CN115541734A - 一种正相色谱法测定保护氨基酸对映异构体的方法 - Google Patents

一种正相色谱法测定保护氨基酸对映异构体的方法 Download PDF

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CN115541734A CN202210832828.8A CN202210832828A CN115541734A CN 115541734 A CN115541734 A CN 115541734A CN 202210832828 A CN202210832828 A CN 202210832828A CN 115541734 A CN115541734 A CN 115541734A
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Abstract

本发明提供一种正相色谱法测定保护氨基酸对映异构体的方法。本发明通用性较强，色谱方法比较稳定，灵敏度较高，耐用性较好，且对起始物料中四种保护氨基酸的对映异构体检测皆适用；使用的溶剂正己烷，无水乙醇和三氟乙酸均为常用试剂，容易获得。不同试验室进行该色谱条件分析方法转移，均满足要求。

Description

一种正相色谱法测定保护氨基酸对映异构体的方法
技术领域
本发明涉及药物分析技术领域，具体涉及一种正相色谱法测定保护氨基酸对映异构体的方法。
背景技术
醋酸西曲瑞克，又常称为西曲瑞克，是一种有效的黄体酮释放激素抑制素受体拮抗剂，它能控制卵巢的刺激作用，预防不成熟卵泡过早排出，帮助受孕；西曲瑞克单剂量方案可减少注射次数，更方便使用。目前国内注射用醋酸西曲瑞克仅有原研药品在售，竞争格局良好，是辅助生殖相关指南推荐用药，临床前景较好。醋酸西曲瑞克一种合成的十肽，其化学名称为：N-乙酰-3-(2-萘)-D-丙氨酰-p-氯-D-苯丙氨酰-3-(3-吡啶基)-D-丙氨酰-L-丝氨酰-L-酪氨酰-N5-氨甲酰-D-鸟氨酰-L-亮氨酰-L-精氨酰-L-脯氨酰-D-丙氨酰胺醋酸盐。
其结构式为：
Figure BDA0003746190550000011
可以看出，醋酸西曲瑞克肽链中含有多个手性中心，而这些手性中心是由合成醋酸西曲瑞克的多个氨基酸起始原料引进的。这些氨基酸起始原料中均存在对映异构体杂质风险，若对起始原料的手性杂质不加以控制，会引入到终产品中，导致终产品精制困难，难以达到质控标准，生产成本增加。
因此，开发出能有效检出氨基酸对映异构体的分析方法，对醋酸西曲瑞克的生产和提纯具有重要的指导意义，并建立严格的质控标准，从而对降低终产品提纯难度、提高产品质量有积极意义。
目前对于多肽保护氨基酸对映体的测定分析方法文献较少，专利CN111505161A公开了一种保护氨基酸对映异构体检测方法，是采用反相色谱方法对Fmoc保护氨基酸的对映体进行测定，使用的色谱柱为纤维素-三(3，5-二甲基苯基氨基甲酸酯)色谱柱，流动相为0.1％三氟乙酸水溶液-乙腈体系。申请人尝试用该方法检测醋酸西曲瑞克的多个氨基酸起始原料，发现并不适用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种正相色谱法测定保护氨基酸对映异构体的方法，该色谱条件对醋酸西曲瑞克的四种保护氨基酸起始物料的对映异构体检测皆适用。能够实现主峰与对映异构体的有效分离，分离效果突出，专属性好。
实现上述发明目的的技术方案是：
本发明提供一种正相色谱法测定保护氨基酸对映异构体的方法，包括以下步骤：
(1)样品配制：
供试品溶液制备：精密称取供试品10mg，置20ml量瓶中，用稀释剂溶解并稀释至刻度线，摇匀，即得；
对照品溶液制备：精密称取保护氨基酸对映异构体，用稀释剂溶解并稀释成浓度为0.03mg/ml的溶液，作为对照品贮备液；精密量取对照品贮备液1ml，置20ml量瓶中，用稀释剂溶解并稀释至刻度线，摇匀，即得；
灵敏度溶液制备：精密量取对照品溶液1ml，置10ml量瓶中，用稀释剂溶解并稀释至刻度线，摇匀，即得；
