CN109613138A

CN109613138A - 一种利用pmp-hplc-内标标准曲线法同时测定太子参中葡萄糖和半乳糖含量的方法

Info

Publication number: CN109613138A
Application number: CN201811627934.2A
Authority: CN
Inventors: 胡娟; 林胜男; 吴丹; 庞文生; 林巧美; 刘思延; 王林莉
Original assignee: Fujian University of Traditional Chinese Medicine
Current assignee: Fujian University of Traditional Chinese Medicine
Priority date: 2018-12-28
Filing date: 2018-12-28
Publication date: 2019-04-12

Abstract

本发明公开了一种同时测定太子参中葡萄糖和半乳糖含量的方法，其是采用高温强酸将太子参多糖水解为单糖，然后以PMP（1‑苯基‑3‑甲基‑5‑吡唑啉酮）作为衍生化试剂，在碱性条件下与单糖缩合生成单糖‑PMP衍生物，再通过HPLC测定衍生化后的产物，以获得单糖的含量。本发明高效液相色谱结合内标‑标准曲线法的重现性、稳定性、加样回收率均符合药典规定，可用于中药材太子参的质量控制。

Description

一种利用PMP-HPLC-内标标准曲线法同时测定太子参中葡萄糖和半乳糖含量的方法

技术领域

本发明属于中药材分析技术领域，具体涉及一种利用PMP-HPLC-内标标准曲线法同时测定太子参中葡萄糖和半乳糖含量的方法。

背景技术

太子参为石竹科植物孩儿参Pseudostellaria heterophylla （Miq.）Pax ex Paxet Hoffm.的干燥块根，为我国传统中药，其味甘、微苦，平，归脾、肺经，具有益气健脾，生津润肺之功效，用于脾虚体倦，食欲不振，病后虚弱，气阴不足，自汗口渴，肺燥干咳。

太子参中含有丰富的多糖。国内外研究表明，太子参多糖具有降低血糖、血脂、改善胰岛素抵抗及心肌保护、增加免疫功能等作用，是太子参主要有效成分之一。而多糖的单糖组成分析是进行多糖质量控制和获取多糖基本信息的重要环节。目前有关太子参多糖含量测定的研究很多，对多糖进行检测的方法主要有分光光度法、高效液相-蒸发光散射法、酶联免疫法、电化学法等，但对于单糖的组成测定迄今少见报道。

标准曲线法（外标法）是一种简便、快速的定量方法，其优点是绘制好标准工作曲线后测定工作就变得相当简单，可直接从标准工作曲线上读出含量，因此特别适合于大量样品的分析；缺点是每次样品分析的色谱条件（检测器的响应性能，柱温，流动相流速及组成，进样量，柱效等）很难完全相同，因此容易出现较大误差。此外，标准工作曲线绘制时，一般使用欲测组分的对照品，而实际样品的组成却千差万别，因此必将给测量带来一定的误差。内标法是一种间接或相对的校准方法。在分析测定样品中某组分含量时，加入一种内标物质以校准和消除出于操作条件的波动而对分析结果产生的影响，可提高分析结果的准确度。

发明内容

本发明的目的在于提供一种同时测定太子参中葡萄糖和半乳糖含量的方法，其可为完善中药太子参的质量标准奠定基础。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种同时测定太子参中葡萄糖和半乳糖含量的方法，其包括如下步骤：

1）系列标准溶液的配制：精密称定对照品半乳糖及葡萄糖于容量瓶中，加水溶解并定容，得混合对照品母液；然后准确量取不同体积的混合对照品母液于容量瓶中，并分别加入一定量的盐酸氨基葡萄糖内标物，加水定容至刻度，得系列标准溶液；

2）柱前衍生化：准确吸取步骤2）制备的系列标准溶液，按体积比1:1:1加入0.3 mol/L的NaOH溶液、0.5 mol/L的PMP甲醇溶液混匀，于70 ℃水浴反应1.5 h后冷却至室温，然后加入0.3 mol/L的HCl溶液进行中和，加入氯仿重复萃取2次后，取水相进行HPLC分析；

3）标准曲线的绘制：以葡萄糖和半乳糖浓度为横坐标，葡萄糖、半乳糖与内标物盐酸氨基葡萄糖的峰面积比值为纵坐标，分别绘制葡萄糖和半乳糖的标准曲线，并计算两种单糖的线性回归方程；

