN110824067A - 一种非布司他中基因毒性杂质的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于医药技术领域，具体提供了一种非布司他中基因毒性杂质的检测方法，该检测方法采用液相色谱法。本发明提供的非布司他基因毒性杂质的检测方法采用高效液相色谱法实现了3个基因毒性杂质的快速准确测定，具有较高的灵敏度和专属性，操作简捷。本发明可用于非布司他的制备过程和最终产品的质量控制。
Description
技术领域
本发明属于药物分析技术领域，具体涉及一种非布司他中基因毒性杂质的液相检测方法。
背景技术
非布司他(英文名：Febuxostat，别名：非布佐司他、非布索坦)，化学名为2-[(3-氰基-4-异丁氧基)苯基]-4-甲基-5-噻唑羧酸，分子式为C16H16N2O3S，分子量为316.37，CAS登录号:144060-53-7。其结构如式I所示。
非布司他(febuxostat)是由日本帝人公司开发的新一代黄嘌呤氧化酶抑制剂，临床上用于治疗尿酸过高症(痛风)。2009年2月美国食品和药物管理局(FDA)批准非布司他用于长期治疗痛风高尿酸血症患者。
与40年前开发的黄嘌呤氧化酶抑制剂药物完全不同，它是一种全新的高效的非嘌呤类黄嘌呤氧化酶选择性抑制剂。黄嘌呤氧化酶是促进尿酸生成的关键酶。非布司他可以降低高尿酸血症痛风患者血液中的尿酸水平，临床研究表明本品是安全和有效的，本品通过肝脏代谢，不依赖肾排出，因此对于中-重度肝肾功能不全的患者也不需要减少剂量。
通常以化合物2-(3-甲酰基-4-羟基苯基)-4-甲基-噻唑-5-羧酸乙酯为起始原料，经取代、加成、脱水、水解等反应合成非布司他。在此合成工艺中会存在2-[3-甲酰基-4-(2-甲基丙氧基)苯基]-4-甲基-5-噻唑羧酸、2-(3-甲酰基-4-羟基苯基)-4-甲基-噻唑-5-羧酸乙酯、2-(3-甲酰基-4-异丁氧基-苯基)-4-甲基-噻唑-5-羧酸乙酯等3个基因毒性杂质。
根据毒理学关注阈值(TTC)为1.5μg/day，推算出非布司他原料药中基因毒性杂质的浓度限度为18ppm。若要用高效液相色谱法将限度做到18ppm，需要提高样品浓度，而样品浓度过高会导致色谱系统中主峰过载覆盖相关基因毒性杂质，无法进行定性定量，并且降低色谱柱使用寿命。
根据目前的研究实践，具有(体内)遗传毒性的化合物在任何暴露量下都有可能对DNA产生损伤，而这种损伤可能会引发肿瘤。因此，研究获得一种简单、便捷、有效的非布司他基因毒性杂质检查的检测方法，对医药生产企业来说显得尤为迫切。
发明内容
本发明的目的在于提供一种高效液相色谱法测定非布司他中3个基因毒性杂质的方法。
所述基因毒性杂质包括：
1、杂质H：2-[3-甲酰基-4-(2-甲基丙氧基)苯基]-4-甲基-5-噻唑羧酸
2、起始物料1：2-(3-甲酰基-4-羟基苯基)-4-甲基-噻唑-5-羧酸乙酯
3、中间体1：2-(3-甲酰基-4-异丁氧基-苯基)-4-甲基-噻唑-5-羧酸乙酯
为解决上述问题，本发明在样品处理过程中稀释剂的选择旨在溶解足够量的基因毒性杂质条件下，减少非布司他的溶解，以减小非布司他色谱峰对基因毒性杂质定量的影响。
样品处理方法：取本品用稀释剂进行溶解，超声并离心将杂质H、起始物料1及中间体1提取完全后，取上清液过滤作为供试品溶液进行分析。
色谱条件：色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填料，优选选自Kromasil C18、ODS-C18、Thermo Syncronis C18、Thermo Hypersil GOLD C18、Waters symmetry C18、WatersRP C18、Agilent XDB C18、Agilent Eclipse Plus C18，
流动相A是盐溶液；流动相B是乙腈；以盐溶液及乙腈作为流动相梯度洗脱。
检测器为紫外检测器，示差检测器，蒸发光散射检测器，二极管阵列检测器中的一种。
优选的，所述稀释剂为二甲基甲酰胺、四氢呋喃、乙腈及甲酸水溶液，更优选的为甲酸水溶液与乙腈的混合溶液。
进一步，所述甲酸水溶液中以体积百分比计算，甲酸的体积占30％～50％，更优选的为40％甲酸水溶液。
进一步，所述40％甲酸水溶液与乙腈的比例为9：1～7：3。
优选的，所述超声的时间为10～20分钟。
优选的，所述离心条件中离心温度为20～30℃。转速为8000～13000r。
优选的，所述离心的时间为10～30分钟。
优选的，所述过滤滤膜的孔径是0.22μm～0.45μm。。
优选的，所述的盐溶液为乙酸钠溶液，盐溶液的pH为2.9～3.1。
