CN115356407B - 一种检测非布司他片中疑似基因毒性杂质的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种检测非布司他片中疑似基因毒性杂质的方法，包括以下步骤：将非布司他片供试品溶液或者分离度溶液以苯基键合硅胶色谱柱为固定相，采用高效液相色谱进行检测；检测条件包括：流动相包括流动相A与流动相B；所述流动相A选用酸性溶液；所述流动相B包括乙腈、甲醇和乙醇中的至少一种；高效液相色谱进行检测过程中采用梯度洗脱程序，所述流动相A与流动相B的体积比为0‑80：20‑100。本发明方法具有高效率、高灵敏度和高准确度的优点，能够将IMP‑07快速准确地检出。

Description

一种检测非布司他片中疑似基因毒性杂质的方法
技术领域
本发明涉及高效液相色谱相关技术领域，尤其是涉及一种检测非布司他片中疑似基因毒性杂质的方法。
背景技术
非布司他(FBT)是一种选择性黄嘌呤氧化酶抑制剂，临床上用于具有通风症状的高尿酸血症患者的治疗。其结构式为：
目前工业化成熟的非布司他合成路线如下所示：
在由起始物料SM1制备中间体IP01的过程中，可能发生中间体IP01水解副反应，生成2-(3-醛基-4-异丁氧基苯基)-4-甲基噻唑-5-羧酸(以下简称IMP-07)。其结构式为：
杂质IMP-07含有的醛基官能团，为疑似基因毒性结构杂质，由于毒性数据未知，根据ICH-M7指导原则，按TTC 1.5μg/天进行控制，非布司他片日服最大剂量为80mg，该疑似基因毒性杂质限度应为18ppm。杂质IMP-07的结构和理化性质与成品非布司他相近，在生产过程中不易去除，残留到成品的可能性较大，导致难以控制该杂质的日摄入量限度。目前国内文献尚未发现对该疑似基因毒性杂质检测方法的报道。
因此，急需找到一种检测该疑似基因毒性杂质的方法。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是：
提供一种检测非布司他片中疑似基因毒性杂质的方法。
为了解决所述技术问题，本发明采用的技术方案为：
一种检测非布司他片中疑似基因毒性杂质的方法，包括以下步骤：
将非布司他片供试品溶液或者分离度溶液以苯基键合硅胶色谱柱为固定相，采用高效液
相色谱进行检测；检测条件包括：
流动相包括流动相A与流动相B；
所述流动相A选用酸性溶液；
所述流动相B包括乙腈、甲醇和乙醇中的至少一种；
高效液相色谱进行检测过程中采用梯度洗脱程序，所述流动相A与流动相B的体积比为0-80：20-100。
所述检测非布司他片中杂质，命名为IMP-07，其结构如下：
根据本发明的实施方式，所述技术方案中的一个技术方案至少具有如下优点或有益效果之一：
非布司他与杂质IMP-07结构上均有羧基，非布司他pKa为3.3，需用酸性流动相体体系，因此本发明流动相A选用酸性溶液；优选的，本发明流动相A包括甲酸溶液、乙酸溶液和磷酸溶液中的至少一种；优选的，本发明流动相A选用磷酸溶液，考虑到磷酸紫外截至波长低，不易挥发。
非布司他片不易溶于水，溶于有机溶剂。流动相B包括乙腈、甲醇和乙醇中的至少一种。优选的，流动相B选用乙腈，乙腈具有洗脱能力强，粘度小、不易与产物进行反应等优点。
非布司他片主成分与杂质IMP-07结构相似，仅苯环上取代基不同(非布司他主成分为氰基，杂质IMP-07为醛基)，选用常规C18色谱柱难以将两者分离。本发明经研究，发现选用苯基柱可以实现两个组分的分离。
本发明通过优化方法梯度条件，使非布司他片的主成分与杂质IMP-07实现完全分离，确保杂质IMP-07测定不受主成分干扰，进一步提高含量测定结果的准确性。本发明方法具有高效率、高灵敏度和高准确度的优点，能够将IMP-07快速准确地检出。
根据本发明的一种实施方式，所述供试品溶液的制备方法包括如下步骤：混合非布司他片、溶剂和助溶剂，得到所述供试品溶液；所述助溶剂包括二甲基亚砜和N,N-二甲基甲酰胺中的至少一种。所述溶剂优选为乙腈，由于所述供试品溶液浓度较高(约10mg/ml)，非布司他片研磨后，只能部分于溶剂乙腈，需要助溶剂促进完全溶解。
