CN102809620B - 一种乳制品中酵母β-葡聚糖的检测方法 - Google Patents
一种乳制品中酵母β-葡聚糖的检测方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种检测方法，特别涉及一种乳制品中酵母β-葡聚糖的检测方法，属于化学成分检测的技术领域。本方法按照如下步骤进行检测：样品前处理；标准品前处理；葡萄糖标准曲线制备；半乳糖标准曲线制备；样品及标准品水解；色谱检测葡萄糖、半乳糖含量；以葡萄糖、半乳糖标准曲线对水解产品进行定性，以酵母β-葡聚糖标准品水解产物进行定量，即可定量得知被检测的乳制品样品中酵母β-葡聚糖含量。
Description
技术领域
本发明涉及一种检测方法，特别涉及一种乳制品中酵母β-葡聚糖的检测方法，属于化学成分检测的技术领域。
背景技术
酵母β-葡聚糖是以酿酒酵母为原料，经提取、酸碱处理、喷雾干燥等步骤生产而成的新资源食品，分子量2万-400万道尔顿；分子式为(C6H12O6)n，n为125-25000；结构式见图1。
目前，国内尚未有酵母β-葡聚糖在乳制品中定量检测方法的国家标准和行业标准。
乳制品中的糖主要为乳糖，结构式见图2。充分水解产物为葡萄糖和半乳糖。
酵母β-葡聚糖是具有β-1,3及/β-1,6结构的葡萄糖聚合物，充分水解产物为葡萄糖。酵母β-葡聚糖不能与乳制品中胶体形成非常稳固的胶体体系，在离心过程中会沉降下来，而乳制品中乳糖、脂类不会沉降，从而使其与乳制品分离；分离后得到的酵母β-葡聚糖经过酸水解形成葡萄糖溶液；使用HPLC测定其中葡萄糖和半乳糖的含量，进而通过葡萄糖比半乳糖多出的部分计算出酵母β-葡聚糖的含量。
发明内容
本发明的目的是开发一种酵母β-葡聚糖在乳制品中定量检测的方法，其检测灵敏度高，检测准确度高，重复性好。
本发明的技术方案如下：
1.样品前处理
1.1称样
在50mL高速离心管中称取待测液体样品25.0000x N g，其中固体样品5.0000x Ng加超纯水至25.0000x N g，充分溶解；
其中液体样品指我公司或市场上的可以流动的乳制品，如：调制乳、酸牛奶、乳饮料等；固体样品指奶粉、奶酪、冰淇淋等产品。
1.2沉淀
加入5x N mL 20%乙酸锌溶液和5x N mL 10%亚铁氰化钾溶液，充分振荡混合后于5500g离心10min，去掉上清液。
1.3水洗
沉淀物加15x N mL超纯水，玻璃棒搅匀，用10x Nml超纯水冲洗玻璃棒，振荡混合均匀后，于5500g离心10min，去掉上清液。
1.4醇洗
沉淀物加15x N mL 75%乙醇，玻璃棒搅匀，用10x N mL 75%乙醇冲洗玻璃棒，震荡混合均匀后，于5500g离心10min，去掉上清液。
1.5二次水洗
沉淀物再加15x N mL超纯水，玻璃棒搅匀，用10x NmL超纯水冲洗玻璃棒，震荡混合均匀后，于5500g离心10min，去掉上清液。
2.标准品前处理
2.1称样
在250mL SCHOTT瓶中称入0.0105g（称准至0.0002g）Sigma G5011标准品。
2.2标准品预溶
加入50mL超纯水预溶。
3.葡萄糖标准曲线制备
吸取葡萄糖标液1、3、5mL到10mL容量瓶中，用超纯水定容到刻度，得到葡萄糖为20、60、100mg/L的混合标样。在色谱条件下准确进样20uL，绘制色谱峰面积和标准物质量浓度之间的标准曲线，得出回归方程。
4.半乳糖标准曲线制备
吸取半乳糖标液1、3、5mL到10mL容量瓶中，用超纯水定容到刻度，得到半乳糖为20、60、100mg/L的混合标样。在色谱条件下准确进样20uL，绘制色谱峰面积和标准物质量浓度之间的标准曲线，得出回归方程。
5.样品及标准品水解
5.1样品加酸
将1.5得到的沉淀物转入250mL SCHOTT瓶中，加入12x N mL盐酸（37%），加超纯水至150mL，振荡混匀。
5.2标准品加酸