优选的，所述色谱条件中，流动相为盐溶液与乙腈梯度洗脱，梯度洗脱0～20min时，盐溶液比例为体积比50％，乙腈比例为体积比50％；20～30min时，盐溶液比例由体积比50％降至25％，乙腈比例为体积比由50％升至75％；30～50min时，盐溶液比例为体积比25％，乙腈比例为体积比75％；50～51min时，盐溶液比例由体积比25％升至50％，乙腈比例由体积比75％降至50％；51～60min时，盐溶液比例为体积比50％，乙腈比例为体积比50％。
更优选的，所述色谱柱为Kromasil C18。
优选的，柱温为30～40℃，流速为0.9～1.1ml/min。
优选的，所述的检测器为二极管阵列检测器。
优选的，所述检测器的检测波长为300～340nm。
本发明所述的提取分离方法，可依照以下方法实现：
1)流动相A的配制：取三水合乙酸钠1.36g溶于1L水，磷酸调pH至2.9～3.1；
2)流动相B的配制：乙腈；
3)供试品溶液的配制：准确称取非布司他样品50.0mg于离心管中，加入2mL稀释剂，超声10～20分钟，离心10～30分钟(离心条件：20～30℃，8000～13000r)，将上清液用0.22μm～0.45μm滤膜过滤即供试品溶液；
4)检测：运用高效液相色谱仪对步骤3)制备的样品溶液进行检测，工作条件如下：
流速：0.9ml/min～1.1ml/min
柱温：30～40℃
进样量：10μL
检测波长：300～340nm
色谱柱：Kromasil C18(5μm,4.6×250mm)
表1色谱柱洗脱程序
| 时间(min) | 流动相A(％V/V) | 流动相B(％V/V) |
| 0 | 50 | 50 |
| 20 | 50 | 50 |
| 30 | 25 | 75 |
| 50 | 25 | 75 |
| 51 | 50 | 50 |
| 60 | 50 | 50 |
本发明提供的非布司他基因毒性杂质的检测方法采用高效液相色谱法实现了3个基因毒性杂质的快速准确测定，该方法简单、精密度高，稳定性好，重现性好，具有较高的灵敏度和专属性，操作简捷，分离度符合标准(即，各相邻两峰分离度均大于1.50)。本发明可用于非布司他的制备过程和最终产品的质量控制。并为此类化合物的研究开发及质量检测奠定了基础，具有现实意义。
附图说明
图1是实施例1中系统适应性溶液的液相色谱图；
图2是实施例2中系统适应性溶液的液相色谱图；
图3是实施例3中系统适应性溶液的液相色谱图；
图4是实施例4中系统适应性溶液的液相色谱图；
图5是实施例5中系统适应性溶液的液相色谱图；
图6是实施例5中对照品溶液的液相色谱图；
图7是实施例5中供试品溶液的液相色谱图。
具体实施方式
以下通过实施例形式对上述内容作进一步补充说明，但不应理解为本发明仅限于以下实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明范围。
实施例1
1)色谱条件
流速：0.9ml/min
柱温：30℃
检测波长：320nm
色谱柱：Kromasil C18(5μm,4.6×250mm)
表2色谱柱洗脱程序
| 时间(min) | 流动相A(％V/V) | 流动相B(％V/V) |
| 0 | 50 | 50 |
| 20 | 50 | 50 |
| 30 | 25 | 75 |
| 50 | 25 | 75 |
| 51 | 50 | 50 |
| 60 | 50 | 50 |
稀释剂：40％甲酸-乙腈(7:3)
2)溶液的配制
对照品溶液：精密称取杂质H、起始物料1及中间体1适量，用稀释剂溶解并定量稀释成每1ml约含各杂质0.45μg的溶液，作为对照品溶液。
系统适用性溶液：准确称取非布司他样品50.0mg于离心管中，加入2mL对照品溶液，超声20分钟，离心10分钟(离心条件：25℃，13000r)，将上清液用0.45μm滤膜过滤即系统使用性溶液。
3)检测方法
精密量取系统适用性溶液10μL，注入高效液相色谱仪中，色谱图如图1所示。
4)实验结果
表3实施例1色谱图中杂质的分析结果
从表3可以看出，在该色谱系统中非布司他杂质H、起始物料1及中间体1之间保留时间差别明显，可以有效分离，符合要求，表明本方法专属性良好。
实施例2
1)色谱条件
流速：1.1ml/min
柱温：30℃
检测波长：320nm
色谱柱：Kromasil C18(5μm,4.6×250mm)
表4色谱柱洗脱程序
| 时间(min) | 流动相A(％V/V) | 流动相B(％V/V) |
| 0 | 50 | 50 |
| 20 | 50 | 50 |
| 30 | 25 | 75 |
| 50 | 25 | 75 |
| 51 | 50 | 50 |
| 60 | 50 | 50 |
稀释剂：40％甲酸-乙腈(7:3)
2)溶液的配制
