CN107167532A - 一种采用高效液相色谱法测试食品中食品添加剂的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于食品的检测方法技术领域，尤其涉及一种采用高效液相色谱法测试食品中食品添加剂的方法，包括以下步骤：标准系列工作溶液的制备；待测液的制备；测定：用带有DAD检测器的高效液相色谱仪对混合标准系列工作溶液和待测液进行测试，采用梯度洗脱，并在变波长下进行检测，其中，高效液相色谱仪的流动相为乙酸铵溶液与甲醇梯度混合的混合液，并且乙酸铵溶液中加有乙酸溶液。本发明通过改进样品处理方法，可以同步提取出五种添加剂，提高检测效率，而且本发明通过优化高效液相色谱的流动相配比及分析参数，使五种添加剂的色谱峰得到良好的分离，便于准确的定量分析，在各添加剂保留时间内检测其特征吸收波长所对应的色谱峰峰面积，可以获得更低的检出限，并更好的排除其他组分干扰。
Description
技术领域
本发明属于食品的检测方法技术领域，尤其涉及一种采用高效液相色谱法测试食品中食品添加剂的方法，其中的食品添加剂包括安赛蜜、糖精钠、苯甲酸、山梨酸、脱氢乙酸。
背景技术
安赛蜜和糖精钠是人工合成的甜味剂，是可以改善食品的风味的食品添加剂；苯甲酸、山梨酸、脱氢乙酸是人工合成的防腐剂，是通过抑制微生物的生长从而延缓食品腐败的添加剂。这些添加剂由于成本低廉、性质稳定而在食品生产中广泛使用，但长期过量食用会对人体造成损害。GB 2760-2014《食品安全国家标准食品添加剂使用标准》中对这些添加剂均规定了使用原则、使用范围和最大使用量。
现有的食品安全国家标准的检测方法对以上五种添加剂分别采用了三种不同的检测方法，分别为GB5009.29-2016检测苯甲酸、山梨酸、糖精钠；GB5009.140-2003检测安赛蜜；GB/T23377-2009检测脱氢乙酸。而这五种添加剂经常被同时添加于各类食品中，分别检测不仅过程繁琐且各组分容易发生干扰，特别当样品中同时含有糖精钠和脱氢乙酸时，国标方法容易造成两组分色谱峰重叠，导致测量结果不准确。安赛蜜的检测方法国标中只有针对饮料的样品处理方法。
有鉴于此，确有必要提供一种采用高效液相色谱法测试食品中食品添加剂的方法，该方法通过改进样品处理方法，可以同步提取出五种添加剂(安赛蜜、糖精钠、苯甲酸、山梨酸、脱氢乙酸)，提高检测效率，而且本发明通过优化高效液相色谱的流动相配比及分析参数，使五种添加剂的色谱峰得到良好的分离，便于更准确的定量分析，在各添加剂组分保留时间内检测其特征吸收波长对应的色谱峰峰面积，可以获得更低的检出限，并更好的排除其他组分干扰。
发明内容
本发明的目的在于：针对现有技术的不足，而提供一种采用高效液相色谱法测试食品中食品添加剂的方法，该方法通过改进样品处理方法，可以同步提取出五种添加剂(安赛蜜、糖精钠、苯甲酸、山梨酸、脱氢乙酸)，提高检测效率，而且本发明通过优化高效液相色谱的流动相配比及分析参数，使五种添加剂的色谱峰得到良好的分离，便于更准确的定量分析；在各添加剂组分保留时间内检测其特征吸收波长对应的色谱峰峰面积，可以获得更低的检出限，并更好的排除其他组分干扰。
为了达到上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种采用高效液相色谱法测试食品中食品添加剂的方法，包括以下步骤：
