CN102955009B - 一种分析检测婴幼儿配方奶粉中菊粉的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种分析检测婴幼儿配方奶粉中菊粉的方法，(1)采用超滤法去除婴幼儿配方奶粉中的生物大分子；(2)测试婴幼儿配方奶粉中的低聚果糖和总果聚糖的含量：用高效液相色谱法测定并计算奶粉中蔗果三糖的百分含量i₃、蔗果四糖的百分含量i₄、蔗果五糖的百分含量i₅、乳糖的百分含量Las₁和蔗糖的百分含量S₁。用菊粉酶对样品溶液酶解，离心超滤后，用高效液相色谱法测定并计算经酶解的样品中果糖百分含量F_t、葡萄糖百分含量G_t和尚未酶解的残余乳糖的百分含量Las₂；根据公式a换算菊粉的百分含量i₆；其中转换系数k为0.9。本发明的检测方法具有很高的准确性，能够成功检测婴幼儿配方奶粉中菊粉的含量。

Description

一种分析检测婴幼儿配方奶粉中菊粉的方法

技术领域

本发明属于分析化学领域，特别涉及一种分析检测婴幼儿配方奶粉中菊粉的方法。

背景技术

在食品安全检测领域，食品添加剂一直是人们关注的焦点。这是因为食品添加剂通常种类多，并且常常存在使用不规范的问题。近年来，随着人们生活水平的提高，高脂肪、高蛋白、精细食品的大量摄入，“三高”人群越来越多；而膳食纤维在改善营养平衡有独到的功效，因此常作为食品添加剂加入到食品中。菊粉(聚合度为2-60的果聚糖的混合物，通常商品化菊粉中果聚糖的平均聚合度为10-30)作为是一类天然的膳食纤维，几乎存在于所有的植物中，它是除淀粉外植物的另一种能量储存的形式。许多的研究表明，菊粉能降低人和动物的血脂水平、血糖；还能大大提高Ca²⁺、Mg²⁺、Zn²⁺、Cu²⁺、Fe²⁺等矿物质的吸收；促使肠道双歧杆菌增多；防便秘及治疗肥胖症。为此，近期卫生部食品安全综合协调与卫生监督局正式批准：以菊苣为原料，去除蛋白质和矿物质后，经喷雾干燥等步骤获得的菊粉可用于生产各类食品。但是对于这种食品添加剂的使用，也明文规定了使用范围不包括婴幼儿食品。在我国，类似允许添加在婴幼儿食品的主要是低聚果糖(聚合度为2-9之间的果糖聚合物的混合物)。

因此，建立筛查食品中是否含有添加菊粉的分析方法，对应对食品安全突发事件具有十分重要的现实意义。然而，目前关于菊粉的分析方法在国际上主要采用检测果聚糖的方法，主要有两种AOAC方法(或者是这两种方法的改进)，即AOAC 997.08(离子交换色谱法)和AOAC 999.03(分光光度法)。但是其原理都一样的：用菊粉酶将食品中的菊粉(不同聚合度的果聚糖)水解成果糖，测出果糖含量后，再折算菊粉的量。但是，在实际应用中是难于区分低聚果糖和菊粉的，这是因为采用上述的分析方法的实质是检测水解后的果糖，而上述这些果聚糖都可以水解为果糖。目前的现状是尚无实现这种区别的分析方法。

发明内容

本发明所要解决的技术问题就是现有的菊粉分析测试方法无法区分测试婴幼儿奶粉中菊粉与低聚果糖的局限，从而导致测试结果准确率难以提高的缺陷，提供了一种能够不受低聚果糖干扰，检测婴幼儿配方奶粉中菊粉的分析方法。