根据本发明的一种实施方式，所述检测非布司他片中杂质的方法，还包括配制对照品溶液。所述对照品溶液的配制包括以下步骤：称定IMP-07对照品用95％乙腈稀释，摇匀，作为对照贮备液，取对照贮备液，用95％乙腈稀释，摇匀，作为对照品溶液。
根据本发明的一种实施方式，所述检测非布司他片中杂质的方法，还包括配制分离度溶液并进行高效液相色谱分析。
根据本发明的一种实施方式，分离度溶液的配制包括以下步骤：混合供试品溶液与对照贮备液，经过滤得到分离度溶液。
根据本发明的一种实施方式，所述梯度洗脱程序设置如下：
在所述梯度洗脱程序下，能够保证非布司他片的主产物与杂质IMP-07实现明显分离。通过调控不同时间段下的流动相A与流动相B的体积比，能够控制杂质IMP-07的出峰时间以及与相邻峰的分离度与信噪比。
根据本发明的一种实施方式，所述梯度洗脱程序设置如下：
在所述梯度洗脱程序下，能够进一步优化杂质IMP-07的分离，能够保证杂质IMP-07目标峰与相邻峰分离度和信噪比达到最佳，并使得梯度运行时间更短。
根据本发明的一种实施方式，所述检测条件中，柱温为25-45℃。
所述检测条件中，不同的柱温，会影响杂质IMP-07的分离，在柱温为25-45℃范围内，柱温越小，杂质IMP-07出峰越晚；柱温越大，杂质IMP-07出峰越早。
根据本发明的一种实施方式，所述检测条件中，流速为0.8-1.2ml/min。
所述检测条件中，不同的流速会影响杂质IMP-07目标峰与相邻峰的分离。在流速为0.8-1.2ml/min内，流速越小，杂质IMP-07目标峰与相邻峰分离度越小；流速越大，杂质IMP-07目标峰与相邻峰分离度越大。
根据本发明的一种实施方式，所述检测条件中，流动相A的pH范围为2.3～3.0。色谱柱常规使用的pH范围(2～8)，流动相A的酸溶液pH不能太低，因此本发明中酸溶液的pH控制在2.3～3.0。
根据本发明的一种实施方式，所述检测条件中，检测波长为317-327nm。
所述检测条件中，不同检测波长会影响对照品溶液信噪比，在检测波长为317-327nm范围内，超出这个范围，对照品溶液信噪比较小。
根据本发明的一种实施方式，以高效液相色谱进行检测包括以下步骤：
S1制备对照品溶液、供试品溶液、分离度溶液中的至少一种；
S2对步骤S1中制备的溶液通过高效液相色谱进行检测；
S3对检测结果进行分析。
通过所述高效液相色谱检测步骤，能够快速准确的检测杂质IMP-07。
根据本发明的一种实施方式，所述步骤S3中的分析包括定性和/或定量分析。本发明所述的检测非布司他片中杂质的方法，可以根据需要，进一步选择定性分析还是定量分析。
根据本发明的一种实施方式，所述分析采用的方法选自面积归一化法、自身对照法、内标法或外标法中的至少一种。可以根据需要选择分析方法。
根据本发明的实施方式，所述技术方案中的一个技术方案至少具有如下优点或有益效果之一：
本发明检测非布司他片中杂质的方法，通过设置梯度洗脱程序，能够保证非布司他片的主产物与杂质IMP-07实现明显分离。通过调控不同时间段下的流动相A与流动相B的体积比，能够控制杂质IMP-07的出峰时间以及与相邻峰的分离度与信噪比。
本发明检测非布司他片中杂质的方法，通过控制柱温、流速、进样量和检测波长，来调控杂质IMP-07目标峰与相邻峰的分离度以及对照品溶液信噪比。
本发明的其它特征和优点将在随后的说明书中阐述，部分地从说明书中变得显而易见，或者通过实施本发明而了解。
附图说明
本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：
图1为实施例1对照品溶液的高效液相色谱分析图。
图2为实施例1的分离度溶液的高效液相色谱分析图。
图3为实施例2的分离度溶液的高效液相色谱分析图。
图4为实施例3的分离度溶液的高效液相色谱分析图。
图5为实施例4的分离度溶液的高效液相色谱分析图。
图6为实施例5的分离度溶液的高效液相色谱分析图。
图7为实施例6的分离度溶液的高效液相色谱分析图。
图8为实施例7的分离度溶液的高效液相色谱分析图。
