CN102636608A

CN102636608A - 婴幼儿配方奶米粉中低聚果糖含量的检测方法

Info

Publication number: CN102636608A
Application number: CN2012101045513A
Authority: CN
Inventors: 黄树杰; 林旭彬; 许晓丽
Original assignee: GUANGDONG DONGTAI DAIRY CO Ltd
Current assignee: GUANGDONG DONGTAI DAIRY CO Ltd
Priority date: 2012-04-10
Filing date: 2012-04-10
Publication date: 2012-08-15

Abstract

本发明涉及一种婴幼儿配方奶米粉中低聚果糖含量的检测方法。包括：准确称取样品，置于容量瓶中，加入温水溶解，混匀，超声震荡，冷却至室温；准确加入亚铁氰化钾溶液和乙酸锌溶液，振荡混匀，加水定容、摇匀；静置，滤纸过滤，准确移取上清液至一容量瓶，乙腈定容，振摇混匀；过0.45μm有机滤膜，供HPLC测定，外标法定量；首先，配制标准工作液并分别注入高效液相色谱仪，测定相应的峰面积，绘制标准曲线；然后将制备好的样液注入高效液相色谱仪，测得相应的峰面积，以标准曲线对样品进行定量，测得样液浓度；再由公式可计算出低聚果糖含量的百分含量，具有方便、快捷、准确等优点。

Description

婴幼儿配方奶米粉中低聚果糖含量的检测方法

技术领域

本发明涉及一种婴幼儿配方奶米粉中低聚果糖含量的检测方法。

背景技术

低聚果糖是一种天然活性物质，又称蔗果低聚糖，是由1～3个果糖基通过β(2—1)糖苷键与蔗糖中的果糖基结合生成的蔗果三糖、蔗果四糖和蔗果五糖等的混合物。它能明显改善肠道内微生物种群比例，对肠道中的有益菌群（如双岐杆菌、乳酸杆菌等）有选择性增殖作用。可抑制有害细菌生长、减少肠内有毒物质的形成和积累，促进肠道蠕动，有效防止便秘、腹泻和病变肠癌的发生。同时低聚果糖在大肠内被细菌发酵生成L－乳酸，可以有效溶解钙、镁、铁等多种矿物质，促进人体对矿物质的吸收。

如今低聚果糖已被广泛应用于婴幼儿营养食品中，而目前国标中仅有针对原料低聚果糖的检测方法（即GB/T 23528-2009）。此法在样品处理上非常简单，直接以超纯水溶解定容，这对于基质较为复杂的婴幼儿配方奶米粉并不适用。因此，开发出婴幼儿配方奶米粉中低聚果糖的含量测定方法，对调配出最适于婴幼儿成长所需的低聚果糖营养食品有着重要意义。本发明采用超声提取，亚铁氰化钾与乙酸锌沉淀蛋白，将样品中的低聚果糖充分提取出来，同时最大限度地减少蛋白质等杂峰的影响。

发明内容

本发明的目的在于开发一种婴幼儿配方奶米粉中低聚果糖含量的检测方法，从而方便、快捷、准确地检测出婴幼儿配方奶米粉中低聚果糖的含量。

本发明的原理：试样中的低聚果糖经提取、沉淀蛋白后，取一定量的上清液，加入等量纯乙腈，涡旋混匀。样液经氨基柱分离、示差检测器检测，外标法定量。

本发明包括如下步骤：

（1）试剂

（a）乙腈：色谱纯；

（b）亚铁氰化钾：分析纯；

（c）乙酸锌：分析纯；

（d）低聚果糖标准品及纯度：蔗果三糖：100.0%，蔗果四糖：99.2%，蔗果五糖：94.8%；

（e）15%亚铁氰化钾：称取15.0g亚铁氰化钾，用水溶解并定容至100mL；

（f）30%乙酸锌：称取30.0g乙酸锌，用水溶解并定容至100mL；

（g）标准储备液（10mg/mL）：准确称取100.0mg蔗果三糖、100.8mg（以纯度99.2% 折算所得）蔗果四糖、105.5mg（以纯度94.8%折算所得）蔗果五糖，置于一10mL容量瓶，加5mL水溶解，乙腈定容至刻度；

（h）标准系列工作液：以1:1的乙腈—水将标准储备液分别稀释成0.2mg/mL、0.4mg/mL、0.6mg/mL、0.8mg/mL、1.0mg/mL；

（i）水:超纯水；

（2）仪器设备

（a）高效液相色谱仪：岛津 LC-20AD泵，RID-10A示差折光检测器；

（b）电子天平：精确至0.0001g；

（c）超声波提取器；

（d）涡旋混合器；

（3）分析步骤

（a）样品处理

准确称取2.5g样品（精确至0.0001g), 置于50mL棕色容量瓶中，加入约30mL温水（45-50℃）溶解，充分混匀，超声15min，冷却至室温，准确加入1.0mL15%亚铁氰化钾和1.0mL30%乙酸锌，振荡混匀，加水定容至刻度、摇匀，静置10-15min，滤纸过滤，弃去初滤液，准确移取上清液5.0mL至一10mL容量瓶，乙腈定容至刻度，振摇混匀，过0.45μm有机滤膜，供HPLC测定，外标法定量；

