CN105092766B - 一种鱼粉中肌胃糜烂素的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种鱼粉中肌胃糜烂素的检测方法，属于肌胃糜烂素的检测技术领域。本发明公开的方法包括以下步骤：样品预处理、富集和净化、在线自动化衍生程序，通过样品预处理将结合在蛋白质中的肌胃糜烂素也提取出来，通过富集和净化，将鱼粉中其他杂质以及一些酸性和中性氨基酸去除，避免对分离进行干扰，提高了鱼粉中肌胃糜烂素检测的准确性，且灵敏度高，最低检出量为1 mg/kg，适合大规模样品的检测。
Description
技术领域
本发明涉及肌胃糜烂素的检测技术领域，尤其涉及一种鱼粉中肌胃糜烂素的高效液相色谱检测方法。
背景技术
肌胃糜烂素(Gizzerosine)是鱼粉在加热干燥处理时由鱼粉中的游离组氨酸及其代谢产物组胺与鱼粉中的蛋白质（赖氨酸的ε-NH2）发生反应而形成的，而且主要与鱼粉加工时的温度有关，当加工温度超过120 ℃时含量上升，温度愈高，毒素愈易产生。有报道称2.2 mg/kg的肌胃糜烂素就可刺激家禽的胃酸分泌，造成“黑色呕吐症”。正常鱼粉中肌胃糜烂素含量不超过0.3 mg/kg，其促进胃酸分泌作用是组胺的10倍，引起肌胃糜烂的能力是组胺的300倍。肌胃糜烂素可能是鱼粉中蛋白质腐败产物中毒性最高的有害物质。
目前，国内外均没有鱼粉中肌胃糜烂素检测的标准方法，行业内的检测手段还存在一定的不足。如国家知识产权局于2012年9月6日公开的一件公开号为CN102692384A，名称为一种鱼粉中肌胃糜烂素的检测方法的发明专利，该专利公开的方法是利用电泳方法从饲料鱼粉中快速分离肌胃糜烂素,并进行定量分析的方法；该发明能从鱼粉中的组胺,组氨酸等干扰物中有效分离肌胃糜烂素,并且通过待测样品与标准样品面积比进行定量分析。该方法虽然简便，但其定量方法是通过画像处理定量分析，检测浓度最低限值为10 ppm，灵敏度低。
又如，国家知识产权局于2015年7月8日公开的一件公开号为CN104764845A，名称为一种鱼粉中肌胃糜烂素的检测方法的发明专利，该专利公开的方法具有以下步骤：
（1）在鱼粉中加入5倍重量的0.1 mol/LHCl，混合搅拌10分钟；
（2）通过离心分离，得到含有肌胃糜烂素的上清液；
（3）将上清液通过0.2 µm的有机过滤膜过滤，取40 μL滤液于样品管中加入20 μL发色液A和60 μL发色液B进行重氮化衍生、发色及干燥；所述发色液A是20 mmol/L二甲基对苯二胺和200 mmol/L亚硝酸钠的混合溶液，其体积比是1:1；所述发色液B是10wt%无水碳酸钠溶解到5wt%乙醇溶液的混合溶液；
（4）处理后的样品进样到色谱柱，以1 mL/min的流速通过流动相A和流动相B分离肌胃糜烂素与其它干扰物；所述流动相A是150 mmol/L醋酸钠溶解到5wt%的乙醇混合液，所述流动相B是60wt%乙腈溶液。
肌胃糜烂素是由游离组胺和游离赖氨酸或蛋白质中赖氨酸的ε-NH2发生反应生成的，该发明的提取方法是用0.1 mol/L HCl，混合搅拌10分钟，用此方法只能提取到鱼粉中游离的肌胃糜烂素，结合在蛋白质中的肌胃糜烂素不能进行提取，且鱼粉的成分非常复杂，无净化步骤会对后期的分离造成干扰。
发明内容
本发明的目的在于提供一种鱼粉中肌胃糜烂素的高效液相色谱检测方法，具有较高的灵敏度和精确度，重现性较好，定量准确且回收率较高，能够准确分析鱼粉中的肌胃糜烂素的含量。