对照品溶液：精密称取杂质H、起始物料1及中间体1适量，用稀释剂溶解并定量稀释成每1ml约含各杂质0.45μg的溶液，作为对照品溶液。
系统适用性溶液：准确称取非布司他样品50.0mg于离心管中，加入2mL对照品溶液，超声10～20分钟，离心10～30分钟(离心条件：20～30℃，8000～13000r)，将上清液用0.45μm滤膜过滤即系统适用性溶液。
3)检测方法
精密量取系统适用性溶液10μL，注入高效液相色谱仪中，色谱图如图2所示。
4)实验结果
表5实施例2色谱图中杂质的分析结果
| 名称 | 保留时间min | 分离度 |
| 非布司他 | 17.017 | - |
| 杂质H | 18.667 | 2.86 |
| 起始物料1 | 24.735 | 10.26 |
| 中间体1 | 42.287 | 5.57 |
从表5可以看出，在该色谱系统中非布司他杂质H、起始物料1及中间体1之间保留时间差别明显，可以有效分离，符合要求，表明本方法专属性良好。
实施例3
1)色谱条件
流速：1.0ml/min
柱温：30℃
检测波长：320nm
色谱柱：Kromasil C18(5μm,4.6×250mm)
表6色谱柱洗脱程序
| 时间(min) | 流动相A(％V/V) | 流动相B(％V/V) |
| 0 | 50 | 50 |
| 20 | 50 | 50 |
| 30 | 25 | 75 |
| 50 | 25 | 75 |
| 51 | 50 | 50 |
| 60 | 50 | 50 |
稀释剂：40％甲酸-乙腈(7:3)
2)溶液的配制
对照品溶液：精密称取杂质H、起始物料1及中间体1适量，用稀释剂溶解并定量稀释成每1ml约含各杂质0.45μg的溶液，作为对照品溶液。
系统适用性溶液：准确称取非布司他样品50.0mg于离心管中，加入2mL对照品溶液，超声20分钟，离心30分钟(离心条件：25℃，13000r)，将上清液用0.45μm滤膜过滤即系统适用性溶液。
3)检测方法
精密量取系统适用性溶液10μL，注入高效液相色谱仪中，色谱图如图3所示。
4)实验结果
表7实施例3色谱图中杂质的分析结果
| 名称 | 保留时间min | 分离度 |
| 非布司他 | 18.048 | - |
| 杂质H | 19.928 | 2.81 |
| 起始物料1 | 26.310 | 9.83 |
| 中间体1 | 44.241 | 5.93 |
从表7可以看出，在该色谱系统中非布司他杂质H、起始物料1及中间体1之间保留时间差别明显，可以有效分离，符合要求，表明本方法专属性良好。
实施例4
1)色谱条件
流速：1.0ml/min
柱温：30℃
检测波长：320nm
色谱柱：Kromasil C18(5μm,4.6×250mm)
表8色谱柱洗脱程序
稀释剂：40％甲酸-乙腈(8:2)
2)溶液的配制
对照品溶液：精密称取杂质H、起始物料1及中间体1适量，用稀释剂溶解并定量稀释成每1ml约含各杂质0.45μg的溶液，作为对照品溶液。
系统适用性溶液：准确称取非布司他样品50.0mg于离心管中，加入2mL对照品溶液，超声20分钟，离心10分钟(离心条件：25℃，13000r)，将上清液用0.45μm滤膜过滤即系统适用性溶液。
3)检测方法
精密量取系统适用性溶液10μL，注入高效液相色谱仪中，色谱图如图4所示。
4)实验结果
表9实施例4色谱图中杂质的分析结果
| 名称 | 保留时间min | 分离度 |
| 非布司他 | 18.056 | - |
| 杂质H | 19.961 | 3.27 |
| 起始物料1 | 26.328 | 11.36 |
| 中间体1 | 44.264 | 6.12 |
从表9可以看出，在该色谱系统中非布司他杂质H、起始物料1及中间体1之间保留时间差别明显，可以有效分离，符合要求，表明本方法专属性良好。
实施例5
1)色谱条件
流速：1.0ml/min
柱温：30℃
检测波长：320nm
色谱柱：Kromasil C18(5μm,4.6×250mm)
表10色谱柱洗脱程序
| 时间(min) | 流动相A(％V/V) | 流动相B(％V/V) |
| 0 | 50 | 50 |
| 20 | 50 | 50 |
| 30 | 25 | 75 |
| 50 | 25 | 75 |
| 51 | 50 | 50 |
| 60 | 50 | 50 |
稀释剂：40％甲酸-乙腈(7:3)
2)溶液的配制
对照品溶液：精密称取杂质H、起始物料1及中间体1适量，用稀释剂溶解并定量稀释成每1ml约含各杂质0.45μg的溶液，作为对照品溶液。
系统适用性溶液：准确称取非布司他样品50.0mg于离心管中，加入2mL对照品溶液，超声20分钟，离心10分钟(离心条件：25℃，13000r)，将上清液用0.45μm滤膜过滤即系统适用性溶液。