1)标准系列工作溶液的制备：分别称取标准物质安赛蜜、糖精钠，苯甲酸、山梨酸、脱氢乙酸，转移至容量瓶，加甲醇溶解，再加水定容至刻度；得到的混合标准溶液用水逐级稀释后得到混合标准系列工作溶液；加入甲醇可以使难溶解的标准物质充分溶解，并延长混合标准溶液的有效保存时间。
2)待测液的制备：
第一步，将称取的样品加入具塞离心管中，加水后涡旋混匀，超声提取，然后加入亚铁氰化钾溶液和乙酸锌溶液，混匀，离心后移出上清液至容量瓶中，得到剩余残渣；通过增加涡旋混匀和超声提取时间，可以尽可能地将样品中的食品添加剂提取出来；亚铁氰化钾溶液和乙酸锌溶液的混合可以充分沉淀样品中的蛋白质成分，除去杂质。
第二步，向第一步获得的剩余残渣中加入水，超声提取，离心后将上清液移入第一步的容量瓶中，用水定容至刻度，过滤，得到待测液；通过对残渣的进一步超声提取，可以尽可能地将样品中的食品添加剂提取出来，以提高检测准确度。
若样品为果冻、糖果，样品称样后，需加水稀释，加热溶解后加入具塞离心管中，以提高提取效果；若样品为酒或碳酸饮料，样品称样后需加热除去乙醇和碳酸，以防止乙醇和碳酸对检测结果造成干扰。
若样品为高油脂样品，则第一步为：对样品进行称样，然后将样品加入正己烷中水浴加热，溶解脂肪后加氨水溶液和乙醇混匀超声提取，冷却至室温后再加入亚铁氰化钾溶液和乙酸锌溶液混匀，离心后将水相转入容量瓶中，，得到剩余残渣；第二步为：向第一步获得的剩余残渣中加入水混匀，超声提取，离心后将水相移入第一步的容量瓶中定容至刻度。
3)测定：用带有DAD检测器(二极管阵列检测器)的高效液相色谱仪对混合标准系列工作溶液和待测液进行测试，采用梯度洗脱，并在变波长下进行检测，其中，高效液相色谱仪的流动相为乙酸铵溶液与甲醇梯度混合的混合液，并且乙酸铵溶液中加有体积分数为1％的乙酸溶液，其中乙酸铵溶液与乙酸溶液的体积比为(350-450)：1。采用DAD检测器灵敏度高、噪音低、线性范围宽，适用于梯度洗脱，而且可得到任意波长对应的色谱图。
作为本发明采用高效液相色谱法测试食品中食品添加剂的方法的一种改进，第一步中，亚铁氰化钾溶液的浓度为80g/L-100g/L，乙酸锌溶液的浓度为150g/L-200g/L。这两种沉淀剂可以充分沉淀样品中的蛋白质组分，排除杂质，显著减少了检测的干扰。
作为本发明采用高效液相色谱法测试食品中食品添加剂的方法的一种改进，第二步所述过滤是将定容后的溶液通过直径为0.22μm的聚醚砜滤膜过滤到样品瓶中，这种聚醚砜滤膜可以有效的过滤掉有机相杂质，且本身不会溶解到水相成分中去。
作为本发明采用高效液相色谱法测试食品中食品添加剂的方法的一种改进，第一步中，涡旋混匀的时间为1-5min，超声提取的持续时间为10min-1h，离心的转速为5000r/min-10000r/min，离心的时间为1min-10min；第二步中，超声提取的持续时间为10min-30min，离心的转速为5000r/min-10000r/min，离心的时间为1min-10min。
作为本发明采用高效液相色谱法测试食品中食品添加剂的方法的一种改进，高效液相色谱仪的色谱柱为C18柱，250mm×4.6mm(即色谱柱长度为250mm，内径为4.6mm)，色谱柱内的填料的粒径为5μm。
作为本发明采用高效液相色谱法测试食品中食品添加剂的方法的一种改进，流动相乙酸铵溶液的浓度为0.02mol/L，并且乙酸铵溶液中加有体积分数为1％的乙酸溶液，其中乙酸铵溶液与乙酸溶液的体积比为(350-450)：1。梯度洗脱的程序如下表：
| T(min) | 0 | 10 | 18 | 20 |
| 乙酸铵％ | 90 | 80 | 80 | 90 |