为了实现上述发明目的，本发明采用如下的技术方案：
一种鱼粉中肌胃糜烂素的高效液相色谱检测方法，包括以下步骤：
（1）样品预处理
取鱼粉100～500 mg加入水解管中，再加入6 mol/L的盐酸5～10 mL，旋紧盖子，放在109～111 ℃的干燥箱中，水解22～24 h后过滤得到水解液，再用5～10 mol/L氢氧化钠溶液调节pH值至6.8～7.2，静置后，进行离心后取上清液，得到粗提液；
（2）富集和净化
取3 mL甲醇和3 mL超纯水活化MCX固相萃取柱，将步骤（1）得到的粗提液注入MCX固相萃取柱进行富集，再分别以3 mL水和3 mL甲醇淋洗MCX固相萃取柱，抽干后用3～5 mL氨水-甲醇溶液洗脱，洗脱液用40 ℃的氮气吹干，加入0.2～0.4 mol/L硼酸缓冲液0.5～1mL，涡旋振荡1 min，然后通过0.22 µm滤膜，得到待测液；
（3）在线自动化衍生程序
首先吸取硼酸缓冲液10 µL，待测液20 µL，混合后，再吸取邻苯二甲醛10 µL进行混合，反应1 min后注入到色谱仪中进行检测，然后根据标准曲线计算肌胃糜烂素的含量。
作为优选， 步骤（1）中所述离心的转速为10000～15000 r/min，离心时间为离心10～15 min。
步骤（2）中，所述粗提液注入MCX固相萃取柱的流速为1 mL/min。
步骤（2）中，所述氨水-甲醇溶液中，氨水和甲醇的体积比为1:10。
步骤（2）中，所述硼酸缓冲溶液的PH值为9～10.5。
步骤（3）中，所述色谱仪的色谱柱的内径为5μm。
步骤（3）中，所述色谱仪的检测器为紫外检测器，检测波长为338 nm。
步骤（3）中，所述检测时的流动相流速为1 mL/min。
步骤（3）中，所述检测时的流动相为乙腈和磷酸盐缓冲溶液的混合溶液。
上述磷酸盐缓冲溶液为磷酸二氢钠和磷酸氢二钠按1:1的比例组成，所述磷酸盐缓冲溶液的pH值为6.5～7.5。
步骤（3）中，所述标准曲线的绘制方法如下：
准确称取肌胃糜烂素标准品0.01 g，置于10 mL棕色容量瓶中，加水溶解，加水量为棕色瓶三分之二体积，用水定容至10 mL，配制成1 mg/mL的肌胃糜烂素储备液；再依次稀释为1 μg/mL，2 μg/mL，10 μg/mL，20 μg/mL，100 μg/mL的系列标准溶液，然后用步骤（2）的方法进行处理后，检测，最后以峰面积Y对浓度X(μg/mL)进行线性回归，绘制标准曲线，通过不断降低标准溶液浓度，取信噪比为3时的浓度为最低检出限。
与现有技术相比，本发明的具有以下有益效果：
（1）采用本发明的高效液相色谱法检测鱼粉中的肌胃糜烂素，灵敏度高，最低检出量为1 mg/kg，有利于肌胃糜烂素的准确定量，可用于大规模样品检测。与背景技术中的专利文献CN104764845A相比，本发明的前处理方法能将鱼粉中游离的肌胃糜烂素和结合在蛋白质上的肌胃糜烂素完全提取出来，测定的是肌胃糜烂素的总量，数据的准确性更高；本发明的方法在进行预处理后还进行了富集和净化，能够将肌胃糜烂素富集，并除掉鱼粉中的杂质以及一些酸性和中性氨基酸，避免鱼粉中其他物质对分离的干扰，有利于液相色谱的分离实用性更高。
（2）本发明所述方法采用标准曲线校准样品含量，而不是专利文献CN104764845A的单点校准方法，计算样品的含量更准确。
附图说明
图1为肌胃糜烂素标准品溶液色谱图；
图2为标准曲线，其中，横坐标为肌胃糜烂素浓度，纵坐标为肌胃糜烂素色谱峰峰面积。
具体实施方式