4）样品提取：将待测太子参样品粉碎，过三号筛，按料液比1:500 g/mL加入80vol%的乙醇溶液，于90 ℃索氏提取2 h，然后弃去提取液，所得药渣挥干溶剂后，按料液比1:250 g/mL加入水并称重，然后于100 ℃水浴回流提取2 h，放冷后加水补足重量，经离心，取上清液备用；

5）多糖水解：准确吸取步骤4）所得上清液1mL，准确加入3.0mol/L的盐酸溶液0.5 mL，混匀，于110 ℃水解1 h，放冷后用3.0mol/L的氢氧化钠溶液调节水解液的pH值至中性，再加入一定量的盐酸氨基葡萄糖内标物，混匀，制得样品溶液；

6）样品的检测：将步骤5）所得样品溶液按步骤2）所述方法柱前衍生化后进行HPLC分析，再根据所得葡萄糖、半乳糖与内标物盐酸氨基葡萄糖的峰面积比值，利用线性回归方程，计算待测太子参样品中葡萄糖和半乳糖的含量。

所述HPLC分析的色谱条件为：采用Hypersil ODS色谱柱，规格为4.6 mm×250 mm、5μm，进样量20 μL，检测波长250 nm，柱温30℃，流速1.0 mL/min，流动相A为15vol%乙腈+50mmol/L磷酸缓冲液，流动相B为40vol%乙腈+50 mmol/L磷酸缓冲液，梯度洗脱程序为：0-15min，流动相A体积由100%降低到80%，15-35min，流动相A体积由80%降低到50%，35-38min，流动相A体积由50%提升到100%，38-45min，流动相A体积维持在100%。

本发明的显著优点在于：

（1）在本发明的色谱分离条件（流动相梯度洗脱程序）下，单糖的吡唑啉酮衍生物和吡唑啉酮能被良好地分离；

（2）PMP（1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮）柱前衍生-HPLC-内标法应用，可以消除出于操作条件的波动、太子参样品基质干扰而对分析结果产生的影响，以提高分析结果的准确度，方法的重现性、稳定性、加样回收率均符合药典规定；

（3）太子参中葡萄糖和半乳糖单糖含量的同时测定未见报道。

附图说明

图1为混合标准溶液（葡萄糖0.4 mg/mL、半乳糖0.08 mg/mL、盐酸氨基葡萄糖0.5mg/mL）的HPLC色谱图。

图2为葡萄糖和内标物盐酸氨基葡萄糖峰面积比值的线性关系图。

图3为半乳糖和内标物盐酸氨基葡萄糖峰面积比值的线性关系图。

图4为未加内标物的太子参样品的HPLC色谱图。

图5为加入内标物的太子参样品的HPLC色谱图。

具体实施方式

为了使本发明所述的内容更加便于理解，下面结合具体实施方式对本发明所述的技术方案做进一步的说明，但是本发明不仅限于此。

1.内标-标准曲线绘制

1.1 混合对照品溶液的配制

精密称定半乳糖对照品20.00 mg、葡萄糖对照品10.00 mg，加超纯水溶解定容至同一个10 mL容量瓶中，摇匀，得半乳糖浓度为2.00 mg/mL、葡萄糖浓度为10.00 mg/mL的混合对照品溶液，作为标准母液；

1.2 内标物溶液的配制

精密称定盐酸氨基葡萄糖25.00 mg，加超纯水溶解定容至10 mL容量瓶中，摇匀，得盐酸氨基葡萄糖浓度为2.00 mg/mL的内标物溶液。

1.3 系列标准溶液的配制

准确量取混合对照品溶液0.1、0.2、0.5、1.0、1.5mL，置于5mL容量瓶中，准确加入2.00mg/mL内标物溶液1.0 mL，加超纯水定容至刻度，配制成内标物浓度为0.50 mg/mL，半乳糖浓度分别为0.04、0.08、0.20、0.40、0.60 mg/mL，葡萄糖浓度为0.20、0.40、1.00、2.00、3.00mg/mL的系列标准溶液。