本发明通过下述技术方案解决上述技术问题：

本发明提供了一种分析检测婴幼儿配方奶粉中菊粉的方法，其包括以下步骤：

(1)采用超滤法去除婴幼儿配方奶粉中的生物大分子，以获得能够直接进行高效液相色谱法分析的样品溶液；

(2)按下述方法测试婴幼儿配方奶粉中的低聚果糖和总果聚糖的含量：

①低聚果糖含量测试：用高效液相色谱法测定步骤(1)的样品溶液中蔗果三糖、蔗果四糖、蔗果五糖、乳糖和蔗糖的浓度，并计算奶粉中蔗果三糖的百分含量i₃、蔗果四糖的百分含量i₄、蔗果五糖的百分含量i₅、乳糖的百分含量Las₁和蔗糖的百分含量S₁；

②总果聚糖含量测试：用菊粉酶对步骤(1)的样品溶液进行酶解处理，离心超滤去除菊粉酶后得到酶解产物样品，所述酶解产物样品作为高效液相色谱分析的样品溶液，用高效液相色谱法测定并计算奶粉中由菊粉酶解产生的果糖的总百分含量F_t、由菊粉酶解产生的葡萄糖百分含量G_t和尚未酶解的残余乳糖的百分含量Las₂；所述菊粉酶的用量为20-100U菊粉酶处理0.14g所述奶粉；上述各含量皆为质量百分含量；

(3)根据下述公式a换算婴幼儿配方奶粉中菊粉的质量百分含量i₆：

$i_6=k[F_t+G_t-\frac{180\×({\mathrm{Las}}_1-{\mathrm{Las}}_2)}{342}-\frac{360S_1}{342}]-i_3-i_4-i_5$ (式a)

其中，转换系数k为0.9。

步骤(1)中，所述的超滤是为了去除婴幼儿配方奶粉中的生物大分子，如蛋白质、脂类等，从而使得超滤后的样品溶液能够进行高效液相色谱的检测。所述超滤法采用本领域超滤法的常规操作，本发明中优选下述步骤：将婴幼儿配方奶粉的水溶液离心，取上清液进行离心超滤；离心超滤后的滤出液即可作为高效液相色谱分析的样品溶液。

步骤(1)中，所述婴幼儿配方奶粉的水溶液通常是将所述婴幼儿配方奶粉溶于水中(优选热水)搅拌得到。所述水的用量较佳地为1g奶粉/5-30ml水。

步骤(1)中，所述离心的转速为本领域的常规转速，较佳地为12000-14000rpm。所述离心的时间较佳地为5-10分钟。所述离心的温度较佳地为4℃。

步骤(1)中，所述离心超滤使用的超滤管，为能够截留生物大分子的各种超滤管，一般选用截留分子量为10KD的超滤管。所述离心超滤的条件以能够获得用于高效液相色谱法测试的样品量为准，一般为在3700g的离心力下离心超滤30min。

发明人经过不断的实验摸索发现用蔗果三糖、蔗果四糖和蔗果五糖的含量之和近似计算低聚果糖的含量即能够具有很高的精确度又能够避免检测所有不同聚合度的低聚果糖含量的繁琐过程。因此，分析检测蔗果三糖、蔗果四糖和蔗果五糖的总含量，可以表示总低聚果糖的含量。步骤①中，测试低聚果糖含量时，所述的高效液相色谱法较佳地采用高效液相色谱-示差折光法进行，其检测条件优选为：柱温检测温度：40℃，流速：1.0ml/min，进样量：20μl，流动相：乙腈∶水＝80∶20(v/v)。所述的高效液相色谱-示差折光法中使用的高效液相色谱仪较佳地为伍丰的国产LC-100高效液相色谱仪，使用的示差折光检测器为伍丰的EX1600RI示差折光检测器，分离柱较佳地为大连依利特Spherisorb NH2氨基柱(5μm＊250mm＊4.6mm)。所述高效液相色谱-示差折光法的具体操作步骤可根据本领域常规方法进行，之后根据蔗果三糖、蔗果四糖和蔗果五糖等所对应的峰面积根据本领域常规手段分别计算其含量。

步骤②中，所述的离心超滤用于去除所述菊粉酶，所述的超滤使用的超滤管为能够截留生物大分子的各种超滤管，一般选用截留分子量为10KD的超滤管。所述超滤的条件一般为在3700g的离心力下离心超滤30min。