（b）色谱条件

色谱柱：氨基柱（250 mm×4.6mm,5μm）；

流动相：乙腈-水=73-27；

流速：1.5 mL/min；

柱温：30℃；

示差折光检测器温度：30℃；

进样量：10μL；

（c）定量分析

标准曲线绘制：将标准系列工作液分别注入高效液相色谱仪，测定相应的峰面积，以峰面积为横坐标，标准工作液浓度为纵坐标绘制标准曲线；

试液测定：将制备好的样液注入高效液相色谱仪，测得相应的峰面积，以标准曲线对样品进行定量，测得样液浓度；

（d）计算

试样中各组分包括蔗果三糖、蔗果四糖和蔗果五糖的百分含量：

X_i＝[(C×10×50)/(M×5×1000)]×100%；

式中：

C—样液的进样浓度(从标准曲线获取)，单位为mg/mL；

50—第一次定容体积，单位为mL；

10—第二次定容体积，单位为mL；

5—上清液体积，单位为mL；

M—试样的质量，单位为g；

X_i分别为X_蔗果三糖、X_蔗果四糖和X_蔗果五糖；

样品中低聚果糖的百分含量：X_低聚果糖=X_蔗果三糖+X_蔗果四糖+X_蔗果五糖。

本发明具有如下优点：

(1)本发明采用超声提取，亚铁氰化钾与乙酸锌沉淀蛋白，将样品中的低聚果糖充分提取出来，同时最大限度地减少蛋白质等杂峰的影响；

(2)糖类物质的保留能力随乙腈比例的增大而增强，当流动相（乙腈—水）中乙腈比例为70%时，低聚果糖中各组分分离度较差；当乙腈比例达到75%时，各组分虽能达到很好的分离度，但分析时间长达18分钟。故本方法采用73：27的乙腈—水作为流动相，既保证了低聚果糖中各组分的分离度，又提高了分析效率（分析时间为10分钟）；

(3)本方法经多次试验，各项指标均合格稳定，且定量精准可靠，方便快捷。其精密度、回收率满足高效液相色谱分析法可行性验证指标要求。

附图说明

图1为低聚果糖标准溶液色谱图。图中：蔗果三糖：保留时间5.424min，浓度0.208mg/mL；蔗果四糖：保留时间6.707min，浓度0.208mg/mL；蔗果五糖：保留时间8.327min，浓度0.204mg/mL；

图2为含低聚果糖的配方奶米粉样品溶液色谱图。图中：蔗果三糖：保留时间5.428min，浓度0.243mg/mL；蔗果四糖：保留时间6.701min，浓度0.258mg/mL；蔗果五糖：保留时间8.322min，浓度0.046mg/mL；

图3-图4为HPLC系统连续进样重现性色谱图。其中：图3为不同浓度的低聚果糖标样保留时间重现性色谱图，保留时间如下表所示。图4为同一样液两次进样重现性色谱图；

Figure 2012101045513100002DEST_PATH_IMAGE003

图5-图7为低聚果糖标准曲线图。其中：图5为蔗果三糖标准曲线图；图6为蔗果四糖标准曲线图；图7为蔗果五糖标准曲线图。图中，不同浓度对应的峰面积如下表所示：

具体实施方式

一种婴幼儿配方奶米粉中低聚果糖含量的检测方法，包括如下步骤：

（1）试剂

（a）乙腈：色谱纯；

（b）亚铁氰化钾：分析纯；

（c）乙酸锌：分析纯；

（f）30%乙酸锌：称取30.0g乙酸锌，用水溶解并定容至100mL；

（i）水:超纯水；

（2）仪器设备

（b）电子天平：精确至0.0001g；

（c）超声波提取器；

（d）涡旋混合器；

（3）分析步骤

（a）色谱条件

色谱柱：氨基柱（250 mm×4.6mm,5μm）；

流动相：乙腈-水=73-27；

流速：1.5 mL/min；

柱温：30℃；

示差折光检测器温度：30℃；

进样量：10μL；

（d）样品处理

平行称取同一配方奶米粉样品四份，各2.5g（精确至0.0001 g), 分别置于50mL棕色容量瓶中。前两份(样品一、样品二)直接加入30mL温水（45—50℃）溶解，后两份（样品三、样品四）分别加入蔗果三糖（纯度100%）14.4mg、蔗果四糖(纯度99.2% )19.6mg和蔗果五糖（纯度94.8%）3.8mg，再分别加入30mL温水（45—50℃）溶解。将四份样液分别混匀，超声15min，冷却至室温。准确加入1.0mL15%亚铁氰化钾与1.0mL30%乙酸锌，振荡混匀，加水定容至刻度、摇匀。静置10-15min，滤纸过滤，弃去初滤液。准确移取上清液5.0mL至一10mL容量瓶，乙腈定容至刻度，振摇混匀。过0.45um有机滤膜。供HPLC测定，外标法定量；

