CN111879861B - 一种精确检测发酵液中己二胺含量的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种精确检测发酵液中己二胺含量的方法，属于生物工程检测领域。本发明针对复杂的发酵液体系，基于内标以及校准曲线的校准，对现有己二胺检测方法进行了优化与改进，实现了发酵液中己二胺的准确定量，相对误差在5.76％以内。这种校准方法消除了复杂发酵液体系对己二胺检测的干扰，实现了己二胺生物合成过程中的有效检测，为生物法合成己二胺的工业化进程奠定了基础。

Description

一种精确检测发酵液中己二胺含量的方法

技术领域

本发明涉及一种精确检测发酵液中己二胺含量的方法，属于生物工程检测领域。

背景技术

己二胺(Diaminohexane)是一种强碱性有机物，也是制造聚酰胺(尼龙)纤维和树脂的主要原料。可与己二酸缩合反应生成尼龙66盐，再经浓缩、缩聚可制得尼龙66。尼龙66是最早实现工业化的聚酰胺，与尼龙6并列为最重要的两大聚酰胺品种，因此己二胺生产技术的开发一直受到重视。此外己二胺还用于制造尼龙610、尼龙612等，也是聚亚胺羧酸酯泡沫塑料和聚氨酯泡沫塑料、涂料的主要原料，还可以用环氧树脂的固化剂、有机交联剂、农药、铁矿和铜矿的浮选剂等。

据统计，己二胺在2011年的全球产量达到1.32Mt，预计到2020年己二胺产量年均增长可达1.9％。目前，己二胺的工业生产方法主要有：己二腈法、以己二腈为中间体的己二酸法、己内酰胺法和己二醇法等，其中应用较多的是己二腈法。但随着国家对可持续发展、环境保护的日益关注，利用微生物转化可再生碳源制备己二胺的工艺逐步发展起来。Dros等研究者在2015年提出了三种替代的生物基己二胺生产途径：

途径1：5-羟甲基糠醛→2,5-双羟甲基四氢呋喃→1,6-己二醇→己二胺

途径2：5-羟甲基糠醛→2,5-双羟甲基四氢呋喃→2,5-双氨基甲基四氢呋喃→己二胺

路线3：5-羟甲基糠醛→2,5-二甲酰呋喃→2,5-双氨基甲基四氢呋喃→己二胺

这些途径皆可从微生物转化玉米和马铃薯衍生淀粉为果糖出发，再转化果糖为5-羟甲基糠醛而逐步获得己二胺。此外，也在大肠杆菌BL21中通过质粒过表达2-氧代酸还原酶、辅酶A转移酶、脱水酶、乙酰辅酶A脱氢酶、脱氢酶、胺脱氢酶和高赖氨酸脱羧酶，成功实现己二胺的生物酶转化。

在微生物转化法生产己二胺的过程中，需实时进行己二胺浓度的检测。在实验过程中发现，发酵液体系中含有的复杂培养基成分，尤其是蛋白质、氨基酸等物质，会对己二胺的定量检测造成一定的干扰，使检测值显著低于其实际含量。此外，在发酵时，整个体系中各物质的浓度是时刻动态变化的，这种变化给己二胺的有效定量检测也带来了一定的挑战。因此，在复杂发酵液体系的影响下，如何有效的检测发酵液中己二胺含量对于菌株己二胺生产能力的评价而言至关重要。

近期研究发现，发酵培养基中酵母粉或酵母提取物的含量对己二胺准确检测的影响最为明显，当体系中存在大量酵母粉或酵母提取物时，通过HPLC方法检测得到的己二胺含量会显著低于其实际含量。因此，亟待提供一种能够对细胞培养体系精确定量检测己二胺的方法。

发明内容

针对上述问题，本发明提供了一种基于丹磺酰氯衍生化对发酵液中己二胺进行检测的方法，创新性地提出了一种全新的检测思路：即利用发酵液对内标的干扰效果来指示其对己二胺的干扰，以减小检测方法的误差，实现复杂体系中己二胺的精确检测。

本发明的第一个目的是提供一种精确检测细胞培养物中己二胺含量的方法，是以1,4-丁二胺二盐酸盐、1,7-庚二胺或二者的混合物为内标物，对加入内标物的细胞培养物进行HPLC检测，用校准模型对检测结果校准，计算得到丁二胺含量；

