CN114910587A - 一种尿液检测用新型高效液相-串联质谱分析方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及尿液检测技术领域，且公开了一种尿液检测用新型高效液相‑串联质谱分析方法，包括以下步骤：吸附去除：每毫升人尿液中添加0.1g活性炭，振荡2小时，室温4000g条件下离心10分钟，取上层清液，用0.22μm滤膜过滤得到处理后的经活性炭吸附的尿液基质，作为替代基质用于配制标准曲线和质控样品。该尿液检测用新型高效液相‑串联质谱分析方法，建立了一种准确可靠的检测人尿液中尿酸、黄嘌呤、次黄嘌呤和肌酐的高效液相色谱‑串联质谱方法；通过一次样品处理，可以同时得到人尿液中尿酸、黄嘌呤、次黄嘌呤和肌酐的浓度结果；肌酐作为归一化校准物，与尿酸、黄嘌呤、次黄嘌呤一起提取和检测，最大程度减少了检测误差。
Description
技术领域
本发明涉及尿液检测技术领域，具体为一种尿液检测用新型高效液相-串联质谱分析方法。
背景技术
尿酸(UA)、黄嘌呤(XA)和次黄嘌呤(HX)是人类和高等灵长类动物嘌呤代谢的降解产物，尿酸是黄嘌呤氧化酶由黄嘌呤和次黄嘌呤产生，而黄嘌呤和次黄嘌呤由嘌呤产生，因此黄嘌呤和次黄嘌呤属于中间产物，尿酸是嘌呤代谢的最终氧化产物，这三种产物都能穿透细胞膜并在胞外液中累积，其在人尿液中的浓度水平是许多临床症状的标志，包括围产期窒息、脑缺血、高尿酸血症和痛风，因此准确检测和定量尿酸、XA、在黄嘌呤氧化酶系统稳态的研究和相关疾病的早期临床诊断中，体液中的HX是至关重要的，黄嘌呤氧化酶和黄嘌呤脱氢酶是人体内黄嘌呤氧化还原酶的两种形式，黄嘌呤脱氢酶可以通过蛋白水解和半胱氨酸氧化不可逆地转化为黄嘌呤氧化酶，黄嘌呤氧化酶催化次黄嘌呤(HX)氧化为黄嘌呤(X)，从而进一步氧化为尿酸，尿酸是人体内嘌呤核苷代谢的最终产物，高血尿酸(UA)是痛风和肾结石的一个诱发因素，也是代谢综合征和心血管疾病的一个危险因素，研究痛风患者尿液中尿酸、黄嘌呤和次黄嘌呤的变化，可以帮助了解患者体内的黄嘌呤氧化酶系统状况以及为痛风患者的病情提供依据，对于黄嘌呤氧化酶抑制剂的药物开发，尿液中尿酸、黄嘌呤和次黄嘌呤的浓度可作为生物标记物，为评估药物的疗效提供数据，可为PK/PD建模指导药物开发。
肌酐在体内以恒定的速率清除，血液中的肌酐水平通常稳定，由于尿酸、黄嘌呤和次黄嘌呤的肾清除率受到肾功能的影响，所以为了减少这种干扰，通常采用肌酐浓度进行归一化校正，目前常见的尿液中以上4种物质的检测方法，存在以下缺点：1)以上4种物质需要用到不同的检测方法，需要花费大量时间；2)血尿尿酸的浓度检测常规有如下方法：其中有酶法和、磷钨酸还原法和高效液相-紫外检测法，这两种几种方法灵敏度较差且波动性大；电化学法灵敏度尚可，但是专属性差，易于受到血中抗坏血酸和多巴胺的干扰；高效液相-紫外吸收色谱法近年来也应用于尿酸检测，但是紫外检测器的灵敏度低，选择性差，且耗时长，每个样品的分析时间通常超过15分钟；而气相串联质谱的灵敏度和选择性高，但是样品需要进行衍生化，样品前处理步骤繁琐；磷钨酸还原法专属性差，干扰物难以分离；3)有文献报导尿液中黄嘌呤和次黄嘌呤的检测采用偶联酶催化分光光度法，此方法依赖于化学反应，灵敏度低，样品处理复杂，重现性不佳；高效液相-紫外吸收色谱法也可用于黄嘌呤和次黄嘌呤的检测，但是由于黄嘌呤和次黄嘌呤在尿液中浓度极低，高效液相-紫外吸收色谱法无法提供足够的检测灵敏度和选择性；4)血尿肌酐的检测常采用碱性苦味酸法，此种方法容易被肌酐衍生物或同系物，例如乙内酰脲、胆红素、丙酮酸等物质干扰，可导致尿液肌酐的检测结果偏高；酶法检测尿液肌酐通