在2.2得到的标准品溶液中，加入12mL盐酸（37%），加超纯水至150mL，振荡混匀。
5.3水解
将SCHOTT瓶放入高压灭菌锅121℃处理60min。水解完成后马上冷却。用40%氢氧化钠，将溶液调pH到6-7，然后定容至250mL。
6.色谱检测葡萄糖、半乳糖含量
可以采用但不仅限于以下色谱柱及检测器对葡萄糖、半乳糖含量进行分析。
1）糖柱：
色谱柱：糖柱（Waters Sugar-pak Ⅰ6.5 x 300mm）
流速：0.5ml/min
温度：80℃
流动相：超纯水
检测器：蒸发光散射检测器或者示差折光检测器
2）氨基色谱柱：
色谱柱：氨基柱（Waters Spherisorb Amino(NH2)Cartridge,5μm,3mmX 250mm）
流速：1.0ml/min
温度：40℃
流动相：乙腈/超纯水（80/20）
检测器：蒸发光散射检测器
3）离子色谱：
色谱柱：DIONEX CarboPac PA20Analytical Column（3x150mm）
流速：0.35ml/min
温度：30℃
流动相：18mM NaOH
检测器：电化学检测器
7.结果计算
结果计算采用式1-3。
其中：
W：称量的牛奶样品，g；
V：样品水解后定容体积，mL；
c葡萄糖：样品水解定容后由HPLC测定得到的葡萄糖含量，g/mL；
c半乳糖：样品水解定容后由HPLC测定得到的半乳糖含量，g/mL；
0.9：葡萄糖换算为葡聚糖的换算因子；
F：葡聚糖水解校正因子；
C葡萄糖-标：标准品水解定容后由HPLC测定得到的葡萄糖含量，g/mL；
V标：标准品水解后定容体积，mL；
W标：标准品称样质量，g；
其中，N大于0；优选地，N的范围为0.01-5；更优选地，N的范围为0.1-2；更优选地，N的范围为0.5-1.2；最优选地，N=1。
8.注意事项
8.1以葡萄糖、半乳糖标准曲线对水解产品进行定性，以酵母β-葡聚糖标准品水解产物进行定量，即可定量得知被检测的乳制品样品中酵母β-葡聚糖含量。
8.2在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。
有益效果
本发明方法的线性回归方程相关系数＞0.98，其线性范围在0.01mg/g—2mg/g(检测范围在线性范围之间)。精确度达90%以上，样品回收率达80%以上。能有效检测出乳制品中的酵母β-葡聚糖含量。
附图说明
图1：酵母β-葡聚糖结构式
图2：乳糖结构式
图3：设定回收率≥80%为可信值时，样品（2-6号样）以酵母β-葡聚糖理论含量为横坐标，测定含量为纵坐标，得到线性回归方程。
具体实施方式
以下通过具体实施例详细说明本发明的技术及特点，但这些实施例并非用以限定本发明的保护范围。
实施例1添加酵母β-葡聚糖调制乳中葡聚糖检测方法
在50mL高速离心管中称取待测液体样品25.0002g；平行样25.0001g；回收率对照样称入0.0104g Sigma G5011标准品，加纯牛奶补足至25.0002g。
分别加入5mL 20%乙酸锌溶液和5mL 10%亚铁氰化钾溶液，充分振荡混合后于5500g离心10min，去掉上清液。
沉淀物分别加15mL超纯水，玻璃棒搅匀，用10ml超纯水冲洗玻璃棒，振荡混合均匀后，于5500g离心10min，去掉上清液。
沉淀物分别加15mL 75%乙醇，玻璃棒搅匀，用10mL 75%乙醇冲洗玻璃棒，震荡混合均匀后，于5500g离心10min，去掉上清液。
沉淀物分别再加15mL超纯水，玻璃棒搅匀，用10mL超纯水冲洗玻璃棒，震荡混合均匀后，于5500g离心10min，去掉上清液。
在250mL SCHOTT瓶中称入0.0104g Sigma G5011标准品。加入50mL超纯水预溶。
吸取葡萄糖标液1、3、5mL到10mL容量瓶中，用超纯水定容到刻度，得到葡萄糖为20、60、100mg/L的混合标样。在色谱条件下准确进样20uL，绘制色谱峰面积和标准物质量浓度之间的标准曲线，得出回归方程。