所述校准模型为：

其中，K：转换系数，A₁：己二胺衍生物峰面积，T₁：细胞培养物中己二胺胺浓度，A₂：内标衍生物峰面积，T₂：内标浓度。

在一种实施方式中，所述内标物为1,7-庚二胺，或1,4-丁二胺二盐酸盐，或1,7-庚二胺和1,4-丁二胺二盐酸盐按摩尔比为1:1的混合物。

在一种实施方式中，所述转换系数是以细胞培养物中的干扰物浓度为参比，计算获得。

在一种实施方式中，所述干扰物为酵母提取物，含有多肽或氨基酸。

在一种实施方式中，所述方法具体包括如下步骤：

(1)建立模拟己二胺发酵体系：以SOB培养基为基础体系，向其中加入不同浓度的酵母提取物，建立不同的细胞培养物体系，然后向已建立的不同的细胞培养物体系中加入己二胺标准品配制含不同浓度己二胺的细胞培养物体系；

(2)待测样品前处理：在步骤(1)建立的每个己二胺发酵体系中添加终浓度0.1g/L内标物和终浓度为1g/L的衍生试剂丹磺酰氯进行衍生化反应，然后用乙醚进行萃取，乙醚经氮吹仪吹干后，再用乙腈溶液复溶，经0.22μm滤膜过滤后，放入棕色液相瓶中进行HPLC检测；

(3)建立己二胺检测校准曲线：根据步骤(2)中测定的己二胺和内标物的丹磺酰氯衍生物浓度绘制内标物峰面积与酵母提取物浓度的关系式A和酵母抽提物浓度与转换系数K的关系曲线B；

(4)待测样品前处理：将细胞培养物样品于10000-13000rpm离心10-15min，去除菌体得到发酵上清液。取等体积的上清液和饱和NaHCO₃进行混合，用NaOH调节pH至9-11。添加终浓度为0.1g/L内标物和终浓度为1.0g/L的衍生试剂丹磺酰氯进行衍生化反应；然后用乙醚进行萃取处理，乙醚经氮吹仪吹干后，再用乙腈复溶，经0.22μm滤膜过滤后放入棕色液相瓶中进行HPLC检测；

(5)根据关系式A和关系曲线B计算获得对应的转换系数K，再根据校准模型

计算细胞培养物中己二胺的浓度；其中，K：转换系数，A₁：己二胺衍生物峰面积，T₁：细胞培养物体系中己二胺胺浓度，A₂：内标衍生物峰面积，T₂：内标浓度。

在一种实施方式中，以1,7-庚二胺为内标物时，关系式A满足：y₁＝-0.0029x₁+62.3089，R²＝0.9984；关系曲线B满足：y₂＝0.0005x₂ ²-0.0426x₂+1.4953，R²＝0.9973；其中，y₁为酵母提取物浓度；x₁为1,7-庚二胺衍生物峰面积；y₂为转换系数；x₂为酵母提取物浓度。

在一种实施方式中，以1,4-丁二胺二盐酸盐为内标物时，关系式C满足：y₁＝-0.0052x₁+65.2201；关系曲线D满足：y₂＝0.0002x₂ ²+0.0036x₂+0.7883；其中，y₁为酵母提取物浓度；x₁为1,4-丁二胺二盐酸盐峰面积；y₂为转换系数；x₂为酵母提取物浓度。

在一种实施方式中，以1,7-庚二胺和1,4-丁二胺二盐酸盐的混合物为内标物时，选择二者中峰形对称、不拖尾的为内标，根据对应的关系式A和关系曲线B对测定结果进行校准。

在一种实施方式中，所述发酵培养基中含有酵母抽提物。

在一种实施方式中，步骤(1)的培养基为SOB培养基，其成分包括：5g/L酵母粉、20g/L胰蛋白胨、0.95g/L MgCl₂、0.5g/L NaCl、0.186g/L KCl，使用NaOH将培养基pH调至7.4，115℃高压蒸汽灭菌30min。

在一种实施方式中，步骤(1)所述的不同发酵培养基体系可以为包含5g/L，10g/L，15g/L，20g/L，25g/L，30g/L，35g/L和40g/L酵母粉浓度的SOB培养基。