实施例1
一种鱼粉中肌胃糜烂素的检测方法，包括以下步骤：
（1）样品预处理
取鱼粉100 mg加入水解管中，再加入6 mol/L的盐酸5 mL，旋紧盖子，放在109 ℃的干燥箱中，水解22 h后过滤得到水解液，再用10 mol/L氢氧化钠溶液调节pH值至6.8，静置后，进行离心后取上清液，得到粗提液；
（2）富集和净化
取3 mL甲醇和3mL超纯水活化MCX固相萃取柱，将步骤（1）得到的粗提液注入MCX固相萃取柱进行富集，再分别以3 mL水和3 mL甲醇淋洗MCX固相萃取柱，抽干后用3 mL氨水-甲醇溶液洗脱，洗脱液用40 ℃的氮气吹干，加入0.4 mol/L硼酸缓冲液0.5 mL，涡旋振荡1min，然后通过0.22 µm滤膜，得到待测液；
（3）在线自动化衍生程序
首先吸取硼酸缓冲液10 µL，待测液20 µL，混合后，再吸取邻苯二甲醛10 µL进行混合，反应1 min后注入到色谱仪中进行检测，然后根据标准曲线计算肌胃糜烂素的含量。
实施例2
一种鱼粉中肌胃糜烂素的检测方法，包括以下步骤：
（1）样品预处理
取鱼粉500 mg加入水解管中，再加入6 mol/L的盐酸10 mL，旋紧盖子，放在111 ℃的干燥箱中，水解24 h后过滤得到水解液，再用5 mol/L氢氧化钠溶液调节pH值至6.8，静置后，进行离心后取上清液，得到粗提液；
（2）富集和净化
取3 mL甲醇和3mL超纯水活化MCX固相萃取柱，将步骤（1）得到的粗提液注入MCX固相萃取柱进行富集，再分别以3 mL水和3 mL甲醇淋洗MCX固相萃取柱，抽干后用5 mL氨水-甲醇溶液洗脱，洗脱液用40 ℃的氮气吹干，加入0.2 mol/L硼酸缓冲液1 mL，涡旋振荡1min，然后通过0.22 µm滤膜，得到待测液；
（3）在线自动化衍生程序
首先吸取硼酸缓冲液10 µL，待测液20 µL，混合后，再吸取邻苯二甲醛10 µL进行混合，反应1 min后注入到色谱仪中进行检测，然后根据标准曲线计算肌胃糜烂素的含量。
实施例3
一种鱼粉中肌胃糜烂素的检测方法，包括以下步骤：
（1）样品预处理
取鱼粉300 mg加入水解管中，再加入6 mol/L的盐酸8 mL，旋紧盖子，放在110 ℃的干燥箱中，水解23 h后过滤得到水解液，再用8 mol/L氢氧化钠溶液调节pH值至7.00，静置后，进行离心后取上清液，得到粗提液；
（2）富集和净化
取3 mL甲醇和3 mL超纯水活化MCX固相萃取柱，将步骤（1）得到的粗提液注入MCX固相萃取柱进行富集，再分别以3 mL水和3 mL甲醇淋洗MCX固相萃取柱，抽干后用4 mL氨水-甲醇溶液洗脱，洗脱液用40 ℃的氮气吹干，加入0.25 mol/L硼酸缓冲液0.8 mL，涡旋振荡1 min，然后通过0.22 µm滤膜，得到待测液；
（3）在线自动化衍生程序
首先吸取硼酸缓冲液10 µL，待测液20 µL，混合后，再吸取邻苯二甲醛10 µL进行混合，反应1 min后注入到色谱仪中进行检测，然后根据标准曲线计算肌胃糜烂素的含量。
实施例4
一种鱼粉中肌胃糜烂素的检测方法，包括以下步骤：
（1）样品预处理
取鱼粉400 mg加入水解管中，再加入6 mol/L的盐酸7 mL，旋紧盖子，放在110 ℃的干燥箱中，水解22 h后过滤得到水解液，再用10 mol/L氢氧化钠溶液调节pH值至7.2，静置后，进行离心后取上清液，得到粗提液；
（2）富集和净化