吸取半乳糖标液1、3、5mL到10mL容量瓶中，用超纯水定容到刻度，得到葡萄糖为20、60、100mg/L的混合标样。在色谱条件下准确进样20uL，绘制色谱峰面积和标准物质量浓度之间的标准曲线，得出回归方程。
将得到的样品沉淀物转入250mL SCHOTT瓶中，加入12mL盐酸（37%），加超纯水至150mL，振荡混匀。
在标准品溶液中，加入12mL盐酸（37%），加超纯水至150mL，振荡混匀。
将SCHOTT瓶放入高压灭菌锅121℃处理60min。水解完成后马上冷却。用40%氢氧化钠，将溶液调pH到6.5，然后定容至250mL。
采用离子色谱：色谱柱：PA20（3 x 150mm）流速：0.35ml/min
温度：30℃流动相：18mM NaOH，检测器：电化学检测器进行检测。
检测结果如下：
C葡萄糖-标=0.0343g/L（离子色谱结果）；
W标=0.0104g；
V标=250ml；
标准品纯度=98%
平行样一：
C葡萄糖1=0.0523g/L（离子色谱结果）；
C半乳糖1=0.0193g/L（离子色谱结果）；
V1=250ml；
W1=25.0002g
平行样二：
C葡萄糖2=0.0501g/L（离子色谱结果）；
C半乳糖2=0.0175g/L（离子色谱结果）；
V2=250ml；
W2=25.0001g
回收率对照样：
C葡萄糖3=0.0510g/L（离子色谱结果）；
C半乳糖3=0.0169g/L（离子色谱结果）；
V3=250ml；
W3=25.0002g
注：标准品G5011酵母β-葡聚糖含量≥98%；样品中添加酵母β-葡聚糖含量≥70%。
平行样一酵母β-葡聚糖理论值为：42mg/100g；
平行样二酵母β-葡聚糖理论值为：42mg/100g；
结果分析：
样品理论回收率92.83%。
实施例2添加酵母β-葡聚糖调制乳中检出限
对照样，在50mL高速离心管中称入0.0105g Sigma G5011标准品，加纯牛奶补足至25.0000g。
试验样，在50mL高速离心管中分别称入2.0000mg、3.5716mg、12.0780mg、38.0056mg、55.3540mg、71.4280mg、75.5501mg 70%酵母β-葡聚糖原料，加纯牛奶补足至25.0000g。
分别加入5mL 20%乙酸锌溶液和5mL 10%亚铁氰化钾溶液，充分振荡混合后于5500g离心10min，去掉上清液。
沉淀物分别加15mL超纯水，玻璃棒搅匀，用10ml超纯水冲洗玻璃棒，振荡混合均匀后，于5500g离心10min，去掉上清液。
沉淀物分别加15mL 75%乙醇，玻璃棒搅匀，用10mL 75%乙醇冲洗玻璃棒，震荡混合均匀后，于5500g离心10min，去掉上清液。
沉淀物分别再加15mL超纯水，玻璃棒搅匀，用10mL超纯水冲洗玻璃棒，震荡混合均匀后，于5500g离心10min，去掉上清液。
在250mL SCHOTT瓶中称入0.0104g Sigma G5011标准品。加入50mL超纯水预溶。
吸取葡萄糖标液1、3、5mL到10mL容量瓶中，用超纯水定容到刻度，得到葡萄糖为20、60、100mg/L的混合标样。在色谱条件下准确进样20uL，得出回归方程。
吸取半乳糖标液1、3、5mL到10mL容量瓶中，用超纯水定容到刻度，得到半乳糖为20、60、100mg/L的混合标样。在色谱条件下准确进样20uL，得出回归方程。
将得到的样品沉淀物转入250mL SCHOTT瓶中，加入12mL盐酸（37%），加超纯水至150mL，振荡混匀。
在标准品溶液中，加入12mL盐酸（37%），加超纯水至150mL，振荡混匀。
将SCHOTT瓶放入高压灭菌锅121℃处理60min。水解完成后马上冷却。用40%氢氧化钠，将溶液调pH到6.5，然后定容至250mL。
采用离子色谱：色谱柱：PA20（3 x 150mm）流速：0.35ml/min
温度：30℃流动相：18mM NaOH，检测器：电化学检测器进行检测。
检测结果如下：
