CN111103384A - 一种液质联用测定人尿液中内源性高香草酸和香草扁桃酸浓度的方法 - Google Patents

一种液质联用测定人尿液中内源性高香草酸和香草扁桃酸浓度的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN111103384A
CN111103384A CN201911363651.6A CN201911363651A CN111103384A CN 111103384 A CN111103384 A CN 111103384A CN 201911363651 A CN201911363651 A CN 201911363651A CN 111103384 A CN111103384 A CN 111103384A
Authority
CN
China
Prior art keywords
acid
solution
concentration
quality control
homovanillic
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201911363651.6A
Other languages
English (en)
Inventor
吴昱
周振东
刘虹霞
李健
许静姝
李丽
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Nanjing Ximedi Pharmaceutical Technology Co Ltd
Original Assignee
Nanjing Ximedi Pharmaceutical Technology Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Nanjing Ximedi Pharmaceutical Technology Co Ltd filed Critical Nanjing Ximedi Pharmaceutical Technology Co Ltd
Priority to CN201911363651.6A priority Critical patent/CN111103384A/zh
Publication of CN111103384A publication Critical patent/CN111103384A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/88—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/04—Preparation or injection of sample to be analysed
    • G01N30/06—Preparation
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/62—Detectors specially adapted therefor
    • G01N30/72—Mass spectrometers
    • G01N30/7233—Mass spectrometers interfaced to liquid or supercritical fluid chromatograph
    • G01N30/724—Nebulising, aerosol formation or ionisation
    • G01N30/7266—Nebulising, aerosol formation or ionisation by electric field, e.g. electrospray
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/86—Signal analysis
    • G01N30/8624—Detection of slopes or peaks; baseline correction
    • G01N30/8631—Peaks
    • G01N30/8637—Peak shape
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/04—Preparation or injection of sample to be analysed
    • G01N2030/042—Standards
    • G01N2030/045—Standards internal
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/88—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86
    • G01N2030/8809—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86 analysis specially adapted for the sample
    • G01N2030/8813—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86 analysis specially adapted for the sample biological materials

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Other Investigation Or Analysis Of Materials By Electrical Means (AREA)

Abstract

本发明目的在于提供一种可以准确测定人尿液中内源性高香草酸和香草扁桃酸浓度的方法。本发明的方法突破了内源干扰检测的难点，并且具有专属性强、准确度和灵敏度较高的特性。本发明采用液质联用测定人尿液中内源性高香草酸和香草扁桃酸的浓度，该方法包括：(1)替代基质的选择；(2)对照基质中内源性高香草酸和香草扁桃酸浓度的确定(3)工作曲线样品的制备及前处理；(4)质控样品的制备及前处理；(5)分离分析条件；(6)采用内标法，以系列高香草酸/香草扁桃酸在替代基质中的浓度为横坐标，高香草酸/香草扁桃酸与内标甲苯黄丁脲的峰面积比为纵坐标，通过使用权重因子1/x2，线性回归得到理论浓度与响应之间的线性关系进行定量。