在一种实施方式中，衍生试剂丹磺酰氯母液用丙酮溶解配制。

在一种实施方式中，衍生化反应条件为涡旋1-3min，60-70℃水浴避光反应25-40min。

在一种实施方式中，己二胺HPLC检测条件为：使用C18(2)分析柱(Compass，250×4.6mm，5μm粒径)对衍生化后的样品进行分离。使用紫外检测器，检测波长设定为254nm。流动相A和B分别为超纯水和乙腈(HPLC级，用0.45μm膜滤器过滤)，梯度洗脱程序设定为0-6min55％-70％B，6-10min 70％B，10-18min 70-95％B，18-19min 95％B，19-20min 95-55％B，20-21min 55％B；总流速为0.8mL/min。样品进样量为10μL；每个样品检测时间为21min。

本发明还要求保护上述任一方法在食品、医药、化学领域检测己二胺或其盐方面的应用。

有益效果：本发明的方法专门针对于细胞培养物这一复杂体系中己二胺含量的测定，对现有的丹磺酰氯衍生后的己二胺HPLC检测方法进行了改进，利用细胞培养物对内标的干扰效果来指示其对己二胺的干扰，引入转换系数(K)，建立己二胺浓度检测校准曲线，最终己二胺的检测相对误差控制在5.76％以内，实现了微生物发酵生产己二胺浓度的准确测定，为生物合成己二胺的工业化进程奠定了检测基础。

附图说明

图1(a)为100mg/L 1,7-庚二胺的峰面积与酵母粉浓度之间的关系式A；(b)为酵母粉浓度与转化系数K′之间的关系曲线B；

图2(a)为100mg/L 1,4-丁二胺二盐酸盐的峰面积与酵母粉浓度之间的关系式C；(b)为酵母粉浓度与转化系数K′之间的关系曲线D。

具体实施方式

下述实施例中使用的SOB培养基成分为：

5g/L酵母粉，20g/L胰蛋白胨，0.95g/L MgCl₂，0.5g/L NaCl，0.186g/L KCl，使用NaOH将pH调至7.4。高压蒸汽灭菌，115℃，30min。

实施例1：1,7-庚二胺为内标物的己二胺细胞培养物校准曲线检测法建立

1.构建含己二胺的模拟细胞培养物体系

在SOB培养基中分别添加终浓度为5g/L、10g/L、15g/L、20g/L、25g/L、30g/L、35g/L和40g/L的酵母粉。在添加了5g/L酵母粉的SOB培养基中分别添加25mg/L，50mg/L，100mg/L，150mg/L，200mg/L的己二胺标准品，同时均添加0.1g/L的1,7-庚二胺标准品作为内标。再加入1mL浓度为5g/L的衍生试剂丹磺酰氯进行衍生化反应，经乙醚萃取，氮吹仪吹干后，再用乙腈溶液复溶。于0.22μm滤膜过滤，利用HPLC法检测己二胺和1,7-庚二胺的丹磺酰氯衍生物浓度。在添加了10g/L、15g/L、20g/L、25g/L、30g/L、35g/L和40g/L酵母粉的SOB培养基中重复上述操作。

2.建立检测不同含量己二胺的校准曲线

由前一步测得的己二胺和1,7-庚二胺的丹磺酰氯衍生物峰面积数据(如表1，表2)发现在同一细胞培养物体系中，两者峰面积之间有明显的相关性。由此引入换算系数K的定义(公式1)：在同一细胞培养物体系中，HPLC检测到的单位浓度己二胺的峰面积与单位浓度1,7-庚二胺的峰面积之比。计算各己二胺细胞培养物体系中的K值(表3)，在酵母粉浓度相同的一系列己二胺细胞培养物体系中，己二胺浓度对K值的影响较小，故采用K的平均值K′来表示同一细胞培养物体系中己二胺与内标物浓度之间的换算关系。

K：换算系数，A₁：己二胺衍生物峰面积，T₁：细胞培养物体系中己二胺浓度，A₂：内标衍生物峰面积，T₂：内标浓度。

表1己二胺的丹磺酰氯衍生物峰面积

表2 1,7-庚二胺的丹磺酰氯衍生物峰面积

表3己二胺和1,7-庚二胺的K值计算

结合上述检测结果，建立100mg/L的1,7-庚二胺峰面积与酵母粉浓度的关系式A，y＝-0.0029x+62.3089，R²＝0.9984；以及酵母粉浓度与K′的关系曲线B，y₂＝0.0005x₂ ²-0.0426x₂+1.4953，R²＝0.9973；如图1。当检测发酵液中的己二胺的含量时，只需在样品中加入100mg/L 1,7-庚二胺作为内标，然后，根据HPLC检测获得的1,7-庚二胺衍生物峰面积，从关系式A中找到相对应的酵母粉浓度，再根据确定的体系中酵母粉浓度，从关系曲线B中确定该体系的换算系数K′，最后通过公式(1)计算己二胺的浓度。