系统适用性溶液制备：精密称取供试品10mg，置20ml量瓶中，加入对照品贮备液1ml，用稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀，即得；
(2)色谱条件设置：
色谱柱：直链淀粉-三(3，5-二甲基苯基氨基甲酸酯)手性固定相为色谱柱；
流动相：正己烷-无水乙醇-三氟乙酸，体积比为(75～90):(10～25):0.1；
柱温：30～40℃；
流速：0.3～1.0ml/min；
进样体积：5～20μl；
检测波长：210～270nm；
(3)检测和计算：
精密量取系统适用性溶液，灵敏度溶液、对照品溶液和供试品溶液，分别注入液相色谱仪，记录色谱图；通过外标法计算主峰和对映异构体的峰面积。
根据本发明实施方案，所述稀释剂为无水乙醇和正己烷的混合溶液，其中无水乙醇和正己烷体积比为60：40。
根据本发明实施方案，柱温为30～45℃；例如：30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、41℃、42℃、43℃、44℃、45℃，优选为39～41℃。
根据本发明实施方案，所述灵敏度溶液中，峰高的信噪比大于10。
根据本发明实施方案，所述保护氨基酸选自Ac-D-2-Nal-OH、Fmoc-D-Phe(4-Cl)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-D-Ala-OH中的一种。
根据本发明实施方案，所述保护氨基酸选自Ac-D-2-Nal-OH时，其色谱条件设置：流动相：正己烷-无水乙醇-三氟乙酸，体积比为90:10:0.1；流速为0.8ml；波长为264nm。
根据本发明实施方案，所述保护氨基酸选自Fmoc-D-Phe(4-Cl)-OH时，其色谱条件设置：流动相：正己烷-无水乙醇-三氟乙酸，体积比为85:15:0.1；流速为1.0ml；波长为264nm。
根据本发明实施方案，所述保护氨基酸选自Fmoc-Arg(Pbf)-OH时，其色谱条件设置：流动相：正己烷-无水乙醇-三氟乙酸，体积比为75:25:0.1；流速为1.0ml；波长为220nm。
根据本发明实施方案，所述保护氨基酸选自Fmoc-D-Ala-OH时，其色谱条件设置：流动相：正己烷-无水乙醇-三氟乙酸，体积比为80:20:0.1；流速为0.3ml；波长为264nm。
本发明还提供一种利用上述正相色谱法测定保护氨基酸对映异构体的方法测定醋酸西曲瑞克起始原料药中保护氨基酸的含量，所述保护氨基酸选自Ac-D-2-Nal-OH、Fmoc-D-Phe(4-Cl)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-D-Ala-OH中的一种，其对映异构体的含量不高于0.3％。
本发明的有益效果是：
1、本发明采用的流动相是正己烷，无水乙醇，正己烷为惰性试剂，很少与样品会发生反应；选择无水乙醇作为极性试剂，洗脱能力较好，且色谱系统压力较小。同时流动相系统中使用三氟乙酸酸性添加剂尽量控制在0.2％以下，从而避免了因为长期使用酸性流动相而造成手性色谱柱和仪器被腐蚀的问题。
2、本发明对醋酸西曲瑞克起始物料一种保护氨基酸Ac-D-2-Nal-OH中可能的降解杂质和工艺杂质，如H-D-2-Nal-OH，2-溴甲基萘和乙酰氨基丙二酸二乙酯等进行了杂质峰定位，本发明采用了等度洗脱的方式进行检测，通过优化设置合理的洗脱条件，使这些杂质能够准确定位，与对映异构体Ac-L-2-Nal-OH的分离度符合要求，并且能快速被洗脱出来；不干扰样品中对映异构体的检测，并且不影响同一色谱系统其它批次样品的检测。避免了对映异构体Ac-L-2-Nal-OH与样品中其它杂质不完全分离，与主峰分离度不符合要求而影响峰面积积分，导致检测结果不准确的问题。
3、本发明通过对流动相配比、对照品溶液以及洗脱条件进行综合设计和优化，本发明的分析方法在液相色谱系统运行过程中，基线平稳，空白溶剂和其它杂质基本无干扰本品中对映异构体的检测，杂质分离效果突出，专属性好，试验数据证明，检出限可达到0.012％，灵敏度极高，检测结果可为产品研发、生产和提纯提供可靠有效的信息，为建立保护氨基酸质控标准打下了坚实基础，为终产品的质量控制起到了积极作用。