图9为实施例8的分离度溶液的高效液相色谱分析图。
图10为实施例9的分离度溶液的高效液相色谱分析图。
图11为实施例10的分离度溶液的高效液相色谱分析图。
图12为实施例11的分离度溶液的高效液相色谱分析图。
图13为实施例12的分离度溶液的高效液相色谱分析图。
图14为实施例13的分离度溶液的高效液相色谱分析图。
图15为对比例1的分离度溶液的高效液相色谱分析图。
图16为对比例2的分离度溶液的高效液相色谱分析图。
图17为实施例3中的对照品溶液中IMP-07的紫外吸收图谱。
图18为检测限测试的检测限溶液的高效液相色谱分析图。
图19为回收率测试的对照品溶液的高效液相色谱分析图。
图20为回收率测试的供试品溶液的高效液相色谱分析图。
图21为回收率测试的100％加标溶液的高效液相色谱分析图。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例，上述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
在本发明的描述中，如果有描述到第一、第二等只是用于区分技术特征为目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量或者隐含指明所指示的技术特征的先后关系。
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明的范围。
实施例和对比例中，非布司他片批号：FA016-200101T，规格：40mg。
实施例和对比例中，杂质IMP-07标准品批号：RS-A016-190705A。
实施例和对比例中，检测仪器为Agilent 1260高效液相色谱仪。
实施例1
实施例1的高效液相色谱梯度洗脱程序与检测条件设置如下：
柱温：30℃
进样量：10μl
流速：1.0ml/min
检测波长：322nm
洗脱梯度设置如表1：
表1
时间(min) PH2.6磷酸水溶液(％) 乙腈(％)
0 70 30
30 40 60
38 10 90
45 10 90
45.1 70 30
52 70 30
色谱柱：Thermo Beta Basic Phenyl(4.6×250mm，5μm)；
溶液配制：
精密称定IMP-07对照品36mg，置100ml量瓶中，用95％乙腈稀释至刻度，摇匀；量取0.5ml置于100ml量瓶中，用95％乙腈稀释至刻度，摇匀，作为对照贮备液；精密量取1ml对照贮备液，置于10ml量瓶中，用95％乙腈稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液。
取非布司他片10片，研碎，称取供试品约650mg，置于10ml量瓶中，加入少量95％乙腈使混悬，加入2ml DMSO助溶，再加入2ml IMP-07贮备液用95％乙腈稀释至刻度，摇匀，过滤，作为分离度溶液。
取非布司他片10片，研碎，称取供试品粉末约650mg，置于10ml量瓶中，加入少量95％乙腈使混悬，再加入2ml DMSO助溶，用95％乙腈稀释至刻度，摇匀，过滤，作为供试品溶液。
取对照品溶液，在上述色谱条件下进行高效液相色谱分析，如图1所示，从该色谱图中可以知道，杂质IMP-07的出峰位置在18.751min。其中，对照品溶液用于杂质峰定位。
取分离度溶液，在上述色谱条件下进行高效液相色谱分析，如图2所示，从该色谱图中可以知道，杂质IMP-07的出峰位置在18.830min。
实施例2
实施例2的高效液相色谱梯度洗脱程序与检测条件设置如下：
柱温：30℃
进样量：10μl
流速：1.0ml/min
检测波长：322nm
洗脱梯度设置如表2：
表2
时间(min) PH2.6磷酸水溶液(％) 乙腈(％)
0 80 20
40 30 70
48 10 90
48.1 80 20
55 80 20
色谱柱：Thermo Beta Basic Phenyl(4.6×250mm，5μm)
取实施例1对照品溶液、分离度溶液，其中，对照品溶液用于杂质峰定位。