Description

一种液质联用测定人尿液中内源性高香草酸和香草扁桃酸浓 度的方法
技术领域
本发明属于医药检测技术领域，特别涉及一种检测人尿液中内源性高香草酸和香草扁桃酸浓度的方法。
背景技术
儿茶酚胺是由肾上腺髓质，肾上腺神经元及肾上腺外嗜铬体分泌的激素，主要包括肾上腺素、去甲肾上腺素和多巴胺。过多的儿茶酚胺分泌可能导致高血压和心肌梗塞；而低水平的儿茶酚胺可能引起低血压、心肌缺血等的发生。在临床上，儿茶酚胺降低常见于帕金森病、癫痫、肾上腺切除后、风湿热、营养不良等病症；升高常见于嗜铬细胞瘤、神经母细胞瘤、脑梗死、重症肌无力、进行性肌营养不良、低血糖、心肌梗死、躁狂性精神病等。神经母细胞瘤是儿童常见的实体瘤之一，发病率约占全部恶性肿瘤患儿的7％，病死率达15％，仅次于白血病(SMITH E I,CASTLEBERRY R P.neuroblastoma,CurtProbl Surgt,l990,27(9):573-620.)。高香草酸和香草扁桃酸作为儿茶酚胺在尿液中的终末代谢产物，在早期神经母细胞瘤患儿的尿液中浓度就会明显升高，可以通过检测尿液中高香草酸和香草扁桃酸的含量来进行早期神经母细胞瘤的诊断(GITLOW S E,BERTANI L M,RAUSEN A,etal.Diagnosis of neuroblastoma by quantitative and qualitative determinationof catecholamine metabolites in urine.Cancer,1970,25(6):1377.)。因此，高香草酸和香草扁桃酸不仅可以作为临床疾病检测的指标，还可以用此类抗肿瘤药物治疗效果的生物标志物进行研究。但是，高香草酸和香草扁桃酸作为内源性物质，能否准确定量是检测的难点。本发明基于替代基质法，建立了一种科学、快速和准确的液质联用测定人尿液中内源性高香草酸和香草扁桃酸浓度的方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种可以液质联用测定人尿液中内源性高香草酸和香草扁桃酸浓度的方法，本发明的方法可以用于准确、简便和快速地评价患者治疗的体内药效。
本发明的技术方案概述如下：
(1)替代基质的选择
本发明使用“相对加标回收率”法，来筛选合适的替代基质。以人工尿液和生理盐水(含0.1％BSA):6mol/L HCl(100:1,v/v)作为代替基质考察不同代替基质的加标回收率；10.0mg/mL的高香草酸和香草扁桃酸储备液用含5.68μmol/mL L(+)-抗坏血酸的甲醇溶液稀释为高浓度质控工作液(320μg/mL)、中浓度质控工作液(200μg/mL)和低浓度质控工作液(20.0μg/mL)的系列质控工作液，分别加入到替代基质和人尿液中，配制空白样品、低浓度质控样品、中浓度质控样品和高浓度质控样品，结果代入相对加标回收率进行计算，相对加标回收率接受标准：三个浓度的相对加标回收率在85％～115％之间，且％CV不超过15％。计算公式如下：
％相对加标回收率＝(spiked SM–blank SM)/(spiked SM–blank SM)
spiked SM＝加标代替基质中分析物与内标的峰面积比值
blank SM＝空白代替基质中分析物与内标的峰面积比值
spiked CM＝加标对照基质中分析物与内标的峰面积比值
spiked CM＝空白对照基质中分析物与内标的峰面积比值
结果发现内标甲苯黄丁脲和高香草酸、香草扁桃酸在生理盐水(含0.1％BSA):6mol/L HCl(100:1,v/v)溶液中与人尿液样品中的质谱响应趋于一致，高香草酸(HVA)的低、中、高浓度的回收率分别为105.18％，109.72％和108.96％，香草扁桃酸(VMA)的低、中、高浓度的回收率分别为99.47％，103.56％和102.86。三个浓度的相对加标回收率在100％左右，且变异系数小于10％。故选择生理盐水(含0.1％BSA):6mol/L HCl(100:1,v/v)溶液作为代替基质进行人尿液中高香草酸和香草扁桃酸的方法学验证试验及样品分析试验。
(2)对照基质(人尿液)中内源性高香草酸和香草扁桃酸浓度的确定
标准曲线样品配制：用生理盐水(含0.1％BSA):6mol/L HCl(100:1,v/v)溶液为替代基质配制标准曲线样品，用5.68μmol/mL L(+)-抗坏血酸甲醇溶液稀释10.0mg/mL的高香草酸和香草扁桃酸储备液，配制为4.00、10.0、20.0、60.0、100、240、360和400μg/mL的系列标准曲线工作液；向190μL的替代基质中分别加入10.0μL的上述用于标准曲线配制的系列工作溶液，配制成相当于高香草酸和香草扁桃酸在替代基质中的浓度为0.200、0.500、1.00、3.00、5.00、12.0、18.0和20.0μg/mL的样品，分装出2份，每份50.0μL；
对照基质样品的配制：直接取50.0μL人尿液样品即可；
生物样品的前处理：将上述标准曲线样品和对照基质样品，每份加入50.0μL的内标工作液后加入500μL0.2％甲酸的乙腈溶液进行蛋白沉淀，离心后取50.0μL上清液，加入50.0μL含0.2％甲酸的乙腈-水溶液(1:1，v/v)和300μL的含0.1％甲酸的水溶液，震荡离心后，供LC-MS/MS测定。
选定6批次人尿液作为对照基质，按上述方法进行对照基质中内源高香草酸和香草扁桃酸浓度的测定。6批次人尿液中内源高香草酸浓度分别为2.98μg/mL、11.4μg/mL、1.06μg/mL、0.900μg/mL、0.827μg/mL和3.90μg/mL，混合对照基质中高香草酸的浓度均值为3.477μg/mL；6批次人尿液中内源香草扁桃酸浓度分别为3.38μg/mL、10.9μg/mL、1.28μg/mL、0.881μg/mL、0.819μg/mL和3.82μg/mL，混合对照基质中香草扁桃酸的浓度均值为3.293μg/mL。
(3)标准曲线样品的制备及前处理
内标溶液的配制：精密称取适量的甲苯磺丁脲标准品，经质量校正因子校正后，将其溶于甲醇中，涡旋溶解，配制成浓度为0.500mg/mL的内标储备液；再用含0.2％甲酸的乙腈-水溶液(1:1，v/v)稀释成为0.0500μg/mL的内标工作液；
标准系列溶液的配制：精密称取适量的香草扁桃酸标准品，经质量校正因子校正后，将其溶于5.68μmol/mL L(+)-抗坏血酸甲醇溶液中，涡旋溶解，配制成浓度为10.0mg/mL的香草扁桃酸储备液；精密称取适量的高香草酸标准品，经质量校正因子校正后，将其溶于5.68μmol/mL L(+)-抗坏血酸甲醇溶液中，涡旋溶解，配制成浓度为10.0mg/mL的香草扁桃酸储备液；取高香草酸和香草扁桃酸储备液母液适量，再用含5.68μmol/mL L(+)-抗坏血酸的甲醇溶液稀释成为含高香草酸和香草扁桃酸均为4.00、10.0、20.0、60.0、100、240、360和400μg/mL的系列标准曲线工作液；