3.校准曲线法准确性验证

采用上述方法，计算含5g/L酵母提取物的标准己二胺发酵液体系(25mg/L、50mg/L、100mg/L、150mg/L、200mg/L)中检测到的己二胺含量分别为：24.55mg/L、51.08mg/L、99.93mg/L、158.11mg/L、195.88mg/L，平均误差为2.30％，相对误差值能控制在5.41％以内。同时按此方式计算其余发酵液体系(酵母粉浓度分别为10g/L，15g/L，20g/L，25g/L，30g/L，35g/L，40g/L)中的己二胺含量，由此获得的己二胺检测浓度的平均误差为2.71％，相对误差能控制在5.76％以内，能有效地消除培养基体系的干扰。

4.利用基于1,7-庚二胺建立的己二胺标准曲线法检测发酵液中己二胺浓度

采用E.coli BL21(DE3)进行己二胺发酵表达，于250mL三角瓶中进行分批发酵培养，发酵培养基为补加了氨苄青霉素(50mg/L)的SOB培养基，发酵培养6h后，添加0.1mMIPTG诱导己二胺合成。诱导表达30h后，检测发酵液中己二胺的含量。

取500μL己二胺发酵液与500μL饱和NaHCO₃混合，用NaOH调节pH至9.4，在发酵上清液样品中添加100mg/L 1,7-庚二胺作为内标物，加入1mL现配的衍生化试剂丹磺酰氯(5mg/mL，溶解于丙酮)并涡旋震荡1min混匀，于60℃水浴条件下避光反应30min。反应结束后加入乙醚萃取衍生产物，然后用氮气吹干，用乙腈溶解衍生化产物，使用0.22μm滤膜过滤后等待HPLC检测。

使用安捷伦porpshell120EC-C18分析柱(4.6×150mm，4μm)对衍生化后的样品进行分离。使用紫外检测器，检测波长为254nm；流动相A和B分别为超纯水和HPLC级乙腈，经0.22μm膜滤器过滤后使用；总流速为0.7mL/min，采用梯度洗脱程序，具体设定如下：0-4min，55％-70％B；4-6.7min，70％B；6.7-12min，70-95％B；12-12.6min，95％B；12.6-13.5min，95-55％B；13.5-16min，55％B。样品的进样量为10μL。最终，根据校准曲线法计算己二胺含量，获得发酵30h后的己二胺浓度为37.51mg/L，实现了发酵液中己二胺含量的有效检测。

实施例2：1,4-丁二胺二盐酸盐为内标物的己二胺发酵液校准曲线检测法建立

1.模拟构建己二胺发酵液体系

在SOB培养基中分别添加终浓度为5g/L、10g/L、15g/L、20g/L、25g/L、30g/L、35g/L和40g/L的酵母粉。在添加了5g/L酵母粉的SOB培养基中分别添加25mg/L，50mg/L，100mg/L，150mg/L，200mg/L的己二胺标准品，同时均添加100mg/L的1,4-丁二胺二盐酸盐标准品作为内标。再加入0.5mL浓度为10mg/mL的衍生试剂丹磺酰氯进行衍生化反应，经乙醚萃取，氮吹仪吹干后，再用乙腈溶液复溶。于0.22μm滤膜过滤，利用HPLC法检测己二胺和1,4-丁二胺二盐酸盐的丹磺酰氯衍生物浓度。在添加了10g/L、15g/L、20g/L、25g/L、30g/L、35g/L和40g/L酵母粉的SOB培养基中重复上述操作。

2.建立己二胺含量检测的校准曲线

由前一步测得的己二胺和1,4-丁二胺二盐酸盐的丹磺酰氯衍生物峰面积数据如表4、表5所示，发现在同一发酵液体系中，两者峰面积之间有明显的相关性。由此引入换算系数K的定义：在同一发酵液体系中，HPLC检测到的单位浓度己二胺的峰面积与单位浓度1,4-丁二胺二盐酸盐的峰面积之比。计算各己二胺发酵液体系中的K值(表6)，在酵母粉浓度相同的一系列己二胺发酵液体系中，己二胺浓度对K值的影响较小，采用K的平均值K′来表示同一发酵液体系中己二胺与内标物浓度之间的换算关系。