供试品溶液：准确称取非布司他样品50.0mg于离心管中，加入2mL稀释剂，超声20分钟，离心10分钟(离心条件：25℃，13000r)，将上清液用0.45μm滤膜过滤即供试品溶液。
3)检测方法
精密量取系统适用性溶液、对照品溶液及供试品溶液各10μL，注入高效液相色谱仪中，色谱图如图5～7所示。
4)实验结果
表11实施例5色谱图中杂质的分析结果
从表5可以看出，在该色谱系统中非布司他杂质H、起始物料1及中间体1之间保留时间差别明显，可以有效分离，符合要求，表明本方法专属性良好。
方法学验证：
按照本领域常规试验方式对该检测方法进行方法学考察，主要考察该检测方法的专属性、检测限、定量限、线性、准确度及重复性。验证结果汇总见表6。
表12方法学验证结果汇总表
从表12中可以看出，本检测方法具有较高的灵敏度和专属性，重复性良好。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，优选的实施方式，不能理解为对本发明的限制。此检测方法的样品处理方法、流动相体系及色谱条件为在本发明时间、地点、环境及操作者限制下最优，而不限于此处理方法、流动相体系及色谱条件，对此样品处理方法、流动相体系的比例、浓度及色谱条件做适当修改、调整与等同替换，并不脱离本发明的技术思想和保护范围。
Claims (11)
1.一种非布司他中基因毒性杂质的检测方法，其特征在于：所述检测方法为高效液相色谱法，
色谱条件如下：
色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱；
流动相A是盐溶液；流动相B是乙腈；以盐溶液及乙腈作为流动相梯度洗脱；
检测器为紫外检测器，示差检测器，蒸发光散射检测器或二极管阵列检测器。
2.一种非布司他中基因毒性杂质的检测方法，其特征在于：所述检测方法还包括样品处理步骤，所述样品处理方法如下：
取本品用稀释剂进行溶解，超声并离心将杂质H、起始物料1及中间体1提取完全后，取上清液过滤作为供试品溶液进行分析。
3.根据权利要求1或2所述的检测方法，其特征在于：稀释剂为二甲基甲酰胺、四氢呋喃、乙腈或甲酸水溶液中一种或几种的混合；优选甲酸水溶液与乙腈的混合溶液。
4.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于：所述的甲酸水溶液中以体积百分比计算，甲酸的体积占30％～50％；优选为40％甲酸水溶液。
5.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于：所述40％甲酸水溶液与乙腈的比例为9:1～7:3。
6.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于：所述超声时间为10～20分钟；所述离心温度为20～30℃；转速为8000～13000r；所述离心时间为10～30分钟；所述过滤滤膜的孔径是0.22μm～0.45μm。
7.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：所述的盐溶液为乙酸钠溶液。
8.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：所述的盐溶液pH范围为2.9～3.1。
9.根据权利要求1-8任一项所述的检测方法，其特征在于：流动相为盐溶液与乙腈梯度洗脱，梯度洗脱0～20min时，盐溶液比例为体积比50％，乙腈比例为体积比50％；20～30min时，盐溶液比例由体积比50％降至25％，乙腈比例为体积比由50％升至75％；30～50min时，盐溶液比例为体积比25％，乙腈比例为体积比75％；50～51min时，盐溶液比例由体积比25％升至50％，乙腈比例由体积比75％降至50％；51～60min时，盐溶液比例为体积比50％，乙腈比例为体积比50％。
10.根据权利要求1-8任一项所述的检测方法，其特征在于：所述色谱柱选自KromasilC18、ODS-C18、Thermo Syncronis C18、Thermo Hypersil GOLD C18、Waters symmetryC18、Waters RP C18、Agilent XDB C18、Agilent Eclipse Plus C18；优选Kromasil C18。
11.根据权利要求1-8任一项所述的检测方法，其特征在于：检测器为二极管阵列检测器，检测波长为300～340nm；所述柱温为30～40℃，流速为0.9～1.1ml/min。
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