附图说明
图1为实施例1中Ac-D-2-Nal-OH及对映异构体系统适用性谱图。
图2为实施例2中Fmoc-D-Phe(4-Cl)-OH及对映异构体系统适用性谱图。
图3为实施例3中Fmoc-Arg(Pbf)-OH及对映异构体系统适用性谱图。
图4为实施例4中Fmoc-D-Ala-OH及对映异构体系统适用性谱图。
图5为对比例中Fmoc-D-Ala-OH及对映异构体系统适用性谱图。
图6为实施例5中Ac-L-2-Nal-OH线性趋势图。
具体实施方式
下面结合具体实施例和附图对本发明作进一步详述，以下实施例只是描述性的，不是限定性的，不能以此限定本发明的保护范围，如无特别说明，所用原料均可通过市售或自制获得。
实施例1(正相)(XQRK-SM-10)
一种正相色谱法测定醋酸西曲瑞克起始原料Ac-D-2-Nal-OH对映异构体的方法，具体包含如下步骤：
(1)色谱条件设置：采用以硅胶表面涂敷有直链淀粉-三(3，5-二甲基苯基氨基甲酸酯)手性固定相为色谱柱，柱长25cm，内径4.6mm，膜厚5μm；柱温为40℃，正己烷-无水乙醇-三氟乙酸(90：10：0.1)为流动相进行等度洗脱；流速为每分钟0.8ml；检测波长为264nm，进样体积10μl。
(2)供试品溶液制备：取本品约10mg，精密称定，置20ml量瓶中，加溶剂无水乙醇-正己烷(60:40)溶解并稀释至刻度，摇匀，即得；
(3)对照品溶液制备：取对映异构体Ac-2-Nal-OH对照品适量，精密称定，加溶剂溶解并稀释成每1ml含0.03mg的溶液，作为对照品贮备液；精密量取对照品贮备液1ml，置20ml量瓶中，用溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀，即得；
(4)灵敏度溶液制备：精密量取对照品溶液5ml，置10ml量瓶中，用溶剂稀释至刻度，摇匀，即得；
(5)系统适用性溶液制备：取本品约10mg，精密称定，置20ml量瓶中，加入对照品贮备液1ml，溶解并稀释至刻度，摇匀，即得；
(6)检测：精密量取系统适用性溶液，灵敏度溶液、对照品溶液和供试品溶液，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。系统适用性溶液中Ac-D-2-Nal-OH和Ac-2-Nal-OH依次出峰，对映异构体Ac-2-Nal-OH与其相邻峰分离度应符合要求；灵敏度溶液中，峰高的信噪比应大于10。
(7)供试品溶液色谱图中，如有与Ac-2-Nal-OH保留时间一致的色谱峰，按外标法以峰面积计算，含量不得过0.3％。
表1 Ac-D-2-Nal-OH和Ac-2-Nal-OH化学结构式
Figure BDA0003746190550000051
Ac-D-2-Nal-OH及对映异构体Ac-2-Nal-OH系统适用性检测结果如表2，对应附图1。
表2
化合物名称 Ac-D-2-Nal-OH Ac-2-Nal-OH
出峰时间min 17.499 23.963
峰面积比％ 99.673 0.305
分离度 / 8.3
从图1的色谱图和表2的结果可以得到，对映异构体Ac-2-Nal-OH和主成分Ac-D-2-Nal-OH的分离度为8.3，大于1.5，说明本发明能将Ac-D-2-Nal-OH及对映异构体Ac-2-Nal-OH有效分离。
实施例2(正相)(XQRK-SM-9)
一种正相色谱法测定醋酸西曲瑞克起始原料Fmoc-D-Phe(4-Cl)-OH对映异构体的方法，具体包含如下步骤：
(1)色谱条件设置：采用以硅胶表面涂敷有直链淀粉-三(3，5-二甲基苯基氨基甲酸酯)手性固定相为色谱柱，柱长25cm，内径4.6mm，膜厚5μm；柱温为40℃，以正己烷-无水乙醇-三氟乙酸(85:15:0.1)为流动相进行洗脱；流速为每分钟1.0ml，检测波长为264nm，进样体积10μl；
(2)供试品溶液制备：取本品约10mg，精密称定，置20ml量瓶中，加溶剂无水乙醇-正己烷(60:40)溶解并稀释至刻度，摇匀，即得；