表4以1,4-丁二胺二盐酸盐为内标的己二胺的丹磺酰氯衍生物峰面积

表5 1,4-丁二胺二盐酸盐的丹磺酰氯衍生物峰面积

表6己二胺和1,4-丁二胺二盐酸盐的丹磺酰氯衍生物峰面积的K值计算

结合上述检测结果，建立100mg/L的1,4-丁二胺二盐酸盐峰面积与酵母抽提物浓度的关系式C，y＝-0.0052x+65.2201，R²＝0.9982；以及酵母抽提物浓度与K′的关系曲线D，y＝0.0002x²+0.0036x+0.7883，R²＝0.9986(如图2)。当检测发酵液中的己二胺的含量时，只需在样品中加入100mg/L 1,4-丁二胺二盐酸盐作为内标，然后，根据HPLC检测获得的1,4-丁二胺二盐酸盐衍生物峰面积，从关系式A中找到相对应的酵母粉浓度，再根据确定的体系中酵母粉浓度，从关系曲线B中确定该体系的换算系数K′，最后通过公式(1)计算己二胺的浓度。

3.校准曲线法准确性验证

采用上述方法，计算含5g/L酵母提取物的标准己二胺发酵液体系(25mg/L、50mg/L、100mg/L、150mg/L、200mg/L)中检测到的己二胺含量分别为：24.80mg/L、50.18mg/L、97.95mg/L、152.27mg/L、202.10mg/L，平均误差为1.16％，相对误差值能控制在2.05％以内。同时按此方式计算其余发酵液体系(酵母粉浓度分别为10g/L，15g/L，20g/L，25g/L，30g/L，35g/L，40g/L)中的己二胺含量，由此获得的己二胺检测浓度的平均误差为2.01％，相对误差能控制在4.48％以内，能有效地消除了培养基体系的干扰，检测发酵体系中的己二胺含量。

4.利用基于1,4-丁二胺二盐酸盐建立的己二胺标准曲线法检测发酵液中己二胺浓度

采用E.coli BL21(DE3)于250mL三角瓶中进行分批发酵培养，发酵培养基为补加了氨苄青霉素(50mg/L)的SOB培养基，发酵培养5h后，添加0.1mM IPTG诱导己二胺的催化合成。诱导表达32h后，进行取样，检测发酵液中己二胺的含量。

取500μL己二胺发酵液与500μL饱和NaHCO₃混合，用NaOH调节pH至9.4，在发酵上清液样品中添加100mg/L1,4-丁二胺二盐酸盐作为内标物，再加入1mL现配的衍生化试剂丹磺酰氯(5mg/mL，溶解于丙酮)并涡旋震荡2min混匀，于70℃水浴条件下避光反应25min；反应结束后加入乙醚萃取衍生产物，然后用氮气吹干；用乙腈溶解衍生化产物，使用0.22μm滤膜过滤后等待HPLC检测。

使用安捷伦porpshell120EC-C18分析柱(4.6×150mm，4μm)对衍生化后的样品进行分离。使用紫外检测器，检测波长为254nm；流动相A和B分别为超纯水和HPLC级乙腈，经0.22μm膜滤器过滤后使用；总流速为0.7mL/min，采用梯度洗脱程序，具体设定如下：0-4min，55％-70％B；4-6.7min，70％B；6.7-12min，70-95％B；12-12.6min，95％B；12.6-13.5min，95-55％B；13.5-16min，55％B。样品的进样量为10μL。最终，采用校准曲线法计算己二胺含量，获得发酵32h后的己二胺浓度为31.28mg/L。

实施例3：双内标曲线法检测发酵液中己二胺含量

采用E.coli BL21(DE3)于250mL三角瓶中进行分批发酵培养，发酵培养基为补加了氨苄青霉素(50mg/L)的SOB培养基，发酵培养6h后，添加0.1mM IPTG诱导己二胺的催化合成。诱导表达35h后，取样检测发酵液中己二胺的含量。