| 甲醇％ | 10 | 20 | 20 | 10 |
此流动相的配比及梯度洗脱程序可以增加5种添加剂的色谱峰的分离度，排除了组分之间的干扰，使检测结果更准确。
梯度洗脱时的柱温为30℃，混合液的流速为1.0mL/min。
作为本发明采用高效液相色谱法测试食品中食品添加剂的方法的一种改进，变波长的程序如下表：
| T(min) | 0 | 10 | 12 | 14 |
| 波长(nm) | 230 | 204 | 250 | 230 |
此变波长程序根据各添加剂的保留时间选择其最大吸收波长所对应的峰面积，可得到更低的检出限，使检测结果更准确。
相对于现有技术，本发明至少具有如下优点：
第一，本发明通过采用合适的样品处理方法及提取手段，将样品中的五种食品添加剂(安赛蜜、糖精钠、苯甲酸、山梨酸、脱氢乙酸)同步完全提取出来，大幅提高检测效率。
第二，本发明通过优化仪器条件并采用梯度洗脱，能将各种添加剂一次性分离，特别是容易互相干扰的组分(如糖精钠和脱氢乙酸)，从而快速准确的检测出各种添加剂的含量。
第三，在流动相中加入适量乙酸溶液，使糖精钠和脱氢乙酸的色谱峰得到更好的分离，降低干扰，提高检测的准确度和灵敏度，以克服国标方法容易造成两组分色谱峰重叠，导致测量结果不准确的缺陷。
第四根据各组分的保留时间检测其特征吸收波长所对应的色谱峰峰面积，可得到更低的检出限，并进一步排除其他组分干扰。
附图说明
下面结合附图和具体实施方式，对本发明及其有益技术效果进行详细说明。
图1为本发明中实施例1的各组分分离图谱。
图2为对比例1的各组分分离图谱。
图3至图7分别为5种添加剂的标准曲线。
具体实施方式
实施例1
本实施例提供了一种采用高效液相色谱法测试食品中食品添加剂的方法，包括以下步骤：
1)标准系列工作溶液的制备：分别称取标准物质安赛蜜、糖精钠、苯甲酸、山梨酸、脱氢乙酸0.1g(精确至0.00001g)，转移至100mL容量瓶，加20mL甲醇溶解，再加水定容至刻度；将以上混合标准溶液加水逐级稀释，得到5种添加剂的混合标准系列工作溶液，浓度分别为1.0μg/mL、5.0μg/mL、10.0μg/mL、20.0μg/mL、100.0μg/mL。
2)待测液的制备：
第一步，取市售的果冻作为样品，称取样品2g(精确到0.0001g)，加10mL水稀释后加热至70℃使其溶解，然后将溶解后的样品转移至50mL的具塞离心管中，加水10mL后涡旋混匀1min，超声提取30min，然后加入2mL质量浓度为92g/L的亚铁氰化钾溶液和2mL质量浓度为183g/L的乙酸锌溶液，混匀，于8000r/min离心5min后移出上清液至50mL的容量瓶中，得到剩余残渣；
第二步，向第一步获得的剩余残渣中加入20mL水，超声提取10min，于8000r/min离心5min后将上清液移入第一步的50mL的容量瓶中，用水定容至刻度，将定容后的溶液通过直径为0.22μm的聚醚砜滤膜过滤到样品瓶中，得到待测液；
3)测定：用带有DAD检测器的高效液相色谱仪对混合标准系列工作溶液和待测液进行测试，采用梯度洗脱，并在变波长下进行检测，其中，高效液相色谱仪的流动相为0.02mol/L乙酸铵溶液与甲醇梯度混合的混合液，并且乙酸铵溶液中加有体积分数为1％的乙酸溶液，乙酸铵与乙酸的体积比为399：1。具体而言，本实施例中，每升乙酸铵溶液中加入2.5mL乙酸溶液。