(3)对照品溶液制备：取Fmoc-L-Phe(4-Cl)-OH对照品适量，精密称定，加溶剂溶解并稀释成每1ml含0.03mg的溶液，作为对照品贮备液；精密量取对照品贮备液1ml，置20ml量瓶中，用溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀，即得；
(4)灵敏度溶液制备：精密量取对照品溶液1ml，置10ml量瓶中，用溶剂稀释至刻度，摇匀，即得；
(5)系统适用性溶液制备：取本品约10mg，精密称定，置20ml量瓶中，加入对照品贮备液1ml，溶解并稀释至刻度，摇匀，即得；
(6)检测：精密量取系统适用性溶液，灵敏度溶液、对照品溶液和供试品溶液，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。系统适用性溶液中Fmoc-D-Phe(4-Cl)-OH和Fmoc-L-Phe(4-Cl)-OH依次出峰，Fmoc-L-Phe(4-Cl)-OH与其相邻峰分离度应符合要求；灵敏度溶液中，峰高的信噪比应大于10；
(7)供试品溶液色谱图中，如有与Fmoc-L-Phe(4-Cl)-OH保留时间一致的色谱峰，按外标法以峰面积计算，不得过0.3％。
表3 Fmoc-D-Phe(4-Cl)-OH和Fmoc-L-Phe(4-Cl)-OH化学结构式
Figure BDA0003746190550000061
Fmoc-D-Phe(4-Cl)-OH及对映异构体Fmoc-L-Phe(4-Cl)-OH系统适用性检测结果如表4，对应附图2。
表4
化合物名称 Fmoc-D-Phe(4-Cl)-OH Fmoc-L-Phe(4-Cl)-OH
出峰时间min 13.557 18.493
峰面积比％ 99.661 0.339
分离度 / 7.8
从图2的色谱图和表4的数据结果可以得到，对映异构体Fmoc-L-Phe(4-Cl)-OH和主成分Fmoc-D-Phe(4-Cl)-OH的分离度为7.8，大于1.5，说明本发明能将物料Fmoc-D-Phe(4-Cl)-OH及对映异构体Fmoc-L-Phe(4-Cl)-OH有效分离。
实施例3(正相)(XQRK-SM-3)
一种正相色谱法测定醋酸西曲瑞克起始原料Fmoc-Arg(Pbf)-OH对映异构体的方法，具体包含如下步骤：
(1)色谱条件设置：采用以硅胶表面涂敷有直链淀粉-三(3，5-二甲基苯基氨基甲酸酯)手性固定相为色谱柱，柱长25cm，内径4.6mm，膜厚5μm；柱温为40℃，无水乙醇-正己烷-三氟乙酸(25:75:0.1)为流动相进行等度洗脱；流速为每分钟1.0ml；检测波长为220nm，进样体积10μl；
(2)供试品溶液制备：取本品约10mg，精密称定，置20ml量瓶中，加溶剂无水乙醇-正己烷-三氟乙酸(60:40:0.1)溶解并稀释至刻度，摇匀，即得；
(3)对照品溶液制备：取对映异构体Fmoc-D-Arg(Pbf)-OH对照品适量，精密称定，加溶剂溶解并稀释成每1ml含0.03mg的溶液，作为对照品贮备液；精密量取对照品贮备液1ml，置20ml量瓶中，用溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。
(4)灵敏度溶液制备：精密量取对照品溶液1ml，置10ml量瓶中，用溶剂稀释至刻度，摇匀，即得；
(5)系统适用性溶液制备：取本品约10mg，精密称定，置20ml量瓶中，加入对照品贮备液1ml，溶解并稀释至刻度，摇匀，即得；
(6)检测：精密量取系统适用性溶液，灵敏度溶液、对照品溶液和供试品溶液，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。系统适用性溶液中Fmoc-Arg(Pbf)-OH和Fmoc-D-Arg(Pbf)-OH依次出峰，对映异构体Fmoc-D-Arg(Pbf)-OH与其相邻峰分离度应符合要求；灵敏度溶液中，峰高的信噪比应大于10。且连续6针的对照品溶液峰面积的RSD值不得大于2.0％。
(7)供试品溶液色谱图中，如有与Fmoc-D-Arg(Pbf)-OH保留时间一致的色谱峰，按外标法以峰面积计算，不得过0.3％。
表5Fmoc-Arg(Pbf)-OH和Fmoc-D-Arg(Pbf)-OH化学结构式