在上述色谱条件下进行高效液相色谱分析，记录色谱图，分离度溶液图谱见图3。
实施例3
实施例3的高效液相色谱梯度洗脱程序与检测条件设置如下：
柱温：30℃
进样量：10μl
流速：1.0ml/min
检测波长：322nm
洗脱梯度设置如表3：
表3
色谱柱：Thermo Beta Basic Phenyl(4.6×250mm，5μm)
溶液配制：精密称定IMP-07对照品36mg，置100ml量瓶中，用95％乙腈稀释至刻度，摇匀；量取0.5ml置于100ml量瓶中，用95％乙腈稀释至刻度，摇匀，作为对照贮备液；精密量取1ml对照贮备液，置于10ml量瓶中，用95％乙腈稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液。取非布司他片10片，研碎，称取供试品约650mg，置于10ml量瓶中，加入少量95％乙腈使混悬，加入2ml DMSO助溶，再加入1ml IMP-07贮备液用95％乙腈稀释至刻度，摇匀，过滤，作为分离度溶液。
取对照品溶液、分离度溶液，在上述色谱条件下进行高效液相色谱分析，记录色谱图，分离度溶液图谱见图4。
统计实施例1-3的色谱图中的IMP-07保留时间、与相邻峰最小分离度和梯度运行时间于表4中，以分析不同的梯度洗脱程序设置对IMP-07的影响，结果如表4所示。
表4
名称 IMP-07保留时间 与相邻峰最小分离度 梯度运行时间
实施例1 18.830min 2.39 52min
实施例2 30.296min 1.86 55min
实施例3 18.652min 1.87 35min
实施例1～3三个梯度均能实现IMP-07与相邻峰的有效分离，考虑到效率优先(运行时间更短)，对环境更友好，优选实施例3的梯度。
实施例4
实施例4的高效液相色谱梯度洗脱程序与检测条件设置，与实施例3的区别仅在于柱温不同，实施例4高效液相色谱中柱温设置为25℃。
分别取实施例3中对照品溶液、分离度溶液，在上述色谱条件下进行高效液相色谱分析，记录色谱图，分离度溶液图谱见图5。
实施例5
实施例5的高效液相色谱梯度洗脱程序与检测条件设置，与实施例3的区别仅在于柱温不同，实施例5高效液相色谱中柱温设置为45℃。
分别取实施例3中对照品溶液、分离度溶液，在上述色谱条件下进行高效液相色谱分析，记录色谱图，分离度溶液图谱见图6。
统计实施例3-5的色谱图中的IMP-07保留时间、与相邻峰最小分离度和IMP-07信噪比于表5中，以分析不同的柱温设置对IMP-07的影响，结果如表5所示。
表5
名称 IMP-07保留时间 与相邻峰最小分离度 IMP-07信噪比
实施例3 18.652min 1.87 86.2
实施例4 19.286min 1.52 73.0
实施例5 16.613min 2.08 82.4
实施例3～5三个柱温均能实现IMP-07与相邻峰的有效分离，考虑到环境温度与色谱柱寿命，优选实施例3的柱温。
实施例6
实施例6的高效液相色谱梯度洗脱程序与检测条件设置，与实施例3的区别仅在于流速不同，实施例6高效液相色谱中流速设置为0.8ml/min。
分别取实施例3中对照品溶液、分离度溶液，在上述色谱条件下进行高效液相色谱分析，记录色谱图，分离度溶液图谱见图7。
实施例7
实施例7的高效液相色谱梯度洗脱程序与检测条件设置，与实施例3的区别仅在于流速不同，实施例7高效液相色谱中流速设置为1.2ml/min。
分别取实施例3中对照品溶液、分离度溶液，在上述色谱条件下进行高效液相色谱分析，记录色谱图，分离度溶液图谱见图8。
统计实施例3和实施例6-7的色谱图中的IMP-07保留时间、与相邻峰最小分离度和IMP-07信噪比于表6中，以分析不同的流速设置对IMP-07的影响，结果如表6所示。
表6
实施例3、6、7三个流速均能实现IMP-07与相邻峰的有效分离。
实施例8
实施例8的高效液相色谱梯度洗脱程序与检测条件设置，与实施例3的区别仅在于检测波长不同，实施例8高效液相色谱中检测波长设置为317nm。