步骤②中，所述酶解处理的具体操作步骤为：将所述菊粉酶与所述样品溶液混合，加入醋酸缓冲溶液，在60℃和pH值为4.5的条件下恒温酶解0.5-12小时。其中醋酸在菊粉酶、醋酸缓冲溶液以及样品溶液的混合体系中的浓度较佳地为100mM。

发明人经过大量研究发现，部分市售菊粉酶中含有大量会影响分析测试结果的葡萄糖和果糖。为了获得更精确的分析测试结果，所述的菊粉酶在用于酶解处理前较佳地先进行离心超滤处理，以去除菊粉酶样品中的葡萄糖和果糖。所述的离心超滤优选按下述步骤进行：将菊粉酶用100mM醋酸缓冲液(pH4.5)以3700g的离心力离心超滤3次，每次20分钟，即可。其中，所述离心超滤的超滤管为能够截留生物大分子的各种超滤管，一般选用截留分子量为10KD的超滤管。

步骤②中，测试总果聚糖含量含量时，所述的高效液相色谱法较佳地采用高效液相色谱-示差折光法进行，其检测条件为本领域进行此类检测时的常规条件，本发明中优选下述条件：柱温检测温度：40℃，流速：1.0ml/min，进样量：20μl，流动相：乙腈∶水＝90∶10(v/v)。所述的高效液相色谱-示差折光法中使用的高效液相色谱仪较佳地为伍丰的国产LC-100高效液相色谱仪，使用的示差折光检测器为伍丰的EX1600RI示差折光检测器，分离柱较佳地为大连依利特Spherisorb NH2氨基柱(5μm＊250mm＊4.6mm)。所述高效液相色谱-示差折光法的具体操作步骤可根据本领域常规方法进行，之后根据葡萄糖、果糖、降解残留的乳糖(或蔗糖)等所对应的峰面积根据常规技术手段分别计算其在样品溶液中的浓度和百分含量。

在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。

本发明使用的试剂、原料和设备皆市售可得。

本发明的积极进步效果在于：

本发明首次建立了适合婴幼儿奶粉样品的前处理技术和菊粉含量的分析测定方法。通过本发明的前处理技术对奶粉样品进行合适的酶解处理，从而能够通过高效液相色谱法检测出酶解处理后的样品溶液中的各成分含量，计算总果聚糖的含量；此外，还通过测定总低聚果糖的含量，在奶粉样品中总果聚糖的含量中扣除其百分含量。即通过本发明得到的含量间关系实现对菊粉的检测。本发明的方法具有很高的准确性。

附图说明

图1是实施例1的奶粉中低聚果糖的色谱图。

图2是实施例1的奶粉酶解后果糖、葡萄糖和乳糖的色谱图。

具体实施方式

以下通过具体实施例来进一步说明本发明，但本发明并不受其限制。其中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。本发明中所述的菊粉酶购于Sigma公司(I6285)，酶的浓度为374.6U/ml。

实施例1

(1)婴幼儿配方奶粉样品的超滤处理

秤取2g奶粉于50ml烧杯中，在烧杯中加入10ml 60℃热水，用玻璃棒搅匀。然后，把奶粉溶液用移液枪分别加入1.5ml的离心管离心5分钟(条件是13000转，4℃)。离心结束后将离心管的上清液取出，用截留分子量为10KD超滤管进行超滤(3700g×30min)，超滤结束后取滤出液即可。

(2)低聚果糖的测定方法

1.低聚果糖含量的色谱分析

选取五种浓度的混合标准溶液，每个浓度进样三次，取三次平均值，以响应比对浓度比做线性回归，求算标准曲线。根据该标准曲线，将上述步骤(1)的滤出液直接进行高效液相色谱进样，并根据色谱峰面积计算样品溶液中蔗果三糖、蔗果四糖和蔗果五糖的含量，色谱图见图2，其中1为乳糖，2为蔗果三糖，3为蔗果四糖，4为蔗果五糖。其在溶液中乳糖的浓度C_las1为78.0mg/ml、蔗果三糖的浓度C₃ 0.30mg/ml、蔗果四糖的浓度C₄ 1.42mg/ml和蔗果五糖的浓度C₅ 1.24mg/ml，本实施例中C _S1＝0mg/ml。

