CN108627605A - 一种发酵肉制品中酪胺含量的检测方法 - Google Patents

一种发酵肉制品中酪胺含量的检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种发酵肉制品中酪胺含量的检测方法，属于食品分析技术领域。所述方法为UPLC方法，使用Waters AcquityⅠclass超高效液相色谱仪，C18柱。流动相为去离子水和乙腈，流速0.3mL·min‑1，紫外检测波长254nm，检测时间20min，酪胺的保留时间为5.8min，该方法的检测限为50ng/mL，回收率为96.9％。本发明方法样品用量少，时间短，方法线性良好，操作简单，重现性好，准确度高。

Description

一种发酵肉制品中酪胺含量的检测方法
技术领域：
本发明涉及一种食品检测方法，具体涉及一种发酵肉制品中酪胺含量的超高效液相色谱检测方法。
背景技术：
生物胺是一类具有生物活性含氮的低分子碱性化合物,酪胺又名对羟基苯乙胺，是生物胺的一种。生物胺作为一类生理活性物质，参与生物体内的代谢活动。生物胺广泛存在于各类食品中，在富含蛋白质和氨基酸的食品中相对更多，特别是鱼类及其制品、乳酪、肉制品和发酵类食品。食品中的生物胺主要有2个来源：一种是原材料本身含有的各种生物胺，另一种是通过微生物的脱羧反应产生的，这种方式是生物胺的主要来源。因为传统的发酵过程难以控制、机理不明晰，天然发酵食品中的生物胺问题愈发受到人们关注。发酵肉制品的制作普遍采用自然发酵的方法，发酵菌种复杂，因此存在较高的微生物源性生物胺的安全隐患。出于对食品安全的考虑，人们应尽可能降低生物胺的摄入量，而检测和监控食品中生物胺的含量则是必不可少的一环。由于酪氨酸在发酵过程中产生酪胺,因此对发酵肉制品中酪胺的分析不仅可以保障食品安全，还可以获得与食品生产和发酵工艺过程相关的有用信息。
生物胺具有毒性,在人体内积累到一定程度会对人体产生毒害,会引起头痛、恶心、呕吐、腹泻、心悸、血压变化、呼吸紊乱等过敏反应,严重的还会危及生命。所有生物胺中，对人类健康影响最大的是组胺和酪胺。酪胺具有增高血压的作用，以及促进末梢血管收缩，剌激心律加快，增加血糖浓度，消除神经系统中的去甲肾上腺素，从而引发偏头疼。人体口服酪胺超过100mg可引起偏头痛，超过1080mg可引起中毒性肿胀，欧盟规定食品中酪胺不得超过100-800mg/kg。
生物胺的检测方法有气相色谱-串联质谱法、离子色谱法、高效液相色谱法、薄层色谱法、高效液相色谱-串联质谱法等等,这些方法的前处理步骤都较为繁琐,不易操作。本发明采用超高效液相色谱法(ultra-performance liquid chromatography,UPLC)测定酪胺的检测方法,通过使用小粒径填料的色谱柱,可以获得更好的分离效果和更短的分析时间,同时简化前处理步骤。因此本发明方法具有样品用量少，时间短，方法线性良好，操作简单，重现性好，准确度高等优点。
发明内容：
本发明要解决的技术问题在于简化样品预处理步骤，缩短样品检测时间，研究设计采用UPLC检测方法快速准确地测定发酵肉制品中酪胺含量。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：一种发酵肉制品中酪胺含量的检测方法，包括以下步骤：
(1)标准溶液的制备：精密称取酪胺用0.1M盐酸配成浓度为1.0mg·mL-1的溶液，微孔滤膜0.22μm过滤4℃保存备用。使用的梯度标准工作溶液用0.1M盐酸稀释到所需浓度。精密称取内标用去离子水配制成浓度为10.0μg·mL-1的溶液，微孔滤膜0.22μm过滤4℃保存备用
(2)样品溶液的制备：发酵肉制品切成肉糜，加三氯乙酸用分散均质器均质1.0min，离心机上4000rpm离心10min，沉淀再次加三氯乙酸匀浆离心2次后，合并上清液用三氯乙酸定容，提取液用微孔滤膜0.22μm过滤后4℃保存备用。
(3)衍生化反应：取标准溶液或样品100μl，加10μg·mL-1内标溶液100μl，
分别加用氢氧化钠调整pH值为10的饱和碳酸氢钠100μl和用丙酮配制的5.0-10.0mg·mL-1丹磺酰氯200μl，在50-60℃下避光反应10.0-15.0min。反应结束后加氨水100μl终止反应20.0-30.0min。加乙腈定容到2.0mL。微孔滤膜0.22μm过滤。取滤液上柱检测。
(4)检测：采用Waters AcquityⅠclass超高效液相色谱仪，C18，2.1×50mm，1.7μm色谱柱，流动相为去离子水和乙腈，流速0.3mL·min-1，紫外检测波长254nm，进样量10μL，柱温55℃，流动相A为乙腈，流动相B为去离子水，检测器：PDA检测器。采用内标法以目标分析物峰面积和内标峰面积的比值进行定量计算样品中酪胺的含量。
所述步骤(1)制备混合梯度标准工作溶液的具体过程如下:将浓度为1.0mg·mL-1的酪胺标准溶液用0.1M盐酸配制浓度梯度为0.5、1.0、5.0、10.0、20.0、40.0、60.0、80.0μg·mL-1的标准工作溶液，每个浓度的混合标准工作溶液中内标苯甲胺的浓度为10μg·mL-1。
UPLC的洗脱程序为：流动相A为乙腈，流动相B为去离子水，采用梯度洗脱，在0-15min,A 50-85％，B 50-15％,15-16min，A 85-50％，B 15-50％，16-20min,A 50％，B50％。
本发明与文献相比,分离方法处理过程简单，建立了一种适合于测定发酵肉制品中酪胺含量的方法,建立的方法简单可靠，可以应用于发酵肉制品中酪胺含量的检测；该方法对样品分析简单便捷,检出限低，灵敏度高，重复性和回收率好。
附图说明
图1为加有内标的标准溶液的UPLC色谱峰图；
图2为加有内标的发酵肉制品样品的UPLC色谱峰图；
图3为加有内标和酪胺标准溶液的发酵肉制品样品的UPLC色谱峰图；
图4为酪胺的标准曲线。
具体实施方式
下将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。
下面通过具体的实施例子对本发明做进一步的详细描述。
实施例1
(a)样品溶液的预处理：取发酵肉制品切成肉糜，称取均匀样品2.0g加5％三氯乙酸15.0mL用分散均质器均质1.0min后，离心机上4000rpm离心10.0min，沉淀再次加5％三氯乙酸10.0mL均质离心2次后，合并上清液用5％三氯乙酸定容到50mL，提取液用微孔滤膜0.22μm过滤后4℃保存备用。
(b)样品的衍生化反应：从滤液中取100μl样品，加入10μg·mL-1内标溶液100μl，再依次加入用氢氧化钠调整pH值为10的饱和碳酸氢钠100μl，用丙酮配制的2.0mg·mL-1丹磺酰氯200μl，在55℃下避光进行衍生化反应，反应15.0min。结束后加氨水100μl终止反应25.0min。加乙腈定容到2.0mL。微孔滤膜0.22μm过滤。取滤液上柱检测。
(c)UPLC的检测条件：采用Waters AcquityⅠclass超高效液相色谱仪，C18，2.1×50mm，1.7μm色谱柱，流动相为去离子水和乙腈，流速0.3mL·min-1，紫外检测波长254nm，进样量10μL，柱温55℃，流动相A为乙腈，流动相B为去离子水，检测器：PDA检测器。UPLC的洗脱程序为：流动相A为乙腈，流动相B为去离子水，采用梯度洗脱，在0-15min,A 50-85％，B 50-15％,15-16min，A 85-50％，B15-50％，16-20min，A 50％，B 50％。