工作曲线样品的前处理：向190μL的替代基质中分别加入10.0μL的上述用于标准曲线配制的系列工作溶液，配制成相当于高香草酸和香草扁桃酸在替代基质中的浓度为0.200、0.500、1.00、3.00、5.00、12.0、18.0和20.0μg/mL的样品，分装出2份，每份50.0μL；每份加入50.0μL的内标工作液后加入500μL 0.2％甲酸的乙腈溶液进行蛋白沉淀，离心后取50.0μL上清液，加入50.0μL含0.2％甲酸的乙腈-水溶液(1:1，v/v)和300μL的含0.1％甲酸的水溶液，震荡离心后，供LC-MS/MS测定。
(4)质控样品的制备及前处理
标准系列溶液的配制：取高香草酸和香草扁桃酸储备液母液适量，用含5.68μmol/mL L(+)-抗坏血酸的甲醇溶液稀释成为320μg/mL(高浓度质控工作液)、60.0μg/mL(算数中浓度质控工作液)、12.0μg/mL(低浓度质控工作液)和4.00μg/mL(定量下限浓度质控工作液)的质控工作液；
质控样品的前处理：向387μL人空白尿液(含6mol/L的盐酸溶液)中加入16.0μL的高浓度质控工作液(W-HQC)，配制高浓度质控样品(HQC)；向492μL人空白尿液(含6mol/L的盐酸溶液)中加入11.0μL的高浓度质控工作液(W-HQC)，配制中浓度质控样品(MQC)；以混合的人空白尿液(含6mol/L的盐酸溶液)直接作为几何中浓度质控样品(GMQC)；取一定体积人空白尿液(含6mol/L的盐酸溶液)，再用代替基质0.1％BSA的氯化钠溶液(含6mol/L的盐酸溶液)按一定比例稀释，分别配制为低浓度质控样品(LQC)和定量下限浓度质控样品(LLOQ)，每个质控样品分装出6份，每份50.0μL；每份加入50.0μL的内标工作液后加入500μL0.2％甲酸的乙腈溶液进行蛋白沉淀，离心后取50.0μL上清液，加入50.0μL含0.2％甲酸的乙腈-水溶液(1:1，v/v)和300μL的含0.1％甲酸的水溶液，震荡离心后，供LC-MS/MS测定。
(5)分离分析条件
液相色谱条件：
色谱柱：ACQUITY UPLC HSS T3 1.7μm(50×2.1mm)；
流动相：A＝0.1％的甲酸-水溶液；B＝乙腈溶液，梯度如下：
0-0.50min，流动相A为95.0％，流动相B为5.00％；0.50-1.00min，流动相A从95.0％到80.0％，流动相B从5.00％到20.0％；1.00-1.70min，流动相A保持为80.0％，流动相B保持为20.0％；1.70-1.80min，流动相A从80.0％到5.00％，流动相B从20.0％到95.0％；1.80-2.60min，流动相A为5.00％，流动相B为95.0％；2.60-2.70min，流动相A从5.00％到95.0％，流动相B从95.0％到5.00％；2.70-3.50min，流动相A为95.0％，流动相B为5.00％；
流速：0.500mL/min；
柱温：40℃；
进样量：3.00μL。
质谱检测器及条件：质谱检测器为AB Sciex Triple Quad 5500；离子源为电喷雾离子源；喷雾电压为-4500V；离子源温度：550℃；帘气(CUR)：33psi，碰撞气(CAD)：7psi，GS1：450psi，GS2：45psi；负离子方式检测；扫描方式：MRM；高香草酸的定量离子对为181.1→122.0，碰撞电压为-20.0eV；香草扁桃酸的定量离子对为197.1→137.0，碰撞电压为-28.0eV；内标甲苯黄丁脲的定量离子对为269.1→169.9，碰撞电压为-23.0eV。
(6)采用内标法定量，以系列高香草酸/香草扁桃酸在替代基质中的浓度为横坐标，高香草酸/香草扁桃酸与内标C17-高香草酸和香草扁桃酸的峰面积比为纵坐标，进行线性回归运算，权重因子为1/x2，得到线性回归方程，即为工作曲线，使用工作曲线，对人尿液中内源性高香草酸和香草扁桃酸的浓度进行测定。
优点：
本发明通过替代基质的方法，利用液质联用测定尿液样品中内源性高香草酸和香草扁桃酸的浓度，该方法具有快速、专属、准确的特点。
附图说明
图1为空白替代基质色谱图；图1a为分析物香草酸离子通道色谱图；图1b为分析物高香草酸离子通道色谱图；图1c为内标甲苯磺丁脲(0.0500μg/mL)离子通道色谱图；
图2为标准曲线定量下限色谱图；图2a为分析物香草酸(0.200μg/mL)在替代基质中色谱图；图2b为分析物高香草(0.200μg/mL)在替代基质中色谱图；图2c为内标甲苯磺丁脲(0.0500μg/mL)在替代基质中色谱图；
图3为标准曲线定量上限色谱图；图3a为分析物香草酸(20.0μg/mL)在替代基质中色谱图；图3b为分析物高香草(20.0μg/mL)在替代基质中色谱图；图3c为内标甲苯磺丁脲(0.0500μg/mL)在替代基质中色谱图；
图4为对照基质中质控LLOQ浓度色谱图；图4a为分析物香草酸(0.202μg/mL，对照基质经替代基质稀释后得到)在对照基质中色谱图；图4b为分析物高香草酸(0.213μg/mL，对照基质经替代基质稀释后得到)在对照基质中色谱图；图4c为内标甲苯磺丁脲(0.0500μg/mL)在对照基质中色谱图；
图5为对照基质中质控LQC浓度色谱图；图5a为分析物香草酸(0.600μg/mL，对照基质经替代基质稀释后得到)在对照基质中色谱图；图5b为分析物高香草酸(0.635μg/mL，对照基质经替代基质稀释后得到)在对照基质中色谱图；图5c为内标甲苯磺丁脲(0.0500μg/mL)在对照基质中色谱图；
图6为对照基质中质控GMQC浓度色谱图；图6a为分析物香草酸(3.29μg/mL，对照基质中内源浓度)在对照基质中色谱图；图6b为分析物高香草酸(3.48μg/mL，对照基质中内源浓度)在对照基质中色谱图；图6c为内标甲苯磺丁脲(0.0500μg/mL)在对照基质中色谱图；
图7为对照基质中质控MQC浓度色谱图；图7a为分析物香草酸(10.2μg/mL，对照基质经中内源浓度+加入浓度)在对照基质中色谱图；图7b为分析物高香草酸(10.4μg/mL，对照基质经中内源浓度+加入浓度)在对照基质中色谱图；图7c为内标甲苯磺丁脲(0.0500μg/mL)在对照基质中色谱图；