注：计算公式同实施例1。
设定回收率≥80%为可信值时，样品（2-6号样）以酵母β-葡聚糖理论含量为横坐标，测定含量为纵坐标，得到图3，验证检测线性回归方程相关系数。
由图3可知，线性方程回归系数R2=0.9987；
设定回收率≥80%为可信值时，线性范围为10.0005mg/100g-199.9984mg/100g，即为0.0100005mg/g-1.9984mg/g。
Claims (5)
1.一种乳制品中酵母β-葡聚糖的检测方法，包括下列步骤：
a)样品前处理
i)称样
在50mL高速离心管中称取待测液体样品25.0000x N g，其中固体样品5.0000x N g加超纯水至25.0000x N g，充分溶解；
ii)沉淀
加入5x N mL20%乙酸锌溶液和5x N mL10%亚铁氰化钾溶液，充分振荡混合后于5500g离心10min，去掉上清液；
iii)水洗
沉淀物加15x N mL超纯水，玻璃棒搅匀，用10x N ml超纯水冲洗玻璃棒，振荡混合均匀后，于5500g离心10min，去掉上清液；
iv)醇洗
沉淀物加15x N mL75%乙醇，玻璃棒搅匀，用10x N mL75%乙醇冲洗玻璃棒，震荡混合均匀后，于5500g离心10min，去掉上清液；
v)二次水洗
沉淀物再加15mL x N超纯水，玻璃棒搅匀，用10mL x N超纯水冲洗玻璃棒，震荡混合均匀后，于5500g离心10min，去掉上清液；
b)标准品前处理
i)称样
在250mL SCHOTT瓶中称入0.0105g的Sigma G5011标准品，称准至0.0002g；
ii)标准品预溶
加入50mL超纯水预溶；
c)葡萄糖标准曲线制备
吸取葡萄糖标液1、3、5mL到10mL容量瓶中，用超纯水定容到刻度，得到葡萄糖为20、60、100mg/L的混合标样；在色谱条件下准确进样20uL，绘制色谱峰面积和标准物质量浓度之间的标准曲线，得出回归方程；
d)半乳糖标准曲线制备
吸取半乳糖标液1、3、5mL到10mL容量瓶中，用超纯水定容到刻度，得到半乳糖为20、60、100mg/L的混合标样；在色谱条件下准确进样20uL，绘制色谱峰面积和标准物质量浓度之间的标准曲线，得出回归方程；
e)样品及标准品水解
i)样品加酸
将a)中的步骤v)得到的沉淀物转入250mL SCHOTT瓶中，加入12x NmL的37%盐酸，加超纯水至150mL，振荡混匀；
ii)标准品加酸
在b)中的步骤ii)得到的标准品溶液中，加入12mL的37%盐酸，加超纯水至150mL，振荡混匀；
iii)水解
将SCHOTT瓶放入高压灭菌锅121℃处理60min；水解完成后马上冷却，用40%氢氧化钠，将溶液调pH到6-7，然后定容至250mL；
f)在色谱条件下检测葡萄糖、半乳糖含量；
g)结果计算
结果计算采用下式：
其中：
w：称量的牛奶样品，g；
v：样品水解后定容体积，mL；
c葡萄糖：样品水解定容后由HPLC测定得到的葡萄糖含量，g/mL；
c半乳糖：样品水解定容后由HPLC测定得到的半乳糖含量，g/mL；
0.9：葡萄糖换算为葡聚糖的换算因子；
F：葡聚糖水解校正因子；
c葡萄糖-标：标准品水解定容后由HPLC测定得到的葡萄糖含量，g/mL；
V标：标准品水解后定容体积，mL；
W标：标准品称样质量，g；
其中，所述N大于0；
其中所述色谱条件为：
色谱柱：DIONEX CarboPac PA20Analytical Column，3x150mm，
流速：0.35ml/min，
温度：30℃，
流动相：18mM NaOH，
检测器：电化学检测器。
2.权利要求1的方法，其中N的范围为0.01-5。
3.权利要求1的方法，其中N的范围为0.1-2。
4.权利要求1的方法，其中N的范围为0.5-1.2。
5.权利要求1的方法，其中N=1。
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant |