CN105424823A - 一种烟草根、茎及叶中多胺类物质的检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种烟草根、茎及叶中多胺类物质的检测方法，它利用预冷的高氯酸溶液涡旋提取烟草中的多胺，再以3,5-二硝基苯甲酰氯进行衍生化，衍生化产物利用涡旋辅助-液液微萃取进行提取浓缩后采用超高效液相色谱-光电二极管阵列检测器进行检测。此外，为了获得涡旋辅助-液液微萃取中最佳的富集因子和回收率，分别采用了部分析因设计和Doehlert设计进行方法优化。本发明与其它分析检测多胺的方法相比，具有衍生反应快、产物稳定，灵敏度高、重现性好、对环境绿色友好等优点，能对烟草中根、茎及叶中的多胺进行准确的定性与定量。此外，通过高分辨率质谱鉴定了其它四种多胺，分别为酪胺、1,3-丙二胺、高精眯和刀豆四胺，其中刀豆四胺为首次在烟草中发现。

Description

一种烟草根、茎及叶中多胺类物质的检测方法

技术领域

本发明属于烟草化学成分的测定方法技术领域，具体涉及一种烟草根、茎及叶中多胺类物质的检测方法。

背景技术

多胺是生物体代谢过程中产生的具有生物活性的低分子量脂肪含氮碱。常见多胺有腐胺、尸胺、亚精胺和精胺。在高等植物中主要以游离态形式存在，并且在不同的组织与器官间存在差异。在植物中，多胺具有刺激生长，延缓衰老的作用。一般认为多胺可作为广义上的植物激素，也有人认为多胺可能是类似cAMP那样的“第二信使”，调节植物的生长发育。此外，多胺与植物的抗逆性也密切相关，研究发现，植物在自主抵抗遭遇的逆境胁迫时，多胺不仅与其他相溶性溶质一样有类似的保护功能，而且还与这些相溶性溶质有协同作用，在植物逆境抵抗体系的构建中起重要的推动作用。

在烟草中，多胺除了有上述重要作用外，利用多胺合成烟碱中的吡咯烷环是烟草生长过程中非常重要的代谢过程。该过程主要包含多胺的合成与吡咯烷环的合成。多胺的合成途径主要有两条：一条为精氨酸途径，其关键酶是精氨酸脱羧酶，另一条为鸟氨酸途径，其关键酶是鸟氨酸脱羧酶。合成的腐胺经过腐胺N-甲基转移酶形成N-甲基腐胺，进一步由腐胺N-甲基氧化酶氧化得到N-甲基氨基丁醛，N-甲基氨基丁醛自发转变为合成烟碱所必须的吡咯烷环，从而形成烟碱。由上述途径可知，烟草中的多胺类物质是直接形成烟碱的前体物，对多胺类物质进行检测分析，能深入的了解烟碱的合成途径，能为指导获得高烟碱优质烟叶提供一定的理论基础。此外，烟草中的多胺还能参与合成苯乙烯酰胺类物质，烟草中已经鉴定的苯乙烯酰胺类物质有咖啡酰丁二胺、二咖啡酰氧基亚精胺、咖啡酰氧基-去氢咖啡酰氧基亚精胺、阿魏酰酪胺等，这些物质与烟草的抗逆性相关，特别与植株的病毒抗性密切相关。

目前还没有一套简单、快速、高灵敏度和对环境绿色友好的关于烟草根、茎及叶中多胺类物质的检测方法。建立一套简单、快速、高灵敏度、对环境绿色友好且准确的方法以提高样品检测通量，减少环境污染是非常必要的。

发明内容

本发明要解决的技术问题：提供一种烟草根、茎及叶中多胺类物质的检测方法，该方法具有衍生化反应快，产物稳定、灵敏度高、对环境绿色友好且准确等特点，该方法的这些优点有效的克服了现有技术的不足。

本发明技术方案：

一种烟草根、茎及叶中多胺类物质的检测方法，包括以下步骤：

A、烟草根、茎及叶中多胺类物质的提取：称取冻干样品于离心管中，然后加入内标溶液，再加入预冷的高氯酸水溶液进行涡旋提取，离心后，上层清液过水系滤膜；

B、烟草根、茎及叶中多胺类物质的衍生化：取步骤A中滤液于离心管中，放入冰浴中冷却，再加入氢氧化钠溶液，涡旋混匀后加入预冷的衍生化试剂，涡旋混匀，冰浴中反应后加入盐酸水溶液停止反应；

C、烟草根、茎及叶中多胺类物质的衍生化产物的提取：向步骤B中衍生化产物中加入水，调节溶液pH值后，再加入氯化钠及提取溶剂进行涡旋辅助-液液微萃取，提取结束后用手动进样针取下层提取液至微量进样瓶中，氮气吹干后用乙腈水溶液将衍生化产物溶解后进行超高效液相色谱-光电二极管阵列检测器测定；

D、烟草根、茎及叶中多胺类物质的色谱检测：采用一级与二级高分辨质谱定性标准品与未知多胺，超高效液相色谱-光电二极管阵列检测器以己二胺盐酸盐为内标分别进行绝对定量与相对定量。

所述内标溶液为5uL0.1M盐酸配制的1mgmL_- ¹的己二胺盐酸盐。

所述的衍生化试剂为1050uL乙腈配制的50mM的3,5-二硝基苯甲酰氯。

所述的涡旋辅助-液液微萃取的条件为加入1mL超纯水，利用2M的盐酸将其pH调至1后，再加入2.5％的氯化钠(w/v)与250uL三氯甲烷，涡旋辅助液液微萃取3min，4000rpm离心4min分层。

所述的一级与二级高分辨质谱定性的标准品为腐胺、尸胺、亚精胺和精胺。

所述的一级与二级高分辨质谱定性的未知多胺有酪胺、1,3-丙二胺、高精眯和刀豆四胺。

所述的超高效液相色谱-光电二极管阵列检测器利用标准品绝对定量腐胺、尸胺、亚精胺和精胺，利用内标己二胺盐酸盐按照校正因子F＝1相对定量酪胺、1,3-丙二胺、高精眯和刀豆四胺。

本发明的有益效果：

由于多胺挥发性差，极性强，且未有紫外吸收的生色团等特性，直接检测法存在峰形不对称、灵敏度低，选择性不强等缺陷，因此，多胺的检测方法主要为衍生化方法，衍生方法主要有气相衍生与液相衍生二种方法。气相衍生主要利用乙酰化衍生氨基，提高多胺的挥发性，从而可以利用气相色谱进行检测。乙酰化需无水的条件下反应，提取的多胺必须进行完全除水后才能进行衍生，且反应易受到水的影响，此外，乙酰化产物的沸点依然较高，需要高于280℃的柱温才能从色谱柱中流出而被检测，因此易导致毛细管色谱柱的流失，甚至损坏。液相衍生主要是将生色团引入到多胺的结构中，从而使其有紫外吸收或发出荧光。主要的液相衍生试剂有邻苯二甲醛、丹磺酰氯、6-氨基喹啉基-N-羟基琥珀酰亚胺基氨基甲酸酯、氯甲酸芴甲酯和苯甲酰氯。但这些衍生试剂都存在衍生反应慢，衍生产物稳定性差，且价格较昂贵等缺陷。此外，这些方法常常采用衍生化后直接进样或液液萃取进行浓缩，导致方法灵敏度低且需消耗较多量的有机溶剂。

本发明建立了一种以预冷的高氯酸溶液涡旋提取烟草中的多胺，再以3,5-二硝基苯甲酰氯进行衍生化，衍生化产物利用涡旋辅助-液液微萃取进行提取浓缩后采用超高效液相色谱-光电二极管阵列检测器进行检测的方法。同时本发明为了获得涡旋辅助-液液微萃取中最佳的富集因子和回收率，分别采用了部分析因设计和Doehlert设计进行方法优化。与现有技术相比，本方法的优点是：采用3,5-二硝基苯甲酰氯衍生化多胺，有效减少了衍生化反应时间，提高了衍生化产物的稳定性，且利用一级与二级高分辨率质谱发现了其它四种多胺，分别为酪胺、1,3-丙二胺、高精眯和刀豆四胺，其中刀豆四胺为首次在烟草中发现；利用涡旋辅助-液液微萃取的方法，减少了有机溶剂的使用及提取的时间，提高了方法的灵敏度。本发明具有衍生反应快、产物稳定，灵敏度高、重现性好、对环境绿色友好等优点，能对烟草中根、茎及叶中的多胺进行准确的定性与定量。

附图说明

图1本发明中烟草根、茎及叶中多胺类物质的检测方法流程图；

图2腐胺、尸胺、亚精胺和精胺混合标准溶液UPLC-PDA(240nm)色谱图(A-未优化色谱图；B-衍生化优化后色谱图；C-涡旋辅助-液液微萃取优化后色谱图、6.88min-腐胺；7.51min-尸胺；8.62min-己二胺盐酸盐内标；9.30min-亚精胺；10.87min-精胺)；

图3烟草中根、茎及叶中多胺类物质的典型UPLC-PDA(240nm)色谱图(A-茎；B-根；C-叶、1:5.43min-酪胺；2:6.64min-1,3-丙二胺；3:6.91min-腐胺；4:7.55min-尸胺；IS:8.64min-己二胺盐酸盐内标；5:9.34min-亚精胺；6:9.73min-高精眯；7:10.90min-精胺；8:11.09min-刀豆四胺)；

图4为高精眯的裂解规律图。

具体实施方案

实施例1

本发明烟草根、茎及叶中多胺类物质的检测方法包括如下步骤：

(1)称取100mg的冻干样品(根、茎或叶)于10mL的离心管中，然后加入5uL0.1M盐酸配制的1mgmL^-1的己二胺盐酸盐，再加入6mL预冷的0.3M高氯酸水溶液进行涡旋2000rpm提取30min，4000rpm离心5min后，上层清液过0.45um水系滤膜；

(2)取2mL滤液于10mL离心管中，放入冰浴中冷却5min，再加入400uL4M的氢氧化钠溶液，涡旋混匀后加入预冷的1050uL乙腈配制的50mM的3,5-二硝基苯甲酰氯，涡旋混匀，冰浴中反应2min后加入500uL2M盐酸水溶液停止反应；

(3)向衍生化产物中加入1mL超纯水，利用2M的盐酸将其pH调至1后，再加入2.5％的氯化钠(v/w)与250uL三氯甲烷，涡旋辅助液液微萃取3min，4000rpm离心4min分层。用100uL手动进样针取下层提取液至微量进样瓶中，氮气吹干后用50uL乙腈水溶液(V/V9:1)溶解后进行超高效液相色谱-光电二极管阵列检测器测定；

(4)采用一级与二级高分辨质谱定性标准品(腐胺、尸胺、亚精胺和精胺)与未知多胺(酪胺、1,3-丙二胺、高精眯和刀豆四胺)，一级高分辨质谱Xevo-Q-TOF的条件为：ESI负模式，氮气为雾化气和锥孔气，雾化气与锥孔气流速为800L/h和50L/h，雾化气温度450℃，源温度120℃，毛细管电压：2.0KV，锥孔电压：40V，碰撞能量6eV，扫描时间为0.2s，间隔为0.02s，扫描范围70-1000，检测器电压为1950V。利用亮氨酸脑咖肽为实时校准液，浓度为200ng/mL，流速为10uL/min，校正间隔为15s，且校正结果为3次平均。二级高分辨质谱Xevo-Q-TOF的条件为：ESI负模式，氮气为雾化气和锥孔气，雾化气与锥孔气流速为800L/h和50L/h，雾化气温度450℃，源温度120℃，毛细管电压：2.0KV，锥孔电压：40V，扫描时间为0.1s，间隔为0.02s，扫描范围70-1000，检测器电压为1950V。利用亮氨酸脑咖肽为实时校准液，浓度为200ng/mL，流速为10uL/min，校正间隔为15s，且校正结果为3次平均。对应四级杆质谱的时间段、质量数选择及碰撞能量如下表1：

表1Xevo-Q-TOF高分辨率质谱的时间段、质量数选择及碰撞能量

一级与二级高分辨质谱定性标准品(腐胺、尸胺、亚精胺和精胺)与未知多胺(酪胺、1,3-丙二胺、高精眯和刀豆四胺)，高分辨质谱的定性数据如下表2：

表2标准多胺物质与未知多胺物质的分子离子峰及碎片峰定性数据

对高精眯的碎片进行解析，裂解规律如图4，其它多胺结构的鉴定按照类似方法进行确证。

(5)采用超高效液相色谱-光电二极管阵列检测器以内标己二胺盐酸盐分别进行绝对定量与相对定量。利用标准品绝对定量腐胺、尸胺、亚精胺和精胺，利用内标己二胺盐酸盐按校正因子F＝1相对定量酪胺、1,3-丙二胺、高精眯和刀豆四胺。超高效液相色谱-光电二极管阵列检测器的条件为：ACQUITYUPLC超高效液相色谱分离采用AcquityUPLCHSST3柱(2.1mm×100mm,1.8μm,)，柱温45℃，进样量为1.0μL。流动相B为超纯水(含0.05％HCOOH)，A为质谱级乙腈，流速为0.35mL/min，梯度洗脱如下：初始20％A保持1min，到5min变为50％A，保持2min，到12min变为70％A，保持2min，到16min变为100％A，保持2min，到20min恢复到20％A，保持2min，到22min平衡后进下一针。光电二极管阵列检测器的监测波长为240nm，分辨率为4.8nm。

(6)配制相应浓度的母液，将母液混合并用0.3M高氯酸水溶液稀释成5个浓度梯度的混合标样，按照(2)与(3)中的方法进行衍生化与涡旋辅助-液液微萃取，再进行超高效液相色谱-光电二极管阵列检测器，并以目标化合物峰面积与内标物峰面积的比为纵坐标(Y)，目标化合物的量与内标量(5μg)的比值为横坐标(X)进行回归分析，得到回归方程及相关参数，将最低浓度的标准溶液按照信噪比为3(S/N＝3)和9(S/N＝9)计算方法的最低检测限(LOD)与最低定量限(LOQ)，同时向烟草的根、茎及叶中添加两个浓度梯度的多胺后进行提取，对方法的回收率进行评价，重复3次(同一天重复3次与三天内重复3次)，从而对方法的日内与日间精密度(RSD)进行评价。样品衍生化物质的稳定性测试在常温条件下0h、6h、12h、18h、24h及48h后的峰面积变化，得到对应的相对标准偏差。结果如表3，4与5所示。

表3腐胺、尸胺、亚精胺和精胺的线性范围、回归方程、相关系数和失拟程度

表4腐胺、尸胺、亚精胺和精胺在烟草的根、茎及叶中的回收率、日内及日间精密度

表5腐胺、尸胺、亚精胺和精胺在烟草的根、茎及叶中的最低检测限、定量限及产物稳定性

结果表明：四种多胺在线性范围0.05-8ug/mL内，相关系数大于0.9992，失拟程度的P值都大于0.05，表明方法的线性较好。四种多胺的回收率在89.6-109.0％之间，回收率良好，日内与日间精密度范围分别在0.89-8.12％与1.38-9.89％之间，符合严格的定量要求。由于采用了涡旋辅助-液液微萃取技术，同时对衍生化及提取条件进行了优化，方法的LOD与LOQ比常规方法相比更低，分别为0.013-0.033ug/g和0.039-0.099ug/g。衍生化产物稳定性结果表明：衍生化产物非常稳定，48h常温下未发生明显改变。