过肌酐与酶产生红色的醌亚胺，使用光度计检测，该方法的缺点是易被体内还原性物质干扰，导致色素形成减少，测定结果偏低，且此方法的线性范围通常较窄；5)业内公认的检测尿液中小分子物质的金标准是高效液相色谱-串联质谱法，以往的文献报导中，未有高效液相色谱-串联质谱法能够同时检测尿液中尿酸、黄嘌呤、次黄嘌呤和肌酐；6)以往高效液相色谱-串联质谱法难以同时检测以上4种分子的主要原因为：a)尿酸、黄嘌呤、次黄嘌呤和肌酐是内源性物质，配制标准曲线进行定量时，如果使用人尿液进行配制，会存在内源性干扰，导致检测结果偏低；b)尿酸、黄嘌呤、次黄嘌呤和肌酐的极性较大，在色谱柱上不易保留，进入串联质谱后，在离子源处容易产生基质效应；c)人尿液中含有多种嘌呤类物质，结构与待测物极为相似，导致检测时容易有类似物产生干扰，且这些类似物容易互相转化，影响检测的准确度；d)以往方法未使用内标进行校正，或者使用类似物作为内标，较少用到同位素内标；方法学的重现性较差。
发明内容
(一)解决的技术问题
针对现有技术的不足，本发明提供了一种尿液检测用新型高效液相-串联质谱分析方法来解决上述提出的问题。
(二)技术方案
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种尿液检测用新型高效液相-串联质谱分析方法，包括以下步骤：
吸附去除：
每毫升人尿液中添加0.1g活性炭，振荡2小时，室温4000g条件下离心10分钟，取上层清液，用0.22μm滤膜过滤得到处理后的经活性炭吸附的尿液基质，作为替代基质用于配制标准曲线和质控样品；
配置溶液：
1)含0.1％甲酸水溶液：取1000mL的超纯水于1000mL试剂瓶中，加 1.0ml甲酸，混合均匀；
2)含0.1％甲酸乙腈溶液：取1000mL的乙腈于1000mL试剂瓶中，加 1.0ml甲酸，混合均匀；
3)含0.1％氨水的50％甲醇水溶液：取500mL甲醇、500mL超纯水加入 1000mL试剂瓶中，加入4.0mL氨水(28％～30％)，混合均匀；
4)含0.1％氨水的水溶液：取100mL超纯水加入100mL试剂瓶中，加入0.40mL氨水(28％～30％)，混合均匀；
分析物储备液的配制：
于透明玻璃瓶(铝箔纸包裹)中，精密称取尿酸、黄嘌呤、次黄嘌呤和肌酐对照标准物质，经校正因子折算后，加入适量含0.1％氨水的水溶液，配制成浓度均为0.500mg/mL的尿酸、黄嘌呤、次黄嘌呤和肌酐储备液；
内标储备液和工作溶液的配制：
于透明玻璃瓶(包裹铝箔纸)中，精密称取尿酸-1,3-15N2对照标准物质，经校正因子折算后，加入适量含0.1％氨水的水溶液，配制成浓度为0.500 mg/mL尿酸内标储备液；对于黄嘌呤-13C15N2和次黄嘌呤-13C2,15N对照标准物质(1mg/瓶)，经校正因子折算后，直接向棕色玻璃瓶中加入适量含0.1％氨水的水溶液，配制成浓度均为0.500mg/mL黄嘌呤内标储备液和次黄嘌呤内标储备液；精密称取肌酐-d3对照标准物质，经校正因子折算后，加入适量含0.1％氨水的水溶液，配制成浓度为0.500mg/mL肌酐内标储备液，于-10～-30 ℃冰箱中保存；
标准曲线样品和质控样品的配制:
尿酸标准曲线的浓度点为5.00，10.0，25.0，160，400，1000，1600， 2000μg/mL；黄嘌呤和次黄嘌呤标准曲线的浓度点均为0.200，0.400，1.00， 6.40，16.0，40.0，64.0，80.0μg/mL；肌酐标准曲线的浓度点为10.0，20.0， 50.0，320，800，2000，3200，4000μg/mL；标准曲线样品配制于替代基质中，替代基质为活性炭吸附后的人尿液；