其中，高效液相色谱仪为Agilent1200，色谱柱为Phenomenex C18柱，250mm×4.6mm(即色谱柱长度为250mm，内径为4.6mm)，色谱柱内的填料的粒径为5μm。
梯度洗脱的程序如下表：
| T(min) | 0 | 10 | 18 | 20 |
| 乙酸铵％ | 90 | 80 | 80 | 90 |
| 甲醇％ | 10 | 20 | 20 | 10 |
梯度洗脱时的柱温为30℃，混合液的流速为1.0mL/min。
变波长的程序如下表：
| T(min) | 0 | 10 | 12 | 14 |
| 波长(nm) | 230 | 204 | 250 | 230 |
以混合标准系列工作溶液的浓度为横坐标，5种添加剂对应的色谱峰峰面积为纵坐标绘制标准曲线，其中，5种添加剂的标准曲线分别如图3至图7所示；测定待测液的色谱峰峰面积，根据标准曲线得到待测液中5种添加剂的质量浓度。
采用本实施例得到的各组分分离图谱如图1所示，由图1可以看出：本发明的方法可以对食品中的多种添加剂同时检测出，而且糖精钠和脱氢乙酸得到了很好的分离，检测的准确度和灵敏度高。
对比例1
与实施例1不同的是，3)测定步骤中，乙酸铵溶液中不加入乙酸溶液，洗脱程序为乙酸铵溶液与甲醇体积比为95:5等度洗脱。其余同实施例1，这里不再赘述。
采用本对比例得到的各组分分离图谱如图2所示，比较图1和图2可以看出：通过在乙酸铵溶液中加入乙酸溶液以及采用梯度洗脱程序，可以将糖精钠和脱氢乙酸这两种组分峰容易重叠的物质完全的分离开来，从而可以大大提高检测的准确度和灵敏度。
实施例2
本实施例提供了一种采用高效液相色谱法测试食品中食品添加剂的方法，包括以下步骤：
1)标准系列工作溶液的制备：分别称取标准物质安赛蜜、糖精钠、苯甲酸、山梨酸、脱氢乙酸0.1g(精确至0.00001g)，转移至100mL容量瓶，加20mL甲醇溶解，再加水定容至刻度；将得到的混合标准溶液加水逐级稀释，得到5种添加剂的混合标准系列工作溶液，浓度分别为1.0μg/mL、5.0μg/mL、10.0μg/mL、20.0μg/mL、100.0μg/mL。
2)待测液的制备：
第一步，取市售的蛋糕作为样品，称取样品2g(精确到0.0001g)，加入50mL的具塞离心管中，加水25mL后涡旋混匀，超声提取30min，然后加入2mL质量浓度为85g/L的亚铁氰化钾溶液和2mL质量浓度为165g/L的乙酸锌溶液，混匀，于6000r/min离心10min后移出上清液至50mL的容量瓶中，得到剩余残渣；
第二步，向第一步获得的剩余残渣中加入20mL水，超声提取15min，于6000r/min离心10min后将上清液移入第一步的50mL的容量瓶中，用水定容至刻度，将定容后的溶液通过直径为0.22μm的聚醚砜滤膜过滤到样品瓶中，得到待测液；
3)测定：用带有DAD检测器的高效液相色谱仪对混合标准系列工作溶液和待测液进行测试，采用梯度洗脱，并在变波长下进行检测，其中，高效液相色谱仪的流动相为0.02mol/L乙酸铵溶液与甲醇梯度混合的混合液，并且乙酸铵溶液中加有体积分数为1％乙酸溶液，乙酸铵溶液与乙酸溶液的体积比为395：1。
其中，高效液相色谱仪为Agilent1200，色谱柱为Phenomenex C18柱250mm×4.6mm(即色谱柱长度为250mm，内径为4.6mm)，色谱柱内的填料的粒径为5μm。
梯度洗脱的程序如下表：
| T(min) | 0 | 10 | 18 | 20 |
| 乙酸铵％ | 90 | 80 | 80 | 90 |
| 甲醇％ | 10 | 20 | 20 | 10 |
梯度洗脱时的柱温为30℃，混合液的流速为1.0mL/min。
变波长的程序如下表：
| T(min) | 0 | 10 | 12 | 14 |
| 波长(nm) | 230 | 204 | 250 | 230 |
以混合标准系列工作溶液的浓度为横坐标，5种添加剂对应的色谱峰峰面积为纵坐标绘制标准曲线；测定待测液的色谱峰峰面积，根据标准曲线得到待测液中5种添加剂的质量浓度。
实施例3
本实施例提供了一种采用高效液相色谱法测试食品中食品添加剂的方法，包括以下步骤：
1)标准系列工作溶液的配制：分别称取标准物质安赛蜜、糖精钠、苯甲酸、山梨酸、脱氢乙酸0.1g(精确至0.00001g)，转移至100mL容量瓶，加甲醇20mL溶解，再加水定容至刻度；将得到混合标准溶液加水逐级稀释，得到5种添加剂的混合标准系列工作溶液，浓度分别为1.0μg/mL、5.0μg/mL、10.0μg/mL、20.0μg/mL、100.0μg/mL。
2)待测液的制备：
第一步，取市售的香肠作为样品，称取样品2g(精确到0.0001g)，将样品加入10mL正己烷中，然后于60℃水浴下加热5min，溶解脂肪后加体积分数为1％的氨水溶液25mL，乙醇1mL混匀，超声提取50min，冷却至室温后加入2mL质量浓度为95g/L的亚铁氰化钾溶液和2mL质量浓度为195g/L的乙酸锌溶液，混匀，于8000r/min离心5min，水相转入50mL容量瓶，得到剩余残渣；
第二步，向第一步获得的剩余残渣中加入20mL水，超声提取20min，于8000r/min离心5min后将水相移入第一步的50mL的容量瓶中，用水定容至刻度，将定容后的溶液通过直径为0.22μm的聚醚砜滤膜过滤到样品瓶中，得到待测液；
3)测定：用带有DAD检测器的高效液相色谱仪对混合标准系列工作溶液和待测液进行测试，采用梯度洗脱，并在变波长下进行检测，其中，高效液相色谱仪的流动相为0.02mol/L乙酸铵溶液与甲醇梯度混合的混合液，并且乙酸铵溶液中加有体积分数为1％的乙酸溶液，乙酸铵溶液与乙酸溶液的体积比为410：1。
其中，高效液相色谱仪为Agilent1200，色谱柱为Phenomenex C18柱250mm×4.6mm(即色谱柱长度为250mm，内径为4.6mm)，色谱柱内的填料的粒径为5μm。
梯度洗脱的程序如下表：
梯度洗脱时的柱温为30℃，混合液的流速为1.0mL/min。
变波长的程序如下表：
| T(min) | 0 | 10 | 12 | 14 |
| 波长(nm) | 230 | 204 | 250 | 230 |
以混合标准系列工作溶液的浓度为横坐标，5种添加剂对应的色谱峰峰面积为纵坐标绘制标准曲线；测定待测液的色谱峰峰面积，根据标准曲线得到待测液中5种添加剂的质量浓度。
由此可见，本发明的方法通过改进样品处理方法，可以同步提取出五种添加剂(安赛蜜、糖精钠、苯甲酸、山梨酸、脱氢乙酸)，提高检测效率，而且本发明通过优化高效液相色谱的流动相配比及分析参数，使五种添加剂的色谱峰得到良好的分离，便于准确的定量分析；在各添加剂组分保留时间内检测其特征吸收波长所对应的色谱峰峰面积，可以获得更低的检出限，并更好的排除其他组分干扰。
根据上述说明书的揭示和教导，本发明所属领域的技术人员还可以对上述实施方式进行变更和修改。因此，本发明并不局限于上面揭示和描述的具体实施方式，对本发明的一些修改和变更也应当落入本发明的权利要求的保护范围内。此外，尽管本说明书中使用了一些特定的术语，但这些术语只是为了方便说明，并不对本发明构成任何限制。
Claims (9)
1.一种采用高效液相色谱法测试食品中食品添加剂的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)混合标准系列工作溶液的制备：分别称取标准物质安赛蜜、糖精钠、苯甲酸、山梨酸、脱氢乙酸，转移至容量瓶，加甲醇溶解再加水定容至刻度，得到的混合标准溶液用水逐级稀释后得到混合标准系列工作溶液；
2)待测液的制备：
第一步，将称取的样品加入具塞离心管中，加水后涡旋混匀，超声提取，然后加入亚铁氰化钾溶液和乙酸锌溶液，混匀，离心后移出上清液至容量瓶中，得到剩余残渣；
第二步，向第一步获得的剩余残渣中加入水，超声提取，离心后将上清液移入第一步的容量瓶中，用水定容至刻度，过滤，得到待测液；
3)测定：用带有DAD检测器的高效液相色谱仪对混合标准系列工作溶液和待测液进行测试，采用梯度洗脱，并在变波长下进行检测，其中，高效液相色谱仪的流动相为0.02mol/L乙酸铵溶液与甲醇梯度混合的混合液，其中乙酸铵溶液中加有体积分数为1％的乙酸溶液，并且乙酸铵溶液与乙酸溶液的质量比为(350-450)：1，以混合标准系列工作溶液的浓度为横坐标，5种添加剂对应的色谱峰的峰面积为纵坐标绘制标准曲线；测定待测液的色谱峰的峰面积，根据标准曲线得到待测液中5种添加剂的质量浓度。
2.根据权利要求1所述的采用高效液相色谱法测试食品中食品添加剂的方法，其特征在于：第一步中，若样品为果冻、糖果，样品称样后，需加水稀释，再加热溶解。
3.根据权利要求1所述的采用高效液相色谱法测试食品中食品添加剂的方法，其特征在于：第一步中，若样品为酒或碳酸饮料，样品称样后需先加热除去乙醇和碳酸。
4.根据权利要求1所述的采用高效液相色谱法测试食品中食品添加剂的方法，其特征在于：若样品为高油脂样品，则第一步为：对样品进行称样，然后将样品加入正己烷并水浴加热，溶解脂肪后加氨水溶液和乙醇混匀超声提取，冷却至室温后再加入亚铁氰化钾溶液和乙酸锌溶液混匀，离心后将水相转入容量瓶中，得到剩余残渣；第二步为：向第一步获得的剩余残渣中加入水混匀，超声提取，离心后将水相移入第一步的容量瓶中定容至刻度。
5.根据权利要求1所述的采用高效液相色谱法测试食品中食品添加剂的方法，其特征在于：第二步所述过滤是将定容后的溶液通过直径为0.22μm的聚醚砜滤膜过滤到样品瓶中。
6.根据权利要求1所述的采用高效液相色谱法测试食品中食品添加剂的方法，其特征在于：第一步中，超声提取的持续时间为10min-1h，离心的转速为5000r/min-10000r/min，离心的时间为5min-10min；第二步中，超声提取的持续时间为10min-30min，离心的转速为5000r/min-10000r/min，离心的时间为5min-10min。
7.根据权利要求1所述的采用高效液相色谱法测试食品中食品添加剂的方法，其特征在于：高效液相色谱仪的色谱柱为C18柱，250mm×4.6mm，色谱柱内的填料的粒径为5μm。
8.根据权利要求1所述的采用高效液相色谱法测试食品中食品添加剂的方法，其特征在于，梯度洗脱的程序如下表：
梯度洗脱时的柱温为30℃，混合液的流速为1.0mL/min。
9.根据权利要求1所述的采用高效液相色谱法测试食品中食品添加剂的方法，其特征在于，变波长的程序如下表：
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