分别取实施例3中对照品溶液、分离度溶液，在上述色谱条件下进行高效液相色谱分析，记录色谱图，分离度溶液图谱见图9。
实施例9
实施例9的高效液相色谱梯度洗脱程序与检测条件设置，与实施例3的区别仅在于检测波长不同，实施例9高效液相色谱中检测波长设置为327nm。
分别取实施例3中对照品溶液、分离度溶液，在上述色谱条件下进行高效液相色谱分析，记录色谱图，分离度溶液图谱见图10。
统计实施例3和实施例8-9的色谱图中的IMP-07保留时间、与相邻峰最小分离度和IMP-07信噪比于表7中，以分析不同的检测波长对IMP-07的影响，结果如表7所示。
表7
名称 IMP-07保留时间 与相邻峰最小分离度 IMP-07信噪比
实施例3 18.652min 1.87 86.2
实施例8 18.371min 2.08 82.4
实施例9 18.385min 1.98 81.7
实施例3、8、9三个检测波长均能使IMP-07与相邻峰完全分离，且IMP-07信噪比相近，选实施例3的检测波长。
实施例10
实施例10的高效液相色谱梯度洗脱程序与检测条件设置，与实施例3的区别仅在于流动相磷酸水溶液pH不同，实施例10高效液相色谱中流动相磷酸水溶液为pH3.0磷酸水溶液。
分别取实施例3中对照品溶液、分离度溶液，在上述色谱条件下进行高效液相色谱分析，记录色谱图，分离度溶液图谱见图11。
实施例11
实施例11的高效液相色谱梯度洗脱程序与检测条件设置，与实施例3的区别仅在于流动相磷酸水溶液pH不同，实施例11高效液相色谱中流动相磷酸水溶液为pH2.3磷酸水溶液。
分别取实施例3中对照品溶液、分离度溶液，在上述色谱条件下进行高效液相色谱分析，记录色谱图，分离度溶液图谱见图12。
统计实施例3和实施例10-11的色谱图中的IMP-07保留时间、与相邻峰最小分离度和IMP-07信噪比于表8中，以分析不同的pH对IMP-07的影响，结果如表8所示。
表8
名称 IMP-07保留时间 与相邻峰最小分离度 IMP-07信噪比
实施例3 18.652min 1.87 86.2
实施例10 18.101min 2.06 80.4
实施例11 18.499min 1.50 100.5
实施例3、10的流动相均可使IMP-07与相邻峰完全分开，且IMP-07信噪比相近，实施例11虽然IMP-07信噪比最大，但IMP-07与相邻峰分离度较小，优选实施例3的检测条件。
实施例12
实施例12的高效液相色谱梯度洗脱程序与检测条件设置，与实施例3的区别仅在于流动相A采用甲酸水溶液，实施例12高效液相色谱中流动相A为甲酸水溶液(pH2.6)。
分别取实施例3中对照品溶液、分离度溶液，在上述色谱条件下进行高效液相色谱分析，记录色谱图，分离度溶液图谱见图13。
实施例13
实施例13的高效液相色谱梯度洗脱程序与检测条件设置，与实施例3的区别仅在于流动相A采用乙酸水溶液，实施例12高效液相色谱中流动相A为乙酸水溶液(pH2.6)。
分别取实施例3中对照品溶液、分离度溶液，在上述色谱条件下进行高效液相色谱分析，记录色谱图，分离度溶液图谱见图14。
统计实施例3和实施例12-13的色谱图中的IMP-07保留时间、与相邻峰最小分离度和IMP-07信噪比于表9中，以分析不同的酸性溶液对IMP-07的影响，结果如表9所示。
表9
名称 IMP-07保留时间 与相邻峰最小分离度 IMP-07信噪比
实施例5 18.652min 1.87 86.2
实施例12 18.706min 1.71 60.3
实施例13 18.720min 1.69 71.2
实施例3、12、13的为流动相A采用不同酸水溶液，均可使IMP-07与相邻峰完全分开，且IMP-07信噪比均满足要求。
对比例1
对比例1的高效液相色谱梯度洗脱程序与检测条件设置如下：
柱温：30℃
进样量：10μl
流速：1.0ml/min
检测波长：322nm
洗脱梯度设置如表10：
表10
时间(min) PH2.6磷酸水溶液(％) 乙腈(％)
0 70 30
30 40 60
38 10 90
45 10 90
45.1 70 30
52 70 30