色谱条件：

仪器和设备：LC-100高效液相色谱仪和EX1600RI示差折光检测器(上海伍丰科学仪器有限公司)

分离柱：Spherisorb NH2氨基柱(5μm＊250mm＊4.6mm)

柱温及检测温度：40℃；

流速：1.0ml/min；

进样量：20μl；

流动相：乙腈∶水＝80∶20(v/v)

2.计算奶粉样品中低聚果糖聚糖的百分含量。

i₃，i₄和i₅可以按如下公式进行计算：

i₃＝(C₃V)/2000×100％＝0.15％

i₄＝(C₄V)/2000×100％＝0.71％

i₅＝(C₅V)/2000×100％＝0.62％

L_as1＝(C_las1V)/2000×100％＝39％

其中，V为溶解奶粉样品的体积，本实施例中为10ml。

在奶粉样品中总低聚果糖的含量(i₃+i₄+i₅)为1.48％。

(3)总果聚糖含量的测定方法

1.菊粉酶的离心超滤处理：

取1ml菊粉酶溶液，用100mM的醋酸缓冲液(pH4.5)，以3700g超滤洗涤该菊粉酶三次，每次20min。其中超滤使用的超滤管的截留分子量为10KD。超滤完成后，取出洗涤的酶溶液，用醋酸缓冲液调整酶溶液的体积为1ml。之后，可采用该超滤处理的酶进行奶粉样品的酶解处理。

2.奶粉样品的酶解方法

按100U的菊粉酶处理0.665ml步骤(1)的奶粉超滤滤出液。加入配好的1M的醋酸缓冲液(pH4.5)，使加入醋酸缓冲溶液后的混合体系的pH＝4.5，其中醋酸根的终浓度为100mM。在60℃的水浴条件下恒温加热酶解30分钟。酶解后，用截留分子量为10KD的超滤管进行离心超滤(离心力3700g，离心时间30min)，去除菊粉酶，取出滤出液，即为酶解产物样品。

3.测定酶解产物样品中所含的果糖、葡萄糖和乳糖的含量

选取五种浓度的混合标准溶液，每个浓度进样三次，取三次平均值，以响应比对浓度比做线性回归，求算标准曲线。根据该标准曲线，将上述处理的酶解样品直接进样，进行色谱检测并根据峰面积计算其在溶液中的含量，色谱图见图1，其中1为果糖，2为葡萄糖，3为乳糖。

色谱条件如下：

仪器和设备：LC-100高效液相色谱仪和EX1600RI示差折光检测器(上海伍丰科学仪器有限公司)

分离柱：Spherisorb NH2氨基柱(5μm＊250mm＊4.6mm)

柱温及检测温度：40℃；

流速：1.0ml/min；

进样量：20μl；

流动相：乙腈∶水＝90∶10(v/v)

4.计算奶粉样品中总果聚糖的百分含量。

1ml酶解反应溶液中(V₁)中，降解产生的果糖C_F为2.14mg/ml，葡萄糖C_G为5.64mg/ml。酶解液中残留的乳糖的浓度C_las2为41.2mg/ml。

F_t＝(C_FV₁)/133×100％＝1.61％

G_t＝(C_GV₁)/133×100％＝4.24％

Las₂＝(C_las2V₁)/133×100％＝31.0％

转换因子k为0.9；V₁为酶解反应体积，本实施例中为1m。

$i_6=k[F_t+G_t-\frac{180\×({\mathrm{Las}}_1-{\mathrm{Las}}_2)}{342}-\frac{360S_1}{342}]-i_3-i_4-i_5$

根据上述公式计算得奶粉中菊粉含量为i₆＝0.00％。

(4)婴幼儿奶粉样品回收率测定

按每100g奶粉添加1％，2％和3％的菊粉，进行回收率实验测定，其回收率分别为94％，98％和110％。依据3σ计算方法的检出限为0.3％。因此，采用该方法判定该品牌奶粉中不添加菊粉，与产品配方介绍中的记载相一致。