取3 mL甲醇和3 mL超纯水活化MCX固相萃取柱，将步骤（1）得到的粗提液注入MCX固相萃取柱进行富集，再分别以3 mL水和3 mL甲醇淋洗MCX固相萃取柱，抽干后用4.5 mL氨水-甲醇溶液洗脱，洗脱液用40 ℃的氮气吹干，加入0.3 mol/L硼酸缓冲液0.7 mL，涡旋振荡1 min，然后通过0.22 µm滤膜，得到待测液；
（3）在线自动化衍生程序
首先吸取硼酸缓冲液10 µL，待测液20 µL，混合后，再吸取邻苯二甲醛10 µL进行混合，反应1 min后注入到色谱仪中进行检测，然后根据标准曲线计算肌胃糜烂素的含量。
本实施例中，步骤（1）中所述离心的转速为10000 r/min，离心时间为离心10 min。
实施例5
本实施例与实施例4的区别在于：
步骤（1）中，离心的转速为15000 r/min，离心时间为离心15 min。
步骤（2）中，粗提液注入MCX固相萃取柱的流速为1 mL/min；氨水-甲醇溶液中，氨水和甲醇的体积比为1:10，硼酸缓冲溶液的PH值为9。
实施例6
本实施例与实施例4的区别在于：
步骤（1）中，离心的转速为12000 r/min，离心时间为离心12 min。
步骤（2）中，粗提液注入MCX固相萃取柱的流速为1 mL/min；氨水-甲醇溶液中，氨水和甲醇的体积比为1:10，硼酸缓冲溶液的PH值为10.5。
步骤（3）中，色谱仪的色谱柱的内径为5 μm。
实施例7
本实施例与实施例6的区别在于：
步骤（1）中，离心的转速为14000 r/min，离心时间为离心11 min；硼酸缓冲溶液的PH值为10。
步骤（3）中，色谱仪的检测器为紫外检测器，检测波长为338 nm；检测时的流动相流速为1 mL/min。
实施例7
本实施例与实施例6的基础上，进一步选择，步骤（3）中，检测时的流动相为乙腈和磷酸盐缓冲溶液的混合溶液；
磷酸盐缓冲溶液为磷酸二氢钠和磷酸氢二钠按1:1的比例组成，所述磷酸盐缓冲溶液的pH值为7。
实施例8
一种鱼粉中肌胃糜烂素的检测方法，包括以下步骤：
（1）样品预处理
取鱼粉200 mg加入水解管中，再加入6 mol/L的盐酸6 mL，旋紧盖子，放在110 ℃的干燥箱中，水解23 h后过滤得到水解液，再用10 mol/L氢氧化钠溶液调节pH值至7，静置后，进行离心后取上清液，得到粗提液；
（2）富集和净化
取3 mL甲醇和3 mL超纯水活化MCX固相萃取柱，将步骤（1）得到的粗提液注入MCX固相萃取柱进行富集，再分别以3 mL水和3 mL甲醇淋洗MCX固相萃取柱，抽干后用4 mL氨水-甲醇溶液洗脱，洗脱液用40 ℃的氮气吹干，加入0.4 mol/L硼酸缓冲液0.6 mL，涡旋振荡1 min，然后通过0.22 µm滤膜，得到待测液；
（3）在线自动化衍生程序
首先吸取硼酸缓冲液10 µL，待测液20 µL，混合后，再吸取邻苯二甲醛10 µL进行混合，反应1 min后注入到色谱仪中进行检测，然后根据标准曲线计算肌胃糜烂素的含量。
上述步骤（1）中，离心的转速为13000 r/min，离心时间为离心13 min。
步骤（2）中，粗提液注入MCX固相萃取柱的流速为1 mL/min。
步骤（2）中，氨水-甲醇溶液中，氨水和甲醇的体积比为1:10。
步骤（2）中，硼酸缓冲溶液的PH值为10。
步骤（3）中，色谱仪的色谱柱的内径为5μm。
步骤（3）中，色谱仪的检测器为紫外检测器，检测波长为338nm。
步骤（3）中，检测时的流动相流速为1 mL/min。