图8为对照基质中质控HQC浓度色谱图；图8a为分析物香草酸(15.9μg/mL，对照基质经中内源浓度+加入浓度)在对照基质中色谱图；图8b为分析物高香草酸(16.0μg/mL，对照基质经中内源浓度+加入浓度)在对照基质中色谱图；图8c为内标甲苯磺丁脲(0.0500μg/mL)在对照基质中色谱图。
具体实施方式
下面结合具体实施例并结合附图对本发明进一步阐述，但不限制本发明。
1：检测方法的确定
1.1实验仪器和试剂
仪器：
液相色谱仪为Waters UPLC Acquity I CLASS液相系统(Waters公司)，色谱柱为ACQUITY UPLC HSS T3 1.7μm(50×2.1mm)；
质谱仪为Triple Quad 5500(AB Sciex)，配有Analyst 1.6.3分析软件；
信息管理软件：Watson LIMS 7.5SP1(Thermo Scientific)；
主要仪器，见下表1：
表1主要仪器
Figure BDA0002335762470000061
试剂：
原始试剂：
超纯水(Milli-Q纯化系统自制)；
甲酸，LC/MS，Fisher Scientific，批号：190284，193497；
甲醇，色谱纯，Fisher Chemical，批号：190894；
乙腈，色谱纯，Fisher Chemical，批号：186341；
生理盐水注射液，医用，双鹤药业，批号：170108TV；
L+抗坏血酸，分析纯，国药集团化学试剂有限公司，批号：20170925；
牛血清白蛋白，级别N/A，SIGMA，批号：WXBC7961V；
盐酸，分析纯，国药集团化学试剂有限公司，批号：20180212。
标准品：
高香草酸(Homovanillic acid)，批号：SLCB2471，纯度：100％；厂家：Sigma-Aldrich；过期日期：2022年12月；校正因子：1.00，游离态分子量：182.17，10～30℃条件下保存。
香草扁桃酸(Vanillylmandelic acid)，批号：SLBV5813，纯度：100％；厂家：Sigma-Aldrich；过期日期：2023年10月；校正因子：1.00，游离态分子量：198.17，2～8℃条件下保存。
甲苯黄丁脲(Tolbutamide)，批号：BCBV8457；纯度和水分：99.9％、0.05％；厂家：Sigma-Aldrich；过期日期：2022年08月；校正因子：0.9985，游离态分子量：270.35，干燥，密封，常温条件下保存。
试剂配制：
内标储备液配制：精密称取适量的甲苯磺丁脲标准品，经质量校正因子校正后，将其溶于甲醇中，涡旋溶解，配制成浓度为0.500mg/mL的内标储备液；
标准品储备液：精密称取适量的香草扁桃酸标准品，经质量校正因子校正后，将其溶于5.68μmol/mL L(+)-抗坏血酸甲醇溶液中，涡旋溶解，配制成浓度为10.0mg/mL的香草扁桃酸储备液；精密称取适量的高香草酸标准品，经质量校正因子校正后，将其溶于5.68μmol/mL L(+)-抗坏血酸甲醇溶液中，涡旋溶解，配制成浓度为10.0mg/mL的香草扁桃酸储备液；
内标工作液的配制：取适量内标储备液母液，再用含0.2％甲酸的乙腈-水溶液(1:1，v/v)稀释成为0.0500μg/mL的内标工作液；
标准曲线工作液的配制：取适量高香草酸和香草扁桃酸标准品储备液母液，用用含5.68μmol/mL L(+)-抗坏血酸的甲醇溶液稀释成为含高香草酸和香草扁桃酸均为4.00、10.0、20.0、60.0、100、240、360和400μg/mL的系列标准曲线工作液；
质控工作液的配制：取高香草酸和香草扁桃酸储备液母液适量，用含5.68μmol/mLL(+)-抗坏血酸的甲醇溶液稀释成为320μg/mL(高浓度质控工作液)、60.0μg/mL(算数中浓度质控工作液)、12.0μg/mL(低浓度质控工作液)和4.00μg/mL(定量下限浓度质控工作液)的质控工作液。
基质：
替代基质：生理盐水(含0.1％BSA):6mol/L HCl(100:1,v/v)溶液作为代替基质用于方法验证中标准曲线样品配制；
对照基质：检测不同个体尿液中高香草酸和香草扁桃酸浓度，选高香草酸和香草扁桃酸含量较低的个体尿液混合，将混合的尿液作为对照基质，检测混合尿液中高香草酸和香草扁桃酸浓度，用于方法验证中质控样品配制；
尿液样品：6名健康志愿者的尿液由镇江市第三人民医院提供，装于聚丙烯离心管中并冷冻在-75±15℃冰箱内。
1.2尿液样品分析方法
尿液样品前处理：取健康志愿者的尿液50.0μL，每份加入50.0μL的内标工作液后加入500μL 0.2％甲酸的乙腈溶液进行蛋白沉淀，离心后取50.0μL上清液，加入50.0μL含0.2％甲酸的乙腈-水溶液(1:1，v/v)和300μL的含0.1％甲酸的水溶液，震荡离心后，供LC-MS/MS测定。
1.2.1液相条件
色谱柱：ACQUITY UPLC HSS T3 1.7μm(50×2.1mm)；流动相：A＝0.1％的甲酸-水溶液；B＝乙腈溶液，梯度洗脱见表2；柱温：40℃；自动进样器温度：15℃；进样量：3.00μL。
表2液相梯度洗脱程序
Figure BDA0002335762470000081
Figure BDA0002335762470000091
1.2.2质谱条件
离子源为电喷雾离子源；喷雾电压为-4500V；离子源温度：550℃；帘气(CUR)：33psi，碰撞气(CAD)：7psi，GS1：45psi，GS2：45psi；负离子方式检测；扫描方式：MRM。具体参数见表3：
表3采用MRM的模式采集，主要质谱参数
Figure BDA0002335762470000092
2：方法学验证实验
方法的线性：取适量标准品储备液母液，用含5.68μmol/mL L(+)-抗坏血酸的甲醇溶液稀释成为含高香草酸和香草扁桃酸均为4.00、10.0、20.0、60.0、100、240、360和400μg/mL的系列标准曲线工作液；向190μL的替代基质中分别加入10.0μL的上述用于标准曲线配制的系列工作溶液，配制成相当于高香草酸和香草扁桃酸在替代基质中的浓度为0.200、0.500、1.00、3.00、5.00、12.0、18.0和20.0μg/mL的样品，分装出2份，每份50.0μL；每份加入50.0μL的内标工作液后加入500μL0.2％甲酸的乙腈溶液进行蛋白沉淀，离心后取50.0μL上清液，加入50.0μL含0.2％甲酸的乙腈-水溶液(1:1，v/v)和300μL的含0.1％甲酸的水溶液，震荡离心后，供LC-MS/MS测定。