Figure BDA0003746190550000081
Fmoc-Arg(Pbf)-OH及对映异构体Fmoc-D-Arg(Pbf)-OH系统适用性检测结果如表6，对应附图2。
表6
化合物名称 Fmoc-Arg(Pbf)-OH Fmoc-D-Arg(Pbf)-OH
出峰时间min 9.172 12.752
峰面积比％ 99.546 0.189
分离度 / 4.0
从图3的色谱图和表6的结果可以得到，对映异构体Fmoc-D-Arg(Pbf)-OH和主成分Fmoc-Arg(Pbf)-OH的分离度为4.0，大于1.5，说明本发明能将Fmoc-Arg(Pbf)-OH及对映异构体Fmoc-D-Arg(Pbf)-OH有效分离。
实施例4(正相)(XQRK-SM-1)
一种正相色谱法测定醋酸西曲瑞克起始原料Fmoc-D-Ala-OH对映异构体的方法，具体包含如下步骤：
(1)色谱条件设置：采用以硅胶表面涂敷有直链淀粉-三(3，5-二甲基苯基氨基甲酸酯)手性固定相为色谱柱，柱长25cm，内径4.6mm，膜厚5μm；柱温为40℃，无水乙醇-正己烷-三氟乙酸(20:80:0.1)为流动相进行等度洗脱；流速为每分钟0.3ml；检测波长为264nm，进样体积10μl；
(2)供试品溶液制备：取本品约10mg，精密称定，置20ml量瓶中，加溶剂无水乙醇-正己烷(60:40)溶解并稀释至刻度，摇匀，即得；
(3)对照品溶液制备：取对映异构体Fmoc-L-Ala-OH对照品适量，精密称定，加溶剂溶解并稀释成每1ml含0.03mg的溶液，作为对照品贮备液；精密量取对照品贮备液1ml，置20ml量瓶中，用溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀即得；
(4)灵敏度溶液制备：精密量取对照品溶液1ml，置10ml量瓶中，用溶剂稀释至刻度，摇匀，即得；
(5)系统适用性溶液制备：取本品约10mg，精密称定，置20ml量瓶中，加入对照品贮备液1ml，溶解并稀释至刻度，摇匀，即得；
(6)检测：精密量取系统适用性溶液，灵敏度溶液、对照品溶液和供试品溶液，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。系统适用性溶液中Fmoc-L-Ala-OH和Fmoc-D-Ala-OH依次出峰，对映异构体Fmoc-L-Ala-OH与其相邻峰分离度应符合要求；灵敏度溶液中，峰高的信噪比应大于10。
(7)供试品溶液色谱图中，如有与Fmoc-L-Ala-OH保留时间一致的色谱峰，按外标法以峰面积计算，不得过0.3％。
表7 Fmoc-D-Ala-OH和Fmoc-L-Ala-OH化学结构式
Figure BDA0003746190550000091
Fmoc-D-Ala-OH及对映异构体Fmoc-L-Ala-OH系统适用性检测结果如表8，对应附图2。
表8
化合物名称 Fmoc-L-Ala-OH Fmoc-D-Ala-OH
出峰时间min 16.367 17.697
峰面积比％ 0.378 99.622
分离度 / 2.2
从图4的色谱图和表8的结果可以得到，对映异构体Fmoc-L-Ala-OH和主成分Fmoc-D-Ala-OH的分离度为2.2，大于1.5，说明本发明能将Fmoc-D-Ala-OH及对映异构体Fmoc-L-Ala-OH有效分离。
对比例
专利CN111505161A中采用纤维素-三(3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯)为色谱柱，以三氟乙酸：水＝1:1000为流动相A，柱温25℃，乙腈为流动相B，流动相A：流动相B＝80：20(V/V)进行等度洗脱25min，对Fmoc系列保护氨基酸的对映异构体进行检测。本发明通过重复试验条件发现，该液相条件和样品检测时，本发明中Ac基团和Fmoc基团保护氨基酸在上述条件下，目标峰拖尾现象比较严重；见图5为Fmoc-D-Ala-OH及对映异构体Fmoc-L-Ala-OH混合溶液色谱图，目标峰Fmoc-L-Ala-OH的拖尾现象比较明显。因此无法对起始物料中的对映异构体进行定量分析和准确检测多批次样品中的含量。这样的色谱柱和流动相对醋酸西曲瑞克的多个保护氨基酸的对映异构体检测不适用，需继续摸索检测方法。