对于尿酸，质控样品包含4个浓度水平，分别为5.00(LLOQ QC),15.0 (LQC),600(MQC),1500(HQC)μg/mL；
对于黄嘌呤和次黄嘌呤：质控样品包含4个浓度水平，分别为0.0100 (LLOQ QC),0.0300(LQC),1.20(MQC),3.00(HQC)μg/mL；
对于肌酐，质控样品包含4个浓度水平，分别为10.0(LLOQ QC),30.0 (LQC),1200(MQC),3000(HQC)μg/mL；
样品处理：
取连排管，按如下描述加入样品：对于双空白样品(Double Blank)、零空白样品(Zero Blank)，空白平衡样品(Equil-Blank，如果有)加入50.0μL替代基质；对于标准曲线样品、质控样品、待测样品、非空白平衡样品(如果有)和系统适用性样品(如果有)、ULOQwithout IS(如果有)，加入50.0μ L相应的基质样品；
对于零空白样品、标准曲线样品、质控样品、待测样品、非空白平衡样品(如果有)和系统适用性样品(如果有)，加入25.0μL内标工作溶液；对于双空白样品(Double Blank)、空白平衡样品(Equil-Blnak，如果有) 和ULOQ without IS(如果有)，加入25.0μL 0.1％氨水溶液。
进一步，所述含0.1％甲酸水溶液保存于室温条件下，有效期自配制日起两周内，所述含0.1％甲酸乙腈溶液保存于室温条件下，有效期自配制日起两周内。
进一步，所述含0.1％氨水的50％甲醇水溶液保存于室温条件下，有效期自配制日起一个月，所述含0.1％氨水的水溶液保存于室温条件下，有效期当天使用。
进一步，所述浓度为0.500mg/mL的尿酸、黄嘌呤、次黄嘌呤和肌酐储备液存放于-10～-30℃冰箱中保存待用。
进一步，所述步骤样品处理还包括以下步骤：每孔加入200μL ACN,混匀，使用硅胶盖将板密封，剧烈振荡10min，4℃3800×g离心10min，取 100μL上清到一块新的96孔板里，每孔加入100μL纯水，振荡10min混匀，进样。
(三)有益效果
与现有技术相比，本申请的技术方案具备以下有益效果：
该尿液检测用新型高效液相-串联质谱分析方法，建立了一种准确可靠的检测人尿液中尿酸、黄嘌呤、次黄嘌呤和肌酐的高效液相色谱-串联质谱方法；通过一次样品处理，可以同时得到人尿液中尿酸、黄嘌呤、次黄嘌呤和肌酐的浓度结果；肌酐作为归一化校准物，与尿酸、黄嘌呤、次黄嘌呤一起提取和检测，最大程度减少了检测误差，可以准确的进行浓度校正，得到的校正后的结果可以更加准确反映药效作用；使用活性炭吸附的人尿液作为替代基质，避免了内源性干扰的同时，还消除了基质效应的影响；方法学使用了标准品来配制标准曲线，通过同位素内标进行结果校正，检测结果具有良好的准确性；串联质谱作为检测器，具备高灵敏度、特异性和重现性，是检测尿液中此类嘌呤物质的金标准；该方法学检测一个样品的时间在3.5分钟以内，可以满足临床研究中生物样品检测的高通量要求；该方法样品处理步骤简单易操作，每次检测使用的尿液量只有0.05毫升，满足采血量要尽量低的伦理要求。
表1为本发明检测用到的对照标准物质；
表2为本发明仪器设备；
表3为本发明液相色谱条件；
表4为本发明质谱条件；
表5为本发明精密度和准确度。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例：
请参照表1-表5，一种尿液检测用新型高效液相-串联质谱分析方法，包括以下步骤：
S1吸附去除：
每毫升人尿液中添加0.1g活性炭，振荡2小时，室温4000g条件下离心10分钟，取上层清液，用0.22μm滤膜过滤得到处理后的经活性炭吸附的尿液基质，作为替代基质用于配制标准曲线和质控样品；