实施例2

采用如实施例1的方法分别对同一烟草的不同部位之间的多胺进行检测，测定结果见表6，从检测结果可知，叶芽中多胺含量最高，特别是酪胺含量。叶片中多胺含量组成依次为叶芽>上叶>中叶>下叶，总的来说，幼叶多胺含量较老叶含量高。根中具有相对较高的酪胺，但其它多胺含量较低，与下叶的多胺组成类似，茎中多胺含量高于根，与中叶的多胺组成类似。

表6同一烟草的不同部位之间的多胺含量组成

^a数据为5次测定的平均值±标准偏差；ND,未检测到。

Claims (7)

1.一种烟草根、茎及叶中多胺类物质的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

A、烟草根、茎及叶中多胺类物质的提取：称取冻干样品于离心管中，然后加入内标溶液，再加入预冷的高氯酸水溶液进行涡旋提取，离心后，上层清液过水系滤膜；

B、烟草根、茎及叶中多胺类物质的衍生化：取步骤A中滤液于离心管中，放入冰浴中冷却，再加入氢氧化钠溶液，涡旋混匀后加入预冷的衍生化试剂，涡旋混匀，冰浴中反应后加入盐酸水溶液停止反应；

C、烟草根、茎及叶中多胺类物质的衍生化产物的提取：向步骤B中衍生化产物中加入水，调节溶液pH值后，再加入氯化钠及提取溶剂进行涡旋辅助-液液微萃取，提取结束后用手动进样针取下层提取液至微量进样瓶中，氮气吹干后用乙腈水溶液将衍生化产物溶解后进行超高效液相色谱-光电二极管阵列检测器测定；

D、烟草根、茎及叶中多胺类物质的色谱检测：采用一级与二级高分辨质谱定性标准品与未知多胺，超高效液相色谱-光电二极管阵列检测器以己二胺盐酸盐为内标分别进行绝对定量与相对定量。

2.根据权利要求1所述的一种烟草根、茎及叶中多胺类物质的检测方法，其特征在于：所述内标溶液为5uL0.1M盐酸配制的1mgmL^-1的己二胺盐酸盐。

3.根据权利要求1所述的一种烟草根、茎及叶中多胺类物质的检测方法，其特征在于：所述的衍生化试剂为1050uL乙腈配制的50mM的3,5-二硝基苯甲酰氯。

4.根据权利要求1所述的一种烟草根、茎及叶中多胺类物质的检测方法，其特征在于：所述的涡旋辅助-液液微萃取的条件为加入1mL超纯水，利用2M的盐酸将其pH调至1后，再加入2.5%的氯化钠（w/v）与250uL三氯甲烷，涡旋辅助液液微萃取3min，4000rpm离心4min分层。

5.根据权利要求1所述的一种烟草根、茎及叶中多胺类物质的检测方法，其特征在于：一级与二级高分辨质谱定性的标准品为腐胺、尸胺、亚精胺和精胺。

6.根据权利要求1所述的一种烟草根、茎及叶中多胺类物质的检测方法，其特征在于：一级与二级高分辨质谱定性的未知多胺有酪胺、1,3-丙二胺、高精眯和刀豆四胺。

7.根据权利要求5和6所述的一种烟草根、茎及叶中多胺类物质的检测方法，其特征在于：超高效液相色谱-光电二极管阵列检测器利用标准品绝对定量腐胺、尸胺、亚精胺和精胺，利用内标己二胺盐酸盐按照校正因子F=1相对定量酪胺、1,3-丙二胺、高精眯和刀豆四胺。