实施例5
本发明采用外标法计算对映异构体的含量，并且对该方法进行一系列的方法学验证，包括线性，检测限定量限，重复性，准确度，中间精密度，溶液放置稳定性和耐用性试验；结果表明该方法专属性强，准确度高，可以用于检测物料Ac-D-2-Nal-OH中对映异构体Ac-L-2-Nal-OH的含量。
一、方法学验证：
1、专属性
溶液配制：
1)空白溶剂：稀释剂。
2)Ac-D-2-Nal-OH定位溶液：取Ac-D-2-Nal-OH约10mg，置20ml量瓶，加稀释剂约5ml，超声使溶解，后用稀释剂稀释至刻度，摇匀即得；
3)Ac-L-2-Nal-OH定位溶液：取Ac-L-2-Nal-OH杂质对照品约15mg，置50ml量瓶，加稀释剂约5ml，超声使溶解，后用稀释剂稀释至刻度，摇匀即得；
4)H-D-2-Nal-OH定位溶液：取H-D-2-Nal-OH杂质对照品约5mg，置250ml量瓶中，加入乙醇约5ml，超声使溶解，后用乙醇稀释至刻度，摇匀即得；
5)2-溴甲基萘定位溶液：取2-溴甲基萘杂质约5mg，置25ml量瓶中，加入稀释剂约5ml，超声使溶解，后用稀释剂稀释至刻度，摇匀即得；
6)乙酰氨基丙二酸二乙酯定位溶液：取乙酰氨基丙二酸二乙酯杂质对照品约5mg，置25ml量瓶中，加入稀释剂约5ml，超声使溶解，后用稀释剂稀释至刻度，摇匀即得；
7)混合溶液：称取Ac-D-2-Nal-OH约10mg，置20ml量瓶，加稀释剂约5ml振摇使其溶解后，精密加入对映异构体Ac-L-2-Nal-OH对照品贮备液1.0ml，H-D-2-Nal-OH定位溶液2.5ml，以及上述其余2个杂质峰定位溶液各0.25ml，用稀释剂稀释至刻度，摇匀即得。
表9
名称 RT(min) Resolution
2-溴甲基萘 5.712 N/A
H-D-2-Nal-OH 9.519 3.084
Ac-D-2-Nal-OH 17.653 5.454
Ac-L-2-Nal-OH 24.138 8.156
空白溶剂对本品中对映异构体检测无干扰；乙酰氨基丙二酸二乙酯在此色谱条件下紫外吸收弱，其它杂质H-D-2-Nal-OH和2-溴甲基萘对Ac-L-2-Nal-OH的检测均无干扰，本发明方法专属性较好。
2、线性和范围
线性溶液的配制：分别精密量取对映异构体Ac-L-2-Nal-OH贮备液适量，配制成浓度为0.3013、0.7532、1.2051、1.5064、1.8077、2.2597、3.0129μg/ml的一系列线性浓度溶液。分别注入液相色谱仪，记录色谱图。以Ac-L-2-Nal-OH浓度(μg/ml)为横坐标、以峰面积为纵坐标进行线性回归。
表10
Figure BDA0003746190550000111
由表10中结果得出对映异构体Ac-L-2-Nal-OH的浓度与峰面积的线性方程为y＝12129.8621x－237.9265，相关系数r＝0.9993，Y轴截距与100％响应值比值绝对值为1.3，均符合试验要求。说明Ac-L-2-Nal-OH在0.13013～3.0129μg/ml范围内线性良好。
3、检测限和定量限
精密量取Ac-L-2-Nal-OH对照品储备液0.2ml，置10ml量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得定量限溶液(LOQ溶液)；计算LOQ溶液连续进样6次对映异构体Ac-L-2-Nal-OH峰的信噪比(S/N)，及峰面积的RSD。
精密量取定量限溶液2ml，置10ml量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得检测限溶液(LOD溶液)；计算LOD溶液进样1次对映异构体Ac-L-2-Nal-OH峰的信噪比(S/N)。结果见下表11。
表11
Figure BDA0003746190550000121
结果表明Ac-L-2-Nal-OH的6份定量限溶液S/N值均大于10，最小值为19；6份峰面积的RSD为1.1％，符合要求。Ac-L-2-Nal-OH的检测限溶液S/N值为6，大于3，均符合要求，说明本方法灵敏度较好。