S2配置溶液：
1)含0.1％甲酸水溶液：取1000mL的超纯水于1000mL试剂瓶中，加 1.0ml甲酸，混合均匀，保存于室温条件下，有效期自配制日起两周内；
2)含0.1％甲酸乙腈溶液：取1000mL的乙腈于1000mL试剂瓶中，加 1.0ml甲酸，混合均匀，保存于室温条件下，有效期自配制日起两周内；
3)含0.1％氨水的50％甲醇水溶液：取500mL甲醇、500mL超纯水加入1000mL试剂瓶中，加入4.0mL氨水(28％～30％)，混合均匀，保存于室温条件下，有效期自配制日起一个月；
4)含0.1％氨水的水溶液：取100mL超纯水加入100mL试剂瓶中，加入0.40mL氨水(28％～30％)，混合均匀，保存于室温条件下，有效期当天使用；
S3分析物储备液的配制：
于透明玻璃瓶(铝箔纸包裹)中，精密称取尿酸、黄嘌呤、次黄嘌呤和肌酐对照标准物质，经校正因子折算后，加入适量含0.1％氨水的水溶液，配制成浓度均为0.500mg/mL的尿酸、黄嘌呤、次黄嘌呤和肌酐储备液，存放于-10～-30℃冰箱中保存待用；
S4内标储备液和工作溶液的配制：
于透明玻璃瓶(包裹铝箔纸)中，精密称取尿酸-1,3-15N2对照标准物质，经校正因子折算后，加入适量含0.1％氨水的水溶液，配制成浓度为0.500 mg/mL尿酸内标储备液；对于黄嘌呤-13C15N2和次黄嘌呤-13C2,15N对照标准物质(1mg/瓶)，经校正因子折算后，直接向棕色玻璃瓶中加入适量含0.1％氨水的水溶液，配制成浓度均为0.500mg/mL黄嘌呤内标储备液和次黄嘌呤内标储备液；精密称取肌酐-d3对照标准物质，经校正因子折算后，加入适量含0.1％氨水的水溶液，配制成浓度为0.500mg/mL肌酐内标储备液，于-10～-30 ℃冰箱中保存；
S5标准曲线样品和质控样品的配制:
尿酸标准曲线的浓度点为5.00，10.0，25.0，160，400，1000，1600， 2000μg/mL；黄嘌呤和次黄嘌呤标准曲线的浓度点均为0.200，0.400，1.00，6.40，16.0，40.0，64.0，80.0μg/mL；肌酐标准曲线的浓度点为10.0，20.0， 50.0，320，800，2000，3200，4000μg/mL；标准曲线样品配制于替代基质中，替代基质为活性炭吸附后的人尿液；
对于尿酸，质控样品包含4个浓度水平，分别为5.00(LLOQ QC),15.0 (LQC),600(MQC),1500(HQC)μg/mL；
对于黄嘌呤和次黄嘌呤：质控样品包含4个浓度水平，分别为0.0100 (LLOQ QC),0.0300(LQC),1.20(MQC),3.00(HQC)μg/mL；
对于肌酐，质控样品包含4个浓度水平，分别为10.0(LLOQ QC),30.0 (LQC),1200(MQC),3000(HQC)μg/mL；
S6样品处理：
取连排管，按如下描述加入样品：对于双空白样品(Double Blank)、零空白样品(Zero Blank)，空白平衡样品(Equil-Blank，如果有)加入50.0μ L替代基质；对于标准曲线样品、质控样品、待测样品、非空白平衡样品(如果有)和系统适用性样品(如果有)、ULOQwithout IS(如果有)，加入50.0μ L相应的基质样品；