Claims (9)

1.一种分析检测婴幼儿配方奶粉中菊粉的方法，其包括以下步骤：

（1）采用超滤法去除婴幼儿配方奶粉中的生物大分子，以获得能够直接进行高效液相色谱法分析的样品溶液；

（2）按下述方法测试婴幼儿配方奶粉中的低聚果糖和总果聚糖的含量：

①低聚果糖含量测试：用高效液相色谱法测定步骤（1）的样品溶液中蔗果三糖、蔗果四糖、蔗果五糖、乳糖和蔗糖的浓度，并计算奶粉中蔗果三糖的百分含量i₃、蔗果四糖的百分含量i₄、蔗果五糖的百分含量i₅、乳糖的百分含量Las₁和蔗糖的百分含量S₁；

②总果聚糖含量测试：用菊粉酶对步骤（1）的样品溶液进行酶解处理，离心超滤去除菊粉酶后得到酶解产物样品，用高效液相色谱法测定并计算奶粉中由菊粉酶解产生的果糖的总百分含量F_t、葡萄糖的总百分含量G_t以及尚未酶解的残余乳糖的百分含量Las₂；所述菊粉酶的用量为20-100U菊粉酶处理0.14g所述奶粉；上述各含量皆为质量百分含量；

步骤①和②中，所述的高效液相色谱法采用高效液相色谱-示差折光法进行；

步骤①中，所述高效液相色谱-示差折光法的检测条件为：柱温检测温度：40℃，流速：1.0ml/min，进样量：20μl，流动相体积比：乙腈：水=80:20；分离柱为Spherisorb NH2氨基柱；

步骤②中，所述高效液相色谱-示差折光法的检测条件为：柱温检测温度：40℃，流速：1.0ml/min，进样量：20μl，流动相体积比：乙腈：水=90:10；分离柱为Spherisorb NH2氨基柱；

（3）根据下述公式a换算婴幼儿配方奶粉中菊粉的质量百分含量i₆：

$i_6=k[F_t+G_t-\frac{180\×({\mathrm{L\αs}}_1-{\mathrm{L\αs}}_2)}{342}-\frac{360S_1}{342}]-i_3-i_4-i_5$ (式a)

其中，转换系数k为0.9。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（1）中，所述超滤法按下述步骤进行：将所述婴幼儿配方奶粉的水溶液离心，取上清液进行离心超滤。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于：所述婴幼儿配方奶粉的水溶液是将所述婴幼儿配方奶粉溶于热水中搅拌得到。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于：所述水的用量为1g奶粉/5-30ml水。

5.如权利要求2或3所述的方法，其特征在于：步骤（1）中，所述离心的转速为12000-14000rpm，所述离心的时间为5-10分钟，所述离心的温度为4℃；所述离心超滤使用的超滤管的截留分子量为10KD，所述离心超滤的离心力为3700g，所述离心超滤的时间为30分钟。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤②中，在进行离心超滤去除菊粉酶时，所述离心超滤使用的超滤管的截留分子量为10KD，所述离心超滤的条件为在3700g的离心力下离心超滤30分钟。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤②中，所述酶解处理的具体操作步骤为：将所述菊粉酶与步骤（1）所述的样品溶液混合，再与醋酸缓冲溶液，在60℃和pH值为4.5的条件下恒温酶解0.5-12小时。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于：步骤②中，所述醋酸缓冲溶液的用量为使醋酸在菊粉酶、所述醋酸缓冲溶液以及所述样品溶液的混合体系中的浓度为100mM。

9.如权利要求1、6-8中的任一项所述的方法，其特征在于：所述的菊粉酶在用于酶解处理前先进行离心超滤处理，所述的离心超滤按下述步骤进行：将所述菊粉酶用醋酸缓冲液，以3700g的离心力离心超滤3次，每次20分钟，即可；其中所述离心超滤的超滤管的截留分子量为10KD。

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