4、准确度
供试品溶液制备：精密称取供试品10mg，置20ml量瓶中，用稀释剂溶解并稀释至刻度线，摇匀，即得；
对照品溶液制备：精密称取保护氨基酸对映异构体，用稀释剂溶解并稀释成浓度为0.03mg/ml的溶液，作为对照品贮备液；精密量取对照品贮备液1ml，置20ml量瓶中，用稀释剂溶解并稀释至刻度线，摇匀，即得；
定量限准确度溶液：称取Ac-D-2-Nal-OH约10mg，置20ml量瓶，加入稀释剂约5ml，超声使溶解，精密加入对照品贮备液0.2ml，后用稀释剂稀释至刻度，摇匀即得；平行配制3份，各进1针。
100％限度准确度溶液：称取Ac-D-2-Nal-OH约10mg，置20ml量瓶，加入稀释剂约5ml，超声使溶解，精密加入对照品贮备液1.0ml，后用稀释剂稀释至刻度，摇匀即得；平行配制3份，各进1针。
200％限度准确度溶液：称取Ac-D-2-Nal-OH约10mg，置20ml量瓶，加入稀释剂约5ml，超声使溶解，精密加入对照品贮备液2.0ml，后用稀释剂稀释至刻度，摇匀即得；平行配制3份，各进1针。
根据公式回收率(％)＝(A-B)/C×100％，其中A为测得量，B为本底量，C为加入量来计算；计算结果见下表12。
表12
Figure BDA0003746190550000131
低中高浓度水平的回收率分别为102.1～104.4％和97.9～99.8％以及99.0～100.5％，9份低中高水平回收率的RSD为2.1％。均符合要求，说明本法准确度较好。
5、重复性
称取Ac-D-2-Nal-OH约10mg，置20ml量瓶，加入稀释剂约5ml，超声使溶解，精密加入对照品贮备液1.0ml，后用稀释剂稀释至刻度，摇匀即得；平行配制6份，各进1针；结果见下表13。
表13
Figure BDA0003746190550000132
Figure BDA0003746190550000141
6份重复性溶液的含量值RSD为1.2％，符合要求，说明本方法重复性较好。
6、中间精密度
将重复性项下结果作为第一人的实验结果。
同一批样品，由不同试验人员不同天在不同台仪器同法进行测定。按重复性项下方法配制6份中间精密度溶液。
表14
Figure BDA0003746190550000142
表15
Figure BDA0003746190550000143
6份中间精密度溶液测得含量的RSD值为3.4％，12份溶液测得含量的RSD值为3.9％，均小于10％，符合要求。
7、溶液放置稳定性
取加标供试品溶液，室温条件下放置，分别在0小时、4小时和8小时测定对映异构体Ac-L-2-Nal-OH峰面积，以不同时间峰面积RSD值考察溶液稳定性。
表16
Figure BDA0003746190550000144
Figure BDA0003746190550000151
由上表格得出，加标溶液在室温下放置不同时间，加标供试品溶液在室温下放置不同时间对映异构体和主成分保留时间RSD大于2.0％，峰面积RSD小于5.0％；说明加标供试品溶液在室温下放置8小时稳定。
8、耐用性试验
当仪器色谱参数发生些微变化，如流动相正己烷和无水乙醇配比、波长、柱温和流速发生变化时，考察空白溶剂是否干扰本品检测，系统适用性溶液中Ac-L-2-Nal-OH与前后色谱峰分离度，灵敏度溶液S/N值，以及加标供试品溶液与拟定条件下的检出量RSD值，是否符合要求。结果见下表17和18。
表17耐用性试验结果-系统适用性
Figure BDA0003746190550000152
表18耐用性试验结果-加标供试品溶液对映异构体含量
Figure BDA0003746190550000153
Figure BDA0003746190550000161
当仪器色谱参数变化后，灵敏度溶液的S/N值均大于10；Ac-L-2-Nal-OH对映体与前后杂质的分离度均符合要求；不同条件下连续3次对照品溶液中Ac-L-2-Nal-OH峰面积RSD均小于2.0％，加标供试品溶液中Ac-L-2-Nal-OH与拟定色谱条件的RSD均小于10.0％；说明本方法耐用性较好。

Claims (10)