取500μL己二胺发酵液与500μL饱和NaHCO₃混合，用NaOH调节pH至9.4。为了提高校准的准确性，在发酵上清液样品中添加终浓度100mg/L 1,7-庚二胺和100mg/L1,4-丁二胺二盐酸盐两种物质作为内标物，相互校准己二胺的检测。加入1mL现配的衍生化试剂丹磺酰氯(5mg/mL，溶解于丙酮)并涡旋震荡1min混匀。60℃水浴条件下避光反应30min，反应结束后加入乙醚萃取衍生产物，然后用氮气吹干，用乙腈溶解衍生化产物，使用0.22μm滤膜过滤后进行HPLC检测。最终，选择出峰分离效果较好的内标物，按照其对应的实施例1或实施例2的校准曲线进行计算，确定发酵35h后的己二胺浓度为40.16mg/L，实现了发酵液中己二胺含量的有效检测。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (6)

1.一种精确检测细胞培养物中己二胺含量的方法，其特征在于，对加入内标物的待测的细胞培养物进行衍生化处理，再利用HPLC检测方法进行检测，用校准模型对检测结果校准，计算得到己二胺含量；

所述校准模型为：

其中，K：转换系数，A₁：己二胺衍生物峰面积，T₁：细胞培养物中己二胺浓度，A₂：内标衍生物峰面积，T₂：内标浓度；

所述方法具体包括如下步骤：

(1)建立模拟己二胺发酵体系：向用于微生物发酵的培养基中加入不同浓度的酵母提取物，建立不同的细胞培养物体系，然后向建立的细胞培养物体系中加入己二胺标准品，配制含不同浓度己二胺的细胞培养物体系；

(2)模拟己二胺发酵体系样品前处理：在步骤(1)建立的每个细胞培养物体系中添加终浓度0.1g/L内标物和终浓度为1g/L的衍生试剂丹磺酰氯进行衍生化反应，经乙醚萃取，氮吹后，用乙腈溶液复溶，滤膜过滤后，放入棕色液相瓶中进行HPLC检测；

(3)建立己二胺检测校准曲线：根据步骤(2)中测定的己二胺和内标物的丹磺酰氯衍生物浓度绘制内标物峰面积与酵母提取物浓度的关系式和酵母提取物浓度与转换系数K的关系曲线；

(4)待测样品前处理：将细胞培养物样品中加入终浓度为0.1g/L内标物和终浓度为1.0g/L的衍生试剂丹磺酰氯进行衍生化反应；然后用乙醚进行萃取处理，将萃取液氮吹，再用乙腈溶液复溶，经滤膜过滤后进行HPLC检测；

(5)根据步骤(3)建立的关系式和关系曲线计算获得对应的转换系数K，再根据校准模型

计算细胞培养物中己二胺的浓度；其中，K：转换系数，A₁：己二胺衍生物峰面积，T₁：细胞培养物体系中己二胺浓度，A₂：内标衍生物峰面积，T₂：内标浓度；

以1,7-庚二胺为内标物时，根据下述关系式和关系曲线计算转化系数：

关系式：y₁＝-0.0029x₁+62.3089；

关系曲线：y₂＝0.0005x₂ ²-0.0426x₂+1.4953；

其中，y₁为酵母提取物浓度；x₁为1,7-庚二胺衍生物峰面积；y₂为转换系数；x₂为酵母提取物浓度；

以1,4-丁二胺二盐酸盐为内标物时，根据下述关系式和关系曲线计算转化系数：

关系式：y₁＝-0.0052x₁+65.2201；

关系曲线：y₂＝0.0002x₂ ²+0.0036x₂+0.7883；

其中，y₁为酵母提取物浓度；x₁为1,4-丁二胺二盐酸盐峰面积；y₂为转换系数；x₂为酵母提取物浓度。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述内标物为1,7-庚二胺，或1,4-丁二胺二盐酸盐，或1,7-庚二胺和1,4-丁二胺二盐酸盐按摩尔比为1:1的混合物。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，以1,7-庚二胺和1,4-丁二胺二盐酸盐的混合物为内标物时，选择二者中峰形对称、不拖尾的为用于校准的内标物，根据对应的校准曲线对测定结果进行校准。

4.根据权利要求1～3任一所述的方法，其特征在于，衍生化试剂为丹磺酰氯；衍生化是在60-70℃水浴避光反应25-40min。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，己二胺HPLC检测条件为：使用C₁₈色谱分析柱对样品进行分离；使用紫外检测器，检测波长为254nm；流动相为超纯水和乙腈；采用梯度洗脱；总流速为0.7-0.9mL/min；检测时间≥21min。

6.权利要求1～5任一所述方法在食品、医药、化学领域检测己二胺或其盐方面的应用。

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