取3.00μL进行LC-MS/MS分析，记录色谱图；以系列高香草酸/香草扁桃酸在替代基质中的浓度为横坐标，高香草酸/香草扁桃酸与内标的峰面积比为纵坐标，进行线性回归运算，权重因子为1/x2，得到线性回归方程，即为工作曲线。
替代基质中高香草酸和香草扁桃酸的工作曲线，线性范围为0.200–20.0μg/mL，高香草酸典型的工作曲线为y＝0.111476x+0.002183，相关系数均大于0.9981，满足定量检测要求；香草扁桃酸典型的工作曲线为y＝0.731198x+0.015494，相关系数均大于0.9982，满足定量检测要求。
方法的准确度和精密度：取高香草酸和香草扁桃酸储备液母液适量，用含5.68μmol/mL L(+)-抗坏血酸的甲醇溶液稀释成为320μg/mL(高浓度质控工作液)、60.0μg/mL(算数中浓度质控工作液)、12.0μg/mL(低浓度质控工作液)和4.00μg/mL(定量下限浓度质控工作液)的质控工作液；向387μL人空白尿液(含6mol/L的盐酸溶液)中加入16.0μL相应浓度的质控工作液(W-HQC)，配制HQC质控样品，向492μL人空白尿液(含6mol/L的盐酸溶液)中加入11.0μL相应浓度的质控工作液(W-HQC)，配制MQC质控样品，以混合的人空白尿液(含6mol/L的盐酸溶液)样品作为GMQC浓度质控样品，取一定体积人空白尿液(含6mol/L的盐酸溶液)，再用代替基质0.1％BSA的氯化钠溶液(含6mol/L的盐酸溶液)稀释，配制LQC与LLOQ质控样品，每个质控样品分装出6份，每份50.0μL；每份加入50.0μL的内标工作液后加入500μL0.2％甲酸的乙腈溶液进行蛋白沉淀，离心后取50.0μL上清液，加入50.0μL含0.2％甲酸的乙腈-水溶液(1:1，v/v)和300μL的含0.1％甲酸的水溶液，震荡离心后，供LC-MS/MS测定。(实际样品浓度＝(工作液浓度*工作液体积+对照基质浓度*对照基质体积)/总体积。)
批内精密度与准确度考察通过分析一个批次内5个浓度水平的质控样品(LLOQ、LQC、GMQC、MQC和HQC，n＝6)来测定。批间精密度与准确度考察通过至少两天内至少3个批次的5个浓度水平(LLOQ、LQC、GMQC、MQC和HQC，n＝6)来测定。每个浓度水平质控样品的批内、批间平均测定值与理论值的偏差应不超过±15％(LLOQ不超过±20％)；批内、批间每个浓度水平质控样品的精密度不超过15％(LLOQ不超过20％)。测定结果见表4，从表4中结果可以看出LC-MS/MS测定尿液内源性高香草酸和香草扁桃酸浓度的方法批内、批间测定结果；满足人尿液内源性高香草酸和香草扁桃酸分析测定的要求。说明该方法的准确度和精密度较好，充分验证所建立方法的可操作性。
表4批内、批间精密度与准确度结果
高香草酸
Figure BDA0002335762470000111
香草扁桃酸
Figure BDA0002335762470000112
Figure BDA0002335762470000121
方法的回收率和基质效应：通过对比分析物/内标在对照基质和代替基质中提取回收率/基质效应的相似性来证明对照基质的提取回收率和基质效应。测定6个单独个体的对照基质(实际尿液基质)，测得平均值作为个体理论内源浓度。
在对照基质中不加入工作液和加入高浓度质控工作液的2种情况下考察代替基质与对照基质的基质效应的一致性：使用代替基质分别对6个个体的对照基质稀释至低浓度质控水平；在6个个体的对照基质中加入高浓度质控工作液后，再用代替基质稀释至低浓度质控水平。每个浓度样品配制3份，用代替基质标准曲线进行定量。此方法在不同个体中进一步考察了平行性。接受标准：6个不同个体的内源浓度精密度不超过20％，每个个体稀释后的LQC浓度的准确度偏差不超过±20％，精密度不超过20％。结果见表5：
表5回收率和基质效应结果
高香草酸
Figure BDA0002335762470000141
香草扁桃酸
Figure BDA0002335762470000151
从表5可以看出，6个不同个体的内源性高香草酸和香草扁桃酸的基质效应/回收率均符合实验要求，表明质谱和色谱条件有效的避免了基质效应，满足人尿液内源性高香草酸和香草扁桃酸分析测定的要求，充分验证所建立方法的可操作性。
3：实际样品的测定
选取6名健康志愿者的尿液，进行内源性高香草酸和香草扁桃酸浓度的测定。按照“1.2项下尿液样品前处理”方式处理尿液样品，按照实施例1这中的液相条件和质谱条件进行液质分析，分析批包含两条标准曲线，至少需4个浓度水平质控样品(HQC，MQC，GMQC和LQC)，每个浓度至少2个重复，且数量不少于每个分析批中样品总量的5％。根据标准曲线计算质控样品和未知样品的浓度。上述标准曲线样品标准样品准确度偏差不超过±15％，标准样品定量下限准确度偏差不超过±20％，不符合接受标准的标准曲线样品不参与标准曲线回归，标准曲线样品的剔除应从偏差最大的开始，然后再次进行回归，再剔除不符合接受标准的偏差最大的标准曲线样品，如此依次剔除不符合接受标准的标准样品，直至所有参与标曲回归的样品皆满足准确度偏差的接受标准，参与标曲回归的样品不低于75％的非零标准样品且每个浓度至少50％的标准样品满足接受标准或者标准曲线失败(多于25％的非零点被去除)；线性回归的决定系数(R2)应不低于0.9801。上述质控样品至少67％的质控样品且每个浓度水平至少50％的质控样品的准确度偏差不超过±20％；所有接受的分析批每个浓度质控样品的平均准确度偏差不超过±20％，精密度应在20％以内。测定结果见表6。
表6 6名健康志愿者尿液中内源性高香草酸和香草扁桃酸的测定结果(n＝3)
Figure BDA0002335762470000161
Figure BDA0002335762470000171
上述液质联用定量人尿液中内源高香草酸和香草扁桃酸的线性范围为0.200-20.0μg/mL，定量下限为0.200μg/mL，在0.200-20.0μg/mL范围内线性关系良好。选取生理盐水(含0.1％BSA):6mol/L HCl(100:1,v/v)溶液为替代基质，能避免内源性对准确定量的干扰；准确度和精密度、回收率和基质效应等方法学验证考察均符合要求，满足人尿液中内源性高香草酸和香草扁桃酸浓度检测的要求。
综上所述，本发明的液质联用定量检测人尿液中内源性高香草酸和香草扁桃酸浓度的方法能准确、快速、可靠的检测血样中高香草酸和香草扁桃酸的浓度。
以上所述仅是本发明的实施方式举例，应当指出，对于本技术领域，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变型，这些改进和变型应视为本发明的保护范围。