步骤（3）中，检测时的流动相为乙腈和磷酸盐缓冲溶液的混合溶液；磷酸盐缓冲溶液为磷酸二氢钠和磷酸氢二钠按1:1的比例组成，磷酸盐缓冲溶液的pH值为7。
步骤（3）中，所述标准曲线的绘制方法如下：
准确称取肌胃糜烂素标准品0.01 g，置于10 mL棕色容量瓶中，加水约三分之二体积溶解，再用水定容至10 mL，配制成1 mg/mL的肌胃糜烂素储备液；再依次稀释为1 μg/mL，2 μg/mL，10 μg/mL，20 μg/mL，100 μg/mL的系列标准溶液，然后是用步骤（2）所述的方法进行处理后进行检测，最后以峰面积Y对浓度X(μg/mL)进行线性回归，绘制标准曲线，通过不断降低标准溶液浓度，取信噪比为3时的浓度为最低检出限。绘制的标准曲线如图2所示。
实施例9
一种鱼粉中肌胃糜烂素的检测方法，包括以下步骤：
（1）样品预处理
取鱼粉300 mg加入水解管中，再加入6 mol/L的盐酸8 mL，旋紧盖子，放在109 ℃的干燥箱中，水解23 h后过滤得到水解液，再用8 mol/L氢氧化钠溶液调节pH值至7，静置后，进行离心后取上清液，得到粗提液；
（2）富集和净化
取3 mL甲醇和3 mL超纯水活化MCX固相萃取柱，将步骤（1）得到的粗提液注入MCX固相萃取柱进行富集，再分别以3 mL水和3 mL甲醇淋洗MCX固相萃取柱，抽干后用4 mL氨水-甲醇溶液洗脱，洗脱液用40 ℃的氮气吹干，加入0.35 mol/L硼酸缓冲液0.9 mL，涡旋振荡1 min，然后通过0.22 µm滤膜，得到待测液；
（3）在线自动化衍生程序
首先吸取硼酸缓冲液10 µL，待测液20 µL，混合后，再吸取邻苯二甲醛10 µL进行混合，反应1 min后注入到色谱仪中进行检测，然后根据标准曲线计算肌胃糜烂素的含量。
上述步骤（1）中，离心的转速为14000 r/min，离心时间为离心15 min。
步骤（2）中，粗提液注入MCX固相萃取柱的流速为1 mL/min。
步骤（2）中，氨水-甲醇溶液中，氨水和甲醇的体积比为1:10。
步骤（2）中，硼酸缓冲溶液的PH值为10.2。
步骤（3）中，色谱仪的色谱柱的内径为5 μm。
步骤（3）中，色谱仪的检测器为紫外检测器，检测波长为338 nm。
步骤（3）中，检测时的流动相流速为1 mL/min。
步骤（3）中，检测时的流动相为乙腈和磷酸盐缓冲溶液的混合溶液；磷酸盐缓冲溶液为磷酸二氢钠和磷酸氢二钠按1:1的比例组成，磷酸盐缓冲溶液的pH值为7。
实施例10
准确称取3份空白鱼粉样品，分别加入肌胃糜烂素标准溶液，使得鱼粉中肌胃糜烂素含量分别为2、5、10 mg/kg，每个浓度水平下做3个平行试验，采用实施例7的方法进行检测，并根据标准曲线算出样品测定含量，进而计算该方法的回收率与精密度。
回收率和精密度的计算方法如下：
方法回收率（%）=（测定量 /添加量）×100%；精密度以相对标准偏差RSD%表示。
计算结果如下表1：
表1：
上述表1表明该方法操作性强，精密度高，相对标准偏差小，重现性好。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明做任何形式上的限制，凡是依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化，均落入本发明的保护范围之内。
Claims (9)
1.一种鱼粉中肌胃糜烂素的检测方法，其特征在于：包括以下步骤：
（1）样品预处理