对于零空白样品、标准曲线样品、质控样品、待测样品、非空白平衡样品(如果有)和系统适用性样品(如果有)，加入25.0μL内标工作溶液；对于双空白样品(Double Blank)、空白平衡样品(Equil-Blnak，如果有) 和ULOQ without IS(如果有)，加入25.0μL 0.1％氨水溶液，每孔加入200μ L ACN,混匀，使用硅胶盖将板密封，剧烈振荡10min，4℃3800×g离心10 min，取100μL上清到一块新的96孔板里，每孔加入100μL纯水，振荡 10min混匀，进样。
溶液稳定性：
尿酸、黄嘌呤、次黄嘌呤、肌酐的储备液在室温储存5小时下保持稳定；
尿酸、黄嘌呤、次黄嘌呤、肌酐的储备液在2～8℃储存79天保持稳定；
尿酸、黄嘌呤、次黄嘌呤、肌酐的工作液在室温储存5小时下保持稳定；
尿酸、黄嘌呤、次黄嘌呤、肌酐的工作液在2～8℃储存14天保持稳定。
基质稳定性：
含尿酸、黄嘌呤、次黄嘌呤、肌酐的尿液样品室温放置4小时保持稳定；
含尿酸、黄嘌呤、次黄嘌呤、肌酐的尿液样品在5次冻融循环后保持稳定；
含尿酸、黄嘌呤、次黄嘌呤、肌酐的尿液样品在-10～-30℃和-60～-90℃条件下储存178天保持稳定。
本发明的有益效果是：建立了一种准确可靠的检测人尿液中尿酸、黄嘌呤、次黄嘌呤和肌酐的高效液相色谱-串联质谱方法；通过一次样品处理，可以同时得到人尿液中尿酸、黄嘌呤、次黄嘌呤和肌酐的浓度结果；肌酐作为归一化校准物，与尿酸、黄嘌呤、次黄嘌呤一起提取和检测，最大程度减少了检测误差，可以准确的进行浓度校正，得到的校正后的结果可以更加准确反映药效作用；使用活性炭吸附的人尿液作为替代基质，避免了内源性干扰的同时，还消除了基质效应的影响；方法学使用了标准品来配制标准曲线，通过同位素内标进行结果校正，检测结果具有良好的准确性；串联质谱作为检测器，具备高灵敏度、特异性和重现性，是检测尿液中此类嘌呤物质的金标准；该方法学检测一个样品的时间在3.5分钟以内，可以满足临床研究中生物样品检测的高通量要求；该方法样品处理步骤简单易操作，每次检测使用的尿液量只有0.05毫升，满足采血量要尽量低的伦理要求。
表1
表2
表3
表4
选择性
基质效应
表5
需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同要素。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
Claims (5)
1.一种尿液检测用新型高效液相-串联质谱分析方法，其特征在于：包括以下步骤：
S1吸附去除：
每毫升人尿液中添加0.1g活性炭，振荡2小时，室温4000g条件下离心10分钟，取上层清液，用0.22μm滤膜过滤得到处理后的经活性炭吸附的尿液基质，作为替代基质用于配制标准曲线和质控样品；
S2配置溶液：
1)含0.1％甲酸水溶液：取1000mL的超纯水于1000mL试剂瓶中，加1.0ml甲酸，混合均匀；
2)含0.1％甲酸乙腈溶液：取1000mL的乙腈于1000mL试剂瓶中，加1.0ml甲酸，混合均匀；
3)含0.1％氨水的50％甲醇水溶液：取500mL甲醇、500mL超纯水加入1000mL试剂瓶中，加入4.0mL氨水(28％～30％)，混合均匀；
4)含0.1％氨水的水溶液：取100mL超纯水加入100mL试剂瓶中，加入0.40mL氨水(28％～30％)，混合均匀；
S3分析物储备液的配制：
于透明玻璃瓶(铝箔纸包裹)中，精密称取尿酸、黄嘌呤、次黄嘌呤和肌酐对照标准物质，经校正因子折算后，加入适量含0.1％氨水的水溶液，配制成浓度均为0.500mg/mL的尿酸、黄嘌呤、次黄嘌呤和肌酐储备液；
S4内标储备液和工作溶液的配制：