Claims (3)

1.一种液质联用测定人尿液中内源性高香草酸和香草扁桃酸浓度的方法，其特征在于，该方法包括：
(1)替代基质的选择:用含0.1％BSA生理盐水:6mol/L HCl＝100:1(v/v)的人工尿液和生理盐水作为替代基质和人尿液对照基质分别配制空白样品、低浓度质控样品、中浓度质控样品和高浓度质控样品，每份样品配制至少3份。利用“相对加标回收率”的方法来确定合适的替代基质；
(2)人尿液中内源性高香草酸和香草扁桃酸浓度的确定:用所述步骤(1)中确定的替代基质进行标准曲线样品的配制，然后对人尿液中的本底高香草酸和香草扁桃酸的浓度进行测定，确定混合后的人尿液中高香草酸和香草扁桃酸的平均浓度分别为3477μg/mL和3293μg/mL，用以计算实际质控样品的理论浓度；
(3)标准曲线样品的制备及前处理，包括：内标溶液的配制、标准系列溶液的配制、工作曲线样品的前处理，其中，
内标溶液的配制为称取适量的甲苯磺丁脲标准品，经质量校正因子校正后，将其溶于甲醇中，涡旋溶解，配制成浓度为0.500mg/mL的内标储备液；再用含0.2％甲酸的乙腈-水溶液(1:1，v/v)稀释成为0.0500μg/mL的内标工作液；
标准系列溶液的配制为精密称取适量的香草扁桃酸标准品，经质量校正因子校正后，将其溶于5.68μmol/mL L(+)-抗坏血酸甲醇溶液中，涡旋溶解，配制成浓度为10.0mg/mL的香草扁桃酸储备液；精密称取适量的高香草酸标准品，经质量校正因子校正后，将其溶于5.68μmol/mL L(+)-抗坏血酸甲醇溶液中，涡旋溶解，配制成浓度为10.0mg/mL的高香草酸储备液；取高香草酸和香草扁桃酸储备液母液适量，再用含5.68μmol/mL L(+)-抗坏血酸的甲醇溶液稀释成为含高香草酸和香草扁桃酸均为4.00、10.0、20.0、60.0、100、240、360和400μg/mL的系列标准曲线工作液；
工作曲线样品的前处理为向190μL的替代基质中分别加入10.0μL的上述用于标准曲线配制的系列工作溶液，配制成相当于高香草酸和香草扁桃酸在替代基质中的浓度为0.200、0.500、1.00、3.00、5.00、12.0、18.0和20.0μg/mL的样品，分装出2份，每份50.0μL；每份加入50.0μL的内标工作液后加入500μL 0.2％甲酸的乙腈溶液进行蛋白沉淀，离心后取50.0μL上清液，加入50.0μL含0.2％甲酸的乙腈-水溶液(1:1，v/v)和300μL的含0.1％甲酸的水溶液，震荡离心后，供LC-MS/MS测定；
(4)质控样品的制备及前处理：包括标准系列溶液的配制、质控样品的前处理，其中，
标准系列溶液的配制为取高香草酸和香草扁桃酸储备液母液适量，用含5.68μmol/mLL(+)-抗坏血酸的甲醇溶液稀释成为320μg/mL的高浓度质控工作液、60.0μg/mL的算数中浓度质控工作液、12.0μg/mL的低浓度质控工作液和4.00μg/mL的定量下限浓度质控工作液的质控工作液；
质控样品的前处理为向含6mol/L的盐酸溶液的387μL人空白尿液中加入16.0μL高浓度质控工作液W-HQC，配制高浓度质控样品HQC，向含6mol/L的盐酸溶液492μL人空白尿液中加入11.0μL高浓度质控工作液W-HQC，配制中浓度质控样品MQC，以混合的含6mol/L的盐酸溶液人空白尿液直接作为几何中位数浓度质控样品GMQC，取一定体积含6mol/L的盐酸溶液的人空白尿液，再用0.1％BSA的氯化钠溶液替代基质稀释，替代基质含6mol/L的盐酸溶液，分别配制低浓度质控样品LQC与定量下限浓度质控样品LLOQ，每个质控样品分装出6份，每份50.0μL；每份加入50.0μL的内标工作液后加入500μL 0.2％甲酸的乙腈溶液进行蛋白沉淀，离心后取50.0μL上清液，加入50.0μL含0.2％甲酸的乙腈-水溶液1:1(v/v)和300μL的含0.1％甲酸的水溶液，震荡离心后，供LC-MS/MS测定；
(5)采用内标法定量，对人尿液中内源性高香草酸和香草扁桃酸的浓度进行测定。
2.根据权利要求1所述的液质联用测定人尿液中内源性高香草酸和香草扁桃酸浓度的方法，其特征在于，所述LC-MS/MS条件包括：
液相色谱条件：
色谱柱：ACQUITY UPLC HSS T3 1.7μm，50×2.1mm；
流动相：A＝0.1％的甲酸-水溶液；B＝乙腈溶液，梯度如下：
0-0.50min，流动相A为95.0％，流动相B为5.00％；0.50-1.00min，流动相A从95.0％到80.0％，流动相B从5.00％到20.0％；1.00-1.70min，流动相A保持为80.0％，流动相B保持为20.0％；1.70-1.80min，流动相A从80.0％到5.00％，流动相B从20.0％到95.0％；1.80-2.60min，流动相A为5.00％，流动相B为95.0％；2.60-2.70min，流动相A从5.00％到95.0％，流动相B从95.0％到5.00％；2.70-3.50min，流动相A为95.0％，流动相B为5.00％；
流速：0.500mL/min；
柱温：40℃；
进样量：3.00μL；
质谱检测器及条件：质谱检测器为AB Sciex Triple Quad 5500；离子源为电喷雾离子源；喷雾电压为-4500V；离子源温度：550℃；帘气CUR：33psi，碰撞气CAD：7psi，GS1：450psi，GS2：45psi；负离子方式检测；扫描方式：MRM；高香草酸的定量离子对为181.1→122.0，碰撞电压为-20.0eV；香草扁桃酸的定量离子对为197.1→137.0，碰撞电压为-28.0eV；内标甲苯黄丁脲的定量离子对为269.1→169.9，碰撞电压为-23.0eV。
3.根据权利要求1所述的液质联用测定人尿液中内源性高香草酸和香草扁桃酸浓度的方法，其特征在于，所述步骤(5)的内标法定量测试方法具体为：以系列高香草酸/香草扁桃酸在替代基质中的浓度为横坐标，高香草酸/香草扁桃酸与内标C17-高香草酸和香草扁桃酸的峰面积比为纵坐标，进行线性回归运算，权重因子为1/x2，得到线性回归方程，即为工作曲线，使用工作曲线，对人尿液中内源性高香草酸和香草扁桃酸的浓度进行测定。
CN201911363651.6A 2019-12-25 2019-12-25 一种液质联用测定人尿液中内源性高香草酸和香草扁桃酸浓度的方法 Pending CN111103384A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201911363651.6A CN111103384A (zh) 2019-12-25 2019-12-25 一种液质联用测定人尿液中内源性高香草酸和香草扁桃酸浓度的方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201911363651.6A CN111103384A (zh) 2019-12-25 2019-12-25 一种液质联用测定人尿液中内源性高香草酸和香草扁桃酸浓度的方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN111103384A true CN111103384A (zh) 2020-05-05