色谱柱：ACE Excel C18-AR(4.6×250mm，5μm)。
溶液配制：精密称定IMP-07对照品36mg，置100ml量瓶中，用95％乙腈稀释至刻度，摇匀；量取0.5ml置于100ml量瓶中，用95％乙腈稀释至刻度，摇匀，作为对照贮备液；精密量取1ml对照贮备液，置于10ml量瓶中，用95％乙腈稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液。取非布司他片10片，研碎，称取供试品约650mg，置于10ml量瓶中，加入少量95％乙腈使混悬，加入2ml DMSO助溶，再加入2ml IMP-07贮备液用95％乙腈稀释至刻度，摇匀，过滤，作为分离度溶液。
取对照品溶液、分离度溶液，在上述色谱条件下进行高效液相色谱分析，记录色谱图，结果见图15。
对比例1由于选用了ACE Excel C18-AR色谱柱，导致杂质IMP-07与主成分峰重合。
对比例2
实施例2的高效液相色谱梯度洗脱程序与检测条件设置，与实施例1的区别仅在于色谱柱不同，实施例2高效液相色谱中色谱柱为YMC Triart Phenyl(4.6×250mm，5μm)。
取实施例1中对照品溶液、分离度溶液，在上述色谱条件下进行高效液相色谱分析，记录色谱图，结果见图16。
对比例2选用了YMC Triart Phenyl色谱柱，虽然杂质IMP-07与主成分峰没有完全重合，但两者分离不好。
性能测试：
对实施例1、对比例1和对比例2的色谱图进行对比，将色谱图中的IMP-07保留时间、与相邻峰最小分离度统计如表11中。
表11
名称 IMP-07保留时间 与相邻峰最小分离度
对比例1 28.814min 与主成分峰重合
对比例2 25.232min 1.96
实施例1 18.830min 2.39
从表11可以知道。对比例1由于选用了ACE Excel C18-AR色谱柱，导致杂质IMP-07与主成分峰重合；对比例2选用了YMC Triart Phenyl色谱柱，虽然杂质IMP-07与主成分峰没有完全重合，但两者分离不好。
因此本发明选择实施例1的苯基键合硅胶色谱柱为固定相。
对IMP-07标准溶液进行紫外吸收测试：
取实施例3的对照品溶液，具体为：称取IMP-07对照品36mg，精密称定，置100ml量瓶中，用95％乙腈稀释至刻度，摇匀；量取0.5ml置于100ml量瓶中，用95％乙腈稀释至刻度，摇匀，作为对照贮备液；精密量取1ml对照贮备液，置于10ml量瓶中，用95％乙腈稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液。
对对照品溶液中的IMP-07进行全波长扫描，其紫外吸收图如图17所示，确认其在322nm处有最大吸收。
检测限测试：
以实施例3的高效液相色谱梯度洗脱程序与检测条件进行以下测试，具体为：称取IMP-07对照品36mg，精密称定，置100ml量瓶中，用95％乙腈稀释至刻度，摇匀；量取0.5ml置于100ml量瓶中，用95％乙腈稀释至刻度，摇匀，作为对照贮备液；精密量取1ml对照贮备液，置于10ml量瓶中，用95％乙腈稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液。
精密量取对照品溶液3ml，置于10ml容量瓶中，用95％乙腈稀释至刻度，摇匀；精密量取3ml置于10ml量瓶中，用95％乙腈稀释至刻度，摇匀，作为检测限溶液。
分别取对照品溶液和检测限溶液，在上述色谱条件下进行高效液相色谱分析，记录色谱图，检测限溶液结果见图18。图18中IMP-07峰保留时间为18.573min，信噪比为5.6，检测限符合要求。
回收率测试：
以实施例3的的高效液相色谱梯度洗脱程序与检测条件进行以下测试，具体为：精密称定IMP-07对照品36mg，置100ml量瓶中，用95％乙腈稀释至刻度，摇匀；量取0.5ml置于100ml量瓶中，用95％乙腈稀释至刻度，摇匀，作为对照贮备液；精密量取1ml对照贮备液，置于10ml量瓶中，用95％乙腈稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液。