于透明玻璃瓶(包裹铝箔纸)中，精密称取尿酸-1,3-15N2对照标准物质，经校正因子折算后，加入适量含0.1％氨水的水溶液，配制成浓度为0.500mg/mL尿酸内标储备液；对于黄嘌呤-13C15N2和次黄嘌呤-13C2,15N对照标准物质(1mg/瓶)，经校正因子折算后，直接向棕色玻璃瓶中加入适量含0.1％氨水的水溶液，配制成浓度均为0.500mg/mL黄嘌呤内标储备液和次黄嘌呤内标储备液；精密称取肌酐-d3对照标准物质，经校正因子折算后，加入适量含0.1％氨水的水溶液，配制成浓度为0.500mg/mL肌酐内标储备液，于-10～-30°C冰箱中保存；
S5标准曲线样品和质控样品的配制:
尿酸标准曲线的浓度点为5.00，10.0，25.0，160，400，1000，1600，2000μg/mL；黄嘌呤和次黄嘌呤标准曲线的浓度点均为0.200，0.400，1.00，6.40，16.0，40.0，64.0，80.0μg/mL；肌酐标准曲线的浓度点为10.0，20.0，50.0，320，800，2000，3200，4000μg/mL；标准曲线样品配制于替代基质中，替代基质为活性炭吸附后的人尿液；
对于尿酸，质控样品包含4个浓度水平，分别为5.00(LLOQ QC),15.0(LQC),600(MQC),1500(HQC)μg/mL；
对于黄嘌呤和次黄嘌呤：质控样品包含4个浓度水平，分别为0.0100(LLOQ QC),0.0300(LQC),1.20(MQC),3.00(HQC)μg/mL；
对于肌酐，质控样品包含4个浓度水平，分别为10.0(LLOQ QC),30.0(LQC),1200(MQC),3000(HQC)μg/mL；
S6样品处理：
取连排管，按如下描述加入样品：对于双空白样品(Double Blank)、零空白样品(ZeroBlank)，空白平衡样品(Equil-Blank，如果有)加入50.0μL替代基质；对于标准曲线样品、质控样品、待测样品、非空白平衡样品(如果有)和系统适用性样品(如果有)、ULOQ withoutIS(如果有)，加入50.0μL相应的基质样品；
对于零空白样品、标准曲线样品、质控样品、待测样品、非空白平衡样品(如果有)和系统适用性样品(如果有)，加入25.0μL内标工作溶液；对于双空白样品(Double Blank)、空白平衡样品(Equil-Blnak，如果有)和ULOQ without IS(如果有)，加入25.0μL 0.1％氨水溶液。
2.根据权利要求1所述的一种尿液检测用新型高效液相-串联质谱分析方法，其特征在于：所述含0.1％甲酸水溶液保存于室温条件下，有效期自配制日起两周内，所述含0.1％甲酸乙腈溶液保存于室温条件下，有效期自配制日起两周内。
3.根据权利要求1所述的一种尿液检测用新型高效液相-串联质谱分析方法，其特征在于：所述含0.1％氨水的50％甲醇水溶液保存于室温条件下，有效期自配制日起一个月，所述含0.1％氨水的水溶液保存于室温条件下，有效期当天使用。
4.根据权利要求1所述的一种尿液检测用新型高效液相-串联质谱分析方法，其特征在于：所述浓度为0.500mg/mL的尿酸、黄嘌呤、次黄嘌呤和肌酐储备液存放于-10～-30℃冰箱中保存待用。
5.根据权利要求1所述的一种尿液检测用新型高效液相-串联质谱分析方法，其特征在于：所述步骤S6还包括以下步骤：每孔加入200μL ACN,混匀，使用硅胶盖将板密封，剧烈振荡10min，4℃3800×g离心10min，取100μL上清到一块新的96孔板里，每孔加入100μL纯水，振荡10min混匀，进样。
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Also Published As
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