Family

ID=70424800

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201911363651.6A Pending CN111103384A (zh) 2019-12-25 2019-12-25 一种液质联用测定人尿液中内源性高香草酸和香草扁桃酸浓度的方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN111103384A (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114910587A (zh) * 2022-05-12 2022-08-16 军科正源(上海)生物医药科技有限公司 一种尿液检测用新型高效液相-串联质谱分析方法
CN114956997A (zh) * 2022-03-30 2022-08-30 北京丹大生物技术有限公司 香草扁桃酸半抗原衍生物及其合成方法，香草扁桃酸抗原及其制备方法，抗体及试剂盒

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20120040383A1 (en) * 2010-08-12 2012-02-16 Wei Jia Methods and Kits Relating To Metabolite Biomarkers For Colorectal Cancer
CN103837634A (zh) * 2014-03-21 2014-06-04 上海硕源健标生物医学科技有限公司 一种同时检测人体尿液中多种有机酸含量的方法
CN104807923A (zh) * 2014-01-23 2015-07-29 杭州纽贝生物科技有限公司 一种人尿中检测香草扁桃酸的方法
CN106248838A (zh) * 2016-10-25 2016-12-21 杭州佰辰医学检验所有限公司 高通量液相色谱串联质谱的检测方法以及检测4种儿茶酚胺代谢物的方法
WO2017077401A1 (en) * 2015-11-02 2017-05-11 Pharmasan Labs, Inc. Method for the ultra-sensitive determination of catecholamines and their metabolites