1.一种正相色谱法测定保护氨基酸对映异构体的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）样品配制：
供试品溶液制备：精密称取供试品10mg，置20ml量瓶中，用稀释剂溶解并稀释至
刻度线，摇匀，即得；
对照品溶液制备：精密称取保护氨基酸对映异构体，用稀释剂溶解并稀释成浓度为
0.03mg/ml的溶液，作为对照品贮备液；精密量取对照品贮备液1ml，置20ml量瓶中，用稀释剂溶解并稀释至刻度线，摇匀，即得；
灵敏度溶液制备：精密量取对照品溶液1ml，置10ml量瓶中，用稀释剂溶解并稀释至刻度线，摇匀，即得；
系统适用性溶液制备：精密称取供试品10mg，置20ml量瓶中，加入对照品贮备液1ml，用稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀，即得；
（2）色谱条件设置：
色谱柱：直链淀粉-三(3，5-二甲基苯基氨基甲酸酯）手性固定相为色谱柱；
流动相：正己烷-无水乙醇-三氟乙酸，体积比为（75~90）:（10~25）: 0.1；
柱温：30~45℃；
流速：0.3~1.0ml/min；
进样体积：5~20µl；
检测波长：210~270nm；
（3）检测和计算：
精密量取系统适用性溶液，灵敏度溶液、对照品溶液和供试品溶液，分别注入液相色谱仪，记录色谱图；通过外标法计算主峰和对映异构体的峰面积。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述稀释剂为无水乙醇和正己烷的混合溶液，其中无水乙醇和正己烷体积比为60：40。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述柱温设置为39~41℃。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述灵敏度溶液中，峰高的信噪比大于10。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述保护氨基酸选自Ac-D-2-Nal-OH、Fmoc-D-Phe(4-Cl)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-D-Ala-OH中的一种。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述保护氨基酸选自Ac-D-2-Nal-OH时，其色谱条件设置：流动相：正己烷-无水乙醇-三氟乙酸，体积比为90:10:0.1；流速为0.8ml；波长为264nm。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述保护氨基酸选自Fmoc-D-Phe(4-Cl)-OH时，其色谱条件设置：流动相：正己烷-无水乙醇-三氟乙酸，体积比为85:15:0.1；流速为1.0ml；波长为264nm。
8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述保护氨基酸选自Fmoc-Arg(Pbf)-OH时，其色谱条件设置：流动相：正己烷-无水乙醇-三氟乙酸，体积比为75:25:0.1；流速为1.0ml；波长为220nm。
9.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述保护氨基酸选自Fmoc-D-Ala-OH时，其色谱条件设置：流动相：正己烷-无水乙醇-三氟乙酸，体积比为80:20:0.1；流速为0.3ml；波长为264nm。
10.利用权利要求1~9任一项所述方法测定醋酸西曲瑞克起始原料药中保护氨基酸的含量，其特征在于，所述保护氨基酸选自Ac-D-2-Nal-OH、Fmoc-D-Phe(4-Cl)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-D-Ala-OH中的一种，其对映异构体的含量不高于0.3%。
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