（c）定量分析

标准曲线绘制：将标准系列工作液分别注入高效液相色谱仪，测定相应的峰面积，以峰面积为横坐标，标准工作液浓度为纵坐标绘制标准曲线(如图5-图7所示)；

（d）计算

X_i＝[(C×10×50)/(M×5×1000)]×100%；

式中：

C—样液的进样浓度(从标准曲线获取)，单位为mg/mL；

50—第一次定容体积，单位为mL；

10—第二次定容体积，单位为mL；

5—上清液体积，单位为mL；

M—试样的质量，单位为g；

X_i分别为X_蔗果三糖、X_蔗果四糖和X_蔗果五糖；

样品中低聚果糖的百分含量：

X_低聚果糖=X_蔗果三糖+X_蔗果四糖+X_蔗果五糖；

（e）样品测定及计算结果如下：

精密度测定及计算：

Figure 2012101045513100002DEST_PATH_IMAGE005

上表中，“浓度”系将制备好的样液注入高效液相色谱仪，测得相应的峰面积，以标准曲线对样品进行定量，测得相应的浓度；“含量”由以上计算公式计算所得；

精密度（%）=（|w_1—w₂|/w_平）×100% ；

　 w_平= (w₁+w₂)/2；

式中： w_平为样品一与样品二含量的平均值，%；

w₁为样品一的含量，%；

w₂为样品二的含量，%；

回收率的测定及计算：

上表中：本底值=M×w_平×1000；

实测值=C×10×50/5；

回收率(%)=（实测值-本底值）/添加量×100%；

式中：C为样液的进样浓度(从标准曲线获取)，单位为mg/mL；

本底值指2.5g样品中本身含有的低聚果糖或其各组分的量，单位为mg；

实测值指2.5g样品加标后测得的低聚果糖或其各组分的量，单位为mg；

（f）结论：本方法经多次试验，各项指标均合格稳定，且定量精准可靠，方便快捷。其精密度、回收率满足高效液相色谱分析法可行性验证指标要求（高效液相色谱分析法可行性验证指标：标准曲线线性相关系数R²≥0.999，精密度≤10%，回收率为80—120%）。

Claims

1.一种婴幼儿配方奶米粉中低聚果糖的含量测定方法，其特征在于包括如下步骤：

（1）试剂

（a）乙腈：色谱纯；

（b）亚铁氰化钾：分析纯；

（c）乙酸锌：分析纯；

（d）低聚果糖标准品及纯度：蔗果三糖：100.0%；蔗果四糖：99.2%；蔗果五糖：94.8%；

（f）30%乙酸锌：称取30.0g乙酸锌，用水溶解并定容至100mL；

（g）标准储备液，10mg/mL：准确称取100.0mg蔗果三糖、100.8mg蔗果四糖、105.5mg蔗果五糖，置于一10mL容量瓶，加5mL水溶解，乙腈定容至刻度；

（i）水:超纯水；

（2）仪器设备

（b）电子天平：精确至0.0001g；

（c）超声波提取器；

（d）涡旋混合器；

（3）分析步骤

（a）样品处理：

准确称取2.5g样品，精确至0.0001g, 置于50mL棕色容量瓶中，加入30mL温水溶解，水温为45-50℃，充分混匀，超声15min，冷却至室温；准确加入1.0mL15%亚铁氰化钾和1.0mL30%乙酸锌，振荡混匀，加水定容至刻度、摇匀；静置10-15min，滤纸过滤，弃去初滤液，准确移取上清液5.0mL至一10mL容量瓶，乙腈定容至刻度，振摇混匀；过0.45μm有机滤膜，供HPLC测定，外标法定量；

（b）色谱条件：

色谱柱：氨基柱，250 mm×4.6mm,5μm；

流动相：乙腈-水=73-27；

流速：1.5 mL/min；

柱温：30℃；

示差折光检测器温度：30℃；

进样量：10μL；

（c）定量分析：

（d）计算：

试样中各组分包括蔗果三糖、蔗果四糖和蔗果五糖的百分含量为：

X_i＝[(C×10×50)/(M×5×1000)]×100%；

式中：

C—样液的进样浓度，从标准曲线获取，单位为mg/mL；

50—第一次定容体积，单位为mL；

10—第二次定容体积，单位为mL；

5—上清液体积，单位为mL；

M—试样的质量，单位为g；

X_i分别为X_蔗果三糖、X_蔗果四糖和X_蔗果五糖；

样品中低聚果糖的百分含量：

X_低聚果糖=X_蔗果三糖+X_蔗果四糖+X_蔗果五糖。