(d)将步骤(c)测定数值与酪胺标准品线性回归方程对比，得到发酵肉制品样品中酪胺的含量。
酪胺标准品线性回归方程:精密称取酪胺100.0mg放于100mL棕色容量瓶中,用0.1M盐酸定容至刻度，即得浓度为1.0mg·mL-1的酪胺标准溶液，微孔滤膜0.22μm过滤，4℃保存备用；精密称取内标苯甲胺的质量100.0mg放于100mL容量瓶中，用去离子水配制成浓度为1.0mg·mL-1的溶液，再继续用去离子水稀释到浓度为10.0μg·mL-1的溶液，微孔滤膜0.22μm过滤4℃保存备用。
将浓度为1.0mg·mL-1的酪胺标准溶液用0.1M盐酸配制浓度梯度为0.5、1.0、5.0、10.0、20.0、40.0、60.0、80.0μg·mL-1的标准工作溶液，每个浓度的标准工作溶液的内标苯甲胺的浓度为10.0μg·mL-1。分别按步骤(b)进行衍生化反应，经0.22μm滤膜过滤后，取适量采用UPLC进行检测，UPLC法条件同步骤(c)；以峰面积的比值与浓度进行线性回归，得到酪胺标准品的线性回归方程。
实施例2
(a)样品溶液的预处理：取发酵肉制品切成肉糜，称取均匀样品5.0g加5％三氯乙酸25.0mL用分散均质器均质1.0min后，离心机上4000rpm离心10.0min，沉淀再次加5％三氯乙酸15.0mL均质离心2次后，合并上清液用5％三氯乙酸定容到50mL，提取液用微孔滤膜0.22μm过滤后4℃保存备用。
(b)样品的衍生化反应：从滤液中取100μl样品，加入10μg·mL-1内标溶液100μl，再依次加入用氢氧化钠调整pH值为10的饱和碳酸氢钠100μl，用丙酮配制的3mg·mL-1丹磺酰氯200μl，在50℃下避光进行衍生化反应，反应20.0min。反应结束后加氨水100μl终止反应30.0min。加乙腈定容到2.0mL。微孔滤膜0.22μm过滤。取滤液上柱检测。
(c)UPLC的检测条件：采用Waters AcquityⅠclass超高效液相色谱仪，C18，2.1×50mm，1.7μm色谱柱，流动相为去离子水和乙腈，流速0.3mL·min-1，紫外检测波长254nm，进样量10μL，柱温55℃，流动相A为乙腈，流动相B为去离子水，检测器：PDA检测器。UPLC的洗脱程序为：流动相A为乙腈，流动相B为去离子水，采用梯度洗脱，在0-15min,A 50-85％，B 50-15％,15-16min，A 85-50％，B15-50％,16-20min，A 50％，B 50％。
(d)将步骤(c)测定数值与酪胺标准品线性回归方程对比，得到发酵肉制品样品中酪胺的含量。
酪胺标准品线性回归方程:精密称取酪胺100.0mg放于100mL棕色容量瓶中,用0.1M盐酸定容至刻度，即得浓度为1.0mg·mL-1的酪胺标准溶液，微孔滤膜0.22μm过滤，4℃保存备用；精密称取内标苯甲胺的质量100.0mg放于100mL容量瓶中，用去离子水配制成浓度为1.0mg·mL-1的溶液，再继续用去离子水稀释到浓度为10μg·mL-1的溶液，微孔滤膜0.22μm过滤4℃保存备用。
将浓度为1.0mg·mL-1的酪胺标准溶液用0.1M盐酸配制浓度梯度为0.5、1.0、5.0、10.0、20.0、40.0、60.0、80.0μg·mL-1的标准工作溶液，每个浓度的标准工作溶液的内标苯甲胺的浓度为10.0μg·mL-1。分别按步骤(b)进行衍生化反应，经0.22μm滤膜过滤后，取适量采用UPLC进行检测，UPLC法条件同步骤(c)；以峰面积的比值与浓度进行线性回归，得到酪胺标准品的线性回归方程。
实施例3
(a)样品溶液的预处理：取发酵肉制品切成肉糜，称取均匀样品3.0g加5％三氯乙酸20.0mL用分散均质器均质1.0min后，离心机上4000rpm离心10.0min，沉淀再次加5％三氯乙酸10.0mL均质离心2次后，合并上清液用5％三氯乙酸定容到50mL，提取液用微孔滤膜0.22μm过滤后4℃保存备用。
(b)样品的衍生化反应：从滤液中取100μl样品，加入10μg·mL-1内标溶液100μl，再依次加入用氢氧化钠调整pH值为10的饱和碳酸氢钠100μl，用丙酮配制的5.0mg·mL-1丹磺酰氯200μl，在60℃下避光进行衍生化反应，反应10.0min。反应结束后加氨水100μl终止反应20.0min。加乙腈定容到2.0mL。微孔滤膜0.22μm过滤。取滤液上柱检测。
(c)UPLC的检测条件：采用Waters AcquityⅠclass超高效液相色谱仪，C18，2.1×50mm，1.7μm色谱柱，流动相为去离子水和乙腈，流速0.3mL·min-1，紫外检测波长254nm，进样量10μL，柱温55℃，流动相A为乙腈，流动相B为去离子水，检测器：PDA检测器。UPLC的洗脱程序为：流动相A为乙腈，流动相B为去离子水，采用梯度洗脱，在0-15min,A 50-85％，B 50-15％,15-16min，A 85-50％，B 15-50％,16-20min，A 50％，B 50％。
(d)将步骤(c)测定数值与酪胺标准品线性回归方程对比，得到发酵肉制品样品中酪胺的含量。
酪胺标准品线性回归方程:精密称取酪胺100.0mg放于100mL棕色容量瓶中,用0.1M盐酸定容至刻度，即得浓度为1.0mg·mL-1的酪胺标准溶液，微孔滤膜0.22μm过滤，4℃保存备用；精密称取内标苯甲胺的质量100.0mg放于100mL容量瓶中，用去离子水配制成浓度为1.0mg·mL-1的溶液，再继续用去离子水稀释到浓度为10.0μg·mL-1的溶液，微孔滤膜0.22μm过滤4℃保存备用。
将浓度为1.0mg·mL-1的酪胺标准溶液用0.1M盐酸配制浓度梯度为0.5、1.0、5.0、10.0、20.0、40.0、60.0、80.0μg·mL-1的标准工作溶液，每个浓度的标准工作溶液的内标苯甲胺的浓度为10.0μg·mL-1。分别按步骤(b)进行衍生化反应，经0.22μm滤膜过滤后，取适量采用UPLC进行检测，UPLC法条件同步骤(c)；各浓度做3个平行，分别进样检测。以其中一次进样为例，得到的色谱峰图如图3所示。以峰面积的比值的平均值为横坐标，以对应的浓度为纵坐标，进行线性回归，得到回归曲线见图4。
检测方法的分析参数见表1-3。
表1酪胺标准品的线性回归方程及相关参数
注:x:酪胺浓度(μg·mL-1)；y:峰面积比值；*检出限:信噪比(S/N)为3；**定量限:信噪比(S/N)为10。
表1和图4可以看出，得到的线性回归方程的R2为0.9996，线性稳定，误差小。从表1可知最低检出浓度为250ng·mL-1，检测限为50ng·mL-1，说明该方法的检出限低，符合痕量测定的要求。对同一样品连续进样8次测得的相对标准偏差为0.06％，说明仪器的精密度良好。对同一样品在3天内分别测得发现相对标准偏差为0.20％，说明方法的稳定性好。
表2重复性和重现性实验
对标准溶液和发酵肉制品样品在同一天内连续测得6次，相对标准偏差分别为2.12和1.09％；对标准溶液和发酵肉制品样品在3天内每天测得1次，相对标准偏差为3.13和4.84％。结果说明该方法具有良好的重复性和重现性。
表3加标回收率实验
从表3可以可看出，该检测方法的平均回收率为96.9％，相对标准偏差为7.28％(n＝9)。
根据标准样品中酪胺的线性回归方程得到发酵肉制品样品中酪胺含量，如表4所示。
表4发酵肉制品样品中酪胺的含量(Mean±SD)(n＝3)
从表4可以看出，实验测定的五种发酵肉制品中酪胺的含量在9-557mg/kg范围内，没有超出欧盟规定的标准要求。
本发明提供的UPLC测定发酵肉制品中酪胺含量的方法，样品用量少，测定结果快速准确，分析时间快，溶剂载量少，实验结果表明，测定结果稳定，具有良好的专一性，精密度和回收率。具有微量、简便、快捷、灵敏等特点，能符合痕量测定的要求。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改，等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (4)

1.一种发酵肉制品中酪胺含量的检测方法，其特征在于该方法包括下列步骤：
(1)标准溶液的制备：精密称取酪胺用0.1M盐酸配成浓度为1.0mg·mL-1的溶液，微孔滤膜0.22μm过滤4℃保存备用。使用的梯度标准工作溶液用0.1M盐酸稀释到所需浓度。精密称取内标用去离子水配制成浓度为10.0μg·mL-1的溶液，微孔滤膜0.22μm过滤后4℃保存备用。
(2)样品溶液的制备：发酵肉制品切成肉糜，加三氯乙酸用分散均质器均质1.0min，离心机上4000rpm离心10min，沉淀再次加三氯乙酸均质离心2次后，合并上清液用三氯乙酸定容，提取液用微孔滤膜0.22μm过滤后4℃保存备用。
(3)衍生化反应：取标准溶液或样品100μl，加10.0μg·mL-1内标溶液100μl，
分别加用氢氧化钠调整pH值为10的饱和碳酸氢钠100μl和用丙酮配制的5.0-10.0mg·mL-1丹磺酰氯200μl，在50-60℃下避光反应10.0-15.0min。反应结束后加氨水100μl终止反应20.0-30.0min。加乙腈定容到2.0mL。微孔滤膜0.22μm过滤。取滤液上柱检测。
(4)检测：采用Waters AcquityⅠclass超高效液相色谱仪，C18，2.1×50mm，1.7μm色谱柱，流动相为去离子水和乙腈，流速0.3mL·min-1，紫外检测波长254nm，进样量10μL，柱温55℃，流动相A为乙腈，流动相B为去离子水，检测器：PDA检测器。采用内标法以目标分析物峰面积和内标峰面积的比值进行定量计算样品中酪胺的含量。
2.如权利要求1所述发酵肉制品中酪胺含量的检测方法，其特征在于，所述步骤(1)制备混合梯度标准工作溶液的具体过程如下:将浓度为1.0mg·mL-1的酪胺标准溶液用0.1M盐酸配制浓度梯度为0.5、1.0、5.0、10.0、20.0、40.0、60.0、80.0μg·mL-1的标准工作溶液，每个浓度的混合标准工作溶液的内标苯甲胺的浓度为10.0μg·mL-1。
3.如权利要求1所述发酵肉制品中酪胺含量的检测方法，其特征在于，所述步骤(2)中三氯乙酸的质量百分浓度为5％。
4.如权利要求1所述发酵肉制品中酪胺含量的检测方法，其特征在于，UPLC的洗脱程序为：流动相A为乙腈，流动相B为水，在0-15min，A 50-85％，B 50-15％,15-16min，A 85-50％，B 15-50％，16-20min，A 50％，B 50％。
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