取鱼粉100～500 mg加入水解管中，再加入6 mol/L的盐酸5～10 mL，旋紧盖子，放在109～111℃的干燥箱中，水解22～24 h后过滤得到水解液，再用5～10 mol/L氢氧化钠溶液调节pH值至6.8～7.2，静置后，进行离心后取上清液，得到粗提液；
（2）富集和净化
取3 mL甲醇和3 mL超纯水活化MCX固相萃取柱，将步骤（1）得到的粗提液注入MCX固相萃取柱进行富集，再分别以3 mL水和3 mL甲醇淋洗MCX固相萃取柱，抽干后用3～5 mL氨水-甲醇溶液洗脱，洗脱液用40 ℃的氮气吹干，加入0.2～0.4 mol/L硼酸缓冲液0.5～1 mL，涡旋振荡1 min，然后通过0.22 µm滤膜，得到待测液；
（3）在线自动化衍生程序
首先吸取硼酸缓冲液10 µL，待测液20 µL，混合后，再吸取邻苯二甲醛10 µL进行混合，反应1 min后注入到色谱仪中进行检测，然后根据标准曲线计算肌胃糜烂素的含量；
步骤（3）中，所述检测时的流动相为乙腈和磷酸盐缓冲溶液的混合溶液；所述磷酸盐缓冲溶液为磷酸二氢钠和磷酸氢二钠按1:1的比例组成，所述磷酸盐缓冲溶液的pH值为6.5～7.5。
2.如权利要求1所述的鱼粉中肌胃糜烂素的检测方法，其特征在于：步骤（1）中所述离心的转速为10000～15000 r/min，离心时间为离心10～15 min。
3.如权利要求1所述的鱼粉中肌胃糜烂素的检测方法，其特征在于：步骤（2）中，所述粗提液注入MCX固相萃取柱的流速为1 mL/min。
4.如权利要求1所述的鱼粉中肌胃糜烂素的检测方法，其特征在于：步骤（2）中，所述氨水-甲醇溶液中，氨水和甲醇的体积比为1:10。
5.如权利要求1所述的鱼粉中肌胃糜烂素的检测方法，其特征在于：步骤（2）中，所述硼酸缓冲溶液的pH值为9.0～10.5。
6.如权利要求1所述的鱼粉中肌胃糜烂素的检测方法，其特征在于：步骤（3）中，所述色谱仪的色谱柱的内径为5 μm。
7.如权利要求1所述的鱼粉中肌胃糜烂素的检测方法，其特征在于：步骤（3）中，所述色谱仪的检测器为紫外检测器，检测波长为338 nm。
8.如权利要求1所述的鱼粉中肌胃糜烂素的检测方法，其特征在于：步骤（3）中，所述检测时的流动相流速为1 mL/min。
9.如权利要求1所述的鱼粉中肌胃糜烂素的检测方法，其特征在于：步骤（3）中，所述标准曲线的绘制方法如下：
准确称取肌胃糜烂素标准品0.01 g，置于10 mL棕色容量瓶中，加水约三分之二体积溶解，再用水定容至10 mL，配制成1 mg/mL的肌胃糜烂素储备液；再依次稀释为1 μg/mL，2 μg/mL，10 μg/mL，20 μg/mL，100 μg/mL的系列标准溶液，然后是用步骤（2）所述的方法进行处理后进行检测，最后以峰面积Y对浓度X(μg/mL)进行线性回归，绘制标准曲线，通过不断降低标准溶液浓度，取信噪比为3时的浓度为最低检出限。
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| JPH0320646A (ja) * | 1989-06-16 | 1991-01-29 | Shimadzu Corp | ジゼロシン分析法及びその装置 |
| CN102692384A (zh) * | 2012-05-24 | 2012-09-26 | 广东工业大学 | 一种鱼粉中肌胃糜烂素的检测方法 |
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