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20120040383A1 (en) * 2010-08-12 2012-02-16 Wei Jia Methods and Kits Relating To Metabolite Biomarkers For Colorectal Cancer
CN104807923A (zh) * 2014-01-23 2015-07-29 杭州纽贝生物科技有限公司 一种人尿中检测香草扁桃酸的方法
CN103837634A (zh) * 2014-03-21 2014-06-04 上海硕源健标生物医学科技有限公司 一种同时检测人体尿液中多种有机酸含量的方法
WO2017077401A1 (en) * 2015-11-02 2017-05-11 Pharmasan Labs, Inc. Method for the ultra-sensitive determination of catecholamines and their metabolites
CN106248838A (zh) * 2016-10-25 2016-12-21 杭州佰辰医学检验所有限公司 高通量液相色谱串联质谱的检测方法以及检测4种儿茶酚胺代谢物的方法

Non-Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
KATERINA S.ET AL.: "Analysis of vanillylmandelic acid and homovanillic acid by UPLC–MS/MS in serum for diagnostic testing for neuroblastoma", 《CLINICA CHIMICA ACTA》 *
LUANA LIONETTO ET AL.: "HPLC–mass spectrometry method for quantitative detection of neuroendocrine tumor markers: Vanillylmandelic acid, homovanillic acid and 5-hydroxyindoleacetic acid", 《CLINICA CHIMICA ACTA》 *
人用药品注册技术要求国际协调会: "《生物样品分析方法验证M10》", 17 April 2019 *
张文静 等: "尿中高香草酸和香草扁桃酸的高效液相色谱测定法", 《环境与健康杂志》 *
彭红 等: "《药物分析》", 31 August 2018, 中国医药科技出版社 *
李好枝: "《体内药物分析》", 31 July 2003, 中国医药科技出版社 *
李惠玲 等: "尿中高香草酸和香草扁桃酸测定的高效液相色谱-串联质谱法", 《中华劳动卫生职业病杂志》 *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114956997A (zh) * 2022-03-30 2022-08-30 北京丹大生物技术有限公司 香草扁桃酸半抗原衍生物及其合成方法，香草扁桃酸抗原及其制备方法，抗体及试剂盒
CN114956997B (zh) * 2022-03-30 2022-12-16 北京丹大生物技术有限公司 香草扁桃酸半抗原衍生物及其合成方法，香草扁桃酸抗原及其制备方法，抗体及试剂盒
CN114910587A (zh) * 2022-05-12 2022-08-16 军科正源(上海)生物医药科技有限公司 一种尿液检测用新型高效液相-串联质谱分析方法
CN114910587B (zh) * 2022-05-12 2024-03-19 军科正源(上海)生物医药科技有限公司 一种尿液检测用高效液相-串联质谱分析方法

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN107328871B (zh) Uplc-ms/ms联用检测人血浆和/或脑脊液中奥希替尼的药物浓度
CN111103384A (zh) 一种液质联用测定人尿液中内源性高香草酸和香草扁桃酸浓度的方法
CN111579681A (zh) 一种同时检测血清中多种抗精神病药物的试剂盒
CN113295805B (zh) 一种药物中水合肼的检测方法
CN111458417B (zh) 联合检测待测样品中多种抗生素的方法及试剂盒
CN113125611B (zh) 叶酸中杂质6-甲酰蝶呤含量的检测方法
CN110243963A (zh) 一种人血浆中卡托普利的lc-ms/ms检测方法
CN113917007A (zh) 检测人尿液儿茶酚胺及其中间代谢物的试剂盒及测试方法
CN113484430A (zh) 一种采用高效液相色谱法测定l-丙氨酸异丙酯盐酸盐有关物质的方法
CN116973488A (zh) 一种血清中25-羟基维生素d的检测方法
CN111103383A (zh) 一种液质联用同时测定人血浆中内源性皮质醇、皮质酯酮、雄烯二酮、睾酮浓度的方法
CN112946150A (zh) 一种快速检测人体尿液中高香草酸、香草扁桃酸、5-羟基吲哚乙酸及肌酐的方法及试剂盒
CN113325100B (zh) 一种同时测定多种脂肪酸在血液中含量的方法及其应用
CN114689737B (zh) 一种s-邻氯苯甘氨酸甲酯酒石酸盐有关物质的分析方法
CN113820424A (zh) 一种同时测定人血浆中14种抗抑郁药浓度的hplc-ms/ms方法
CN115166125A (zh) 一种采用超高效液相色谱-串联质谱快速测定人血浆中艾曲泊帕浓度的方法
CN114994213A (zh) 一种测定人血浆中抗肿瘤药物酪氨酸激酶抑制血药浓度的试剂盒及测定方法
CN114624361A (zh) 同时测定人血浆中别嘌醇和氧别嘌醇浓度的方法
CN114755346A (zh) 一种环孢素软胶囊有关物质的测定方法
KR20180103961A (ko) 인슐린 유사체에 대한 생물학적 분석 방법
CN111103381A (zh) 一种液质联用测定人血浆中尼美舒利浓度的方法
CN116879428B (zh) 一种L-α-甘磷酸胆碱中磷酸胆碱残留含量的高效液相分析方法
CN115144517B (zh) 一种检测样本中肌氨酸及其代谢物的方法及其试剂盒和应用
CN116858978B (zh) 一种同时检测门冬胰岛素和德谷胰岛素的方法及其血浆样品处理方法
CN112730637B (zh) 一种l-苹果酸有关物质的hplc检测方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20200505