取非布司他片10片，研碎，称取供试品粉末约650mg，置于10ml量瓶中，加入少量95％乙腈使混悬，再加入2ml DMSO助溶，用95％乙腈稀释至刻度，摇匀，过滤，作为供试品溶液。
取非布司他片10片，研碎，称取供试品粉末约650mg，置于10ml量瓶中，加入少量95％乙腈使混悬，再加入2ml DMSO助溶，精密量取对照贮备液1ml至同一量瓶中，用95％乙腈稀释至刻度，摇匀，过滤，平行配制6份，作为100％加标溶液1～6。
分别取对照品溶液、供试品溶液和100％加标溶液，在上述色谱条件下进行高效液相色谱分析，记录色谱图，对照品溶液、供试品溶液和100％加标溶液图谱分别见图19、20和21，结果见下表12，表12为非布司他片100％加标回收率结果。从表12可以看出，6份100％加标溶液的回收率均小于120％，准确度符合要求。
表12
以上仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等同变换，或直接或间接运用在相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

Claims (6)

1.一种检测非布司他片中疑似基因毒性杂质的方法，其特征在于：包括以下步骤：
测定非布司他片供试品溶液中非布司他片的质量，将非布司他片供试品溶液和分离度溶液用苯基键合硅胶色谱柱进行分离，所述色谱柱规格为4.6×250mm，5μm，采用高效液相色谱进行检测；检测条件包括：
流动相包括流动相A与流动相B；
所述流动相A选用酸性溶液，pH为2.3~3.0；
所述流动相B为乙腈和/或甲醇；
高效液相色谱进行检测过程中采用梯度洗脱程序；
所述分离度溶液的制备方法包括如下步骤：混合供试品溶液与对照贮备液，经过滤得到分离度溶液；
供试品溶液的制备方法包括如下步骤：混合非布司他片、溶剂和助溶剂，得到供试品溶液；
所述溶剂为乙腈；
所述助溶剂包括二甲基亚砜和N,N-二甲基甲酰胺中的一种；
对照储备液的制备方法包括如下步骤：将非布司他片中疑似基因毒性杂质的对照品配制成溶液，得到对照储备液；
所述非布司他片中疑似基因毒性杂质的结构式如下：
；
所述梯度洗脱程序为第一洗脱程序或者第二洗脱程序或者第三洗脱程序：
第一洗脱程序：
洗脱时间，流动相A与流动相B的体积比
0，70：30
30，40：60
38，10：90
45，10：90
45.1，70：30
52，70：30；
第二洗脱程序：
洗脱时间，流动相A与流动相B的体积比
0，80：20
40，30：70
48，10：90
48.1，80：20
55，80：20；
第三洗脱程序：
洗脱时间，流动相A与流动相B的体积比
0，65：35
20，55：45
21，0：100
27，0：100
27.1，65：35
35，65：35。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述检测条件中，柱温为25-45℃。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述检测条件中，流速为0.8-1.2 ml/min。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述检测条件中，检测波长为317-327 nm。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：还包括将制备得到的对照储备液、供试品溶液、分离度溶液通过高效液相色谱进行检测并对检测结果进行分析的步骤，分析包括定性和/或定量分析。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述分析采用的方法选自面积归一化法、自身对照法、内标法或外标法中的一种。
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