1.4 PMP柱前衍生化

准确吸取各标准溶液400 μL，分别加入400 μL的0.3 mol/L NaOH溶液和0.5 mol/LPMP甲醇溶液，混匀，70 ℃水浴反应1.5 h；取出，冷却至室温，加入0.3 mol/L HCl溶液500 μL进行中和，然后加入2 mL氯仿，振摇，离心，弃去氯仿相，重复萃取2次，取水相用0.45 μm微孔滤膜过滤，备用，供HPLC分析。

1.5 色谱流动相与梯度洗脱程序

大连依利特C18色谱柱（Hypersil ODS，4.6 mm×250 mm，5μm），进样量20 μL，检测波长250 nm，柱温30℃，流速1.0 mL/min；流动相A：15%（v/v）乙腈+50 mmol/L磷酸缓冲液（KH₂PO₄-NaOH，pH 6.0），流动相B：40%（v/v）乙腈+50 mmol/L磷酸缓冲液（KH₂PO₄-NaOH，pH6.0）；梯度洗脱程序见表1。

表1 梯度洗脱程序

1.6 标准品色谱分析

按1.5项下色谱条件进行HPLC分析并记录色谱峰面积，葡萄糖、半乳糖、内标盐酸氨基葡萄糖对照品的保留时间分别为29.50min、30.56min、20.94min。

1.7 线性关系考察结果

分别以葡萄糖和半乳糖浓度为横坐标，葡萄糖和半乳糖与内标物盐酸氨基葡萄糖的峰面积比值为纵坐标，绘制葡萄糖和半乳糖的标准曲线。葡萄糖与内标物峰面积比值线性关系如图2，半乳糖与内标物峰面积比值线性关系如图3。

葡萄糖的回归方程为Y=2.1463X+0.0432，其相关系数R为0.99995，线性范围为0.2023~3.0345 mg/mL；半乳糖的回归方程为Y=2.5512 X+0.0028，其相关系数R为0.99980，线性范围为0.0401~0.6012 mg/mL。结果表明葡萄糖或半乳糖的浓度（C）与其峰面积和内标物峰面积比值（Ap/As）呈良好的线性关系。

2.方法学验证

2.1 精密度试验

同一供试品溶液重复进样6次，葡萄糖和半乳糖含量的RSD分别为0.17%、1.12%，表明仪器精密度良好。

2.2 重复性试验

取同一批样品，按供试品溶液制备方法平行制备6份，分别进样分析，葡萄糖和半乳糖含量的RSD分别为2.91%、3.36%，表明该方法重复性好。

2.3 稳定性试验

同一供试品分别在0、6、12、18、24、48小时进样，葡萄糖和半乳糖含量的RSD分别为0.11%、0.44%，表明供试品溶液在48小时内稳定。

2.4 回收率试验

按照上述液相色谱条件，将一定量的标准溶液加入已知含量的样品溶液中，测定3种成分含量。葡萄糖和半乳糖回收率分别为102.78~104.53%、96.70~100.35%，RSD平均值分别为0.60%、3.59%，表明该方法准确度良好。

3.样品检测

3.1 供试品制备

精密称取太子参（粉碎过三号筛）0.2000 g，置于索氏提取器中，加入80vol%乙醇溶液100 mL，90 ℃加热2 h后弃去乙醇液，将药渣挥干溶剂后置于150 mL圆底烧瓶中，加水50mL，称重，置于100 ℃水浴加热回流提取2 h，放冷后加水补足重量，混匀，离心（转速为每分钟4000转），取上清液备用。

3.2 多糖的盐酸水解

准确吸取上述所得上清液1 mL，置于4 mL储液瓶中，准确加入3.0mol/L的盐酸溶液0.5mL，封口，混匀，于110 ℃烘箱中水解1 h；放冷，加入3.0mol/L的氢氧化钠溶液0.5 mL以调节pH值至中性。加入100.09 mg/mL的盐酸氨基葡萄糖10 μL，混匀，以制得内标物含量为0.5005 mg/mL的样品溶液。

3.3 PMP柱前衍生化

准确吸取上述样品溶液400 μL，加入400 μL的0.3 mol/L NaOH溶液和0.5 mol/L PMP甲醇溶液，混匀，70 ℃水浴反应1.5 h；取出，冷却至室温，加入0.3 mol/L HCl溶液500 μL进行中和，然后加入2 mL氯仿，振摇，离心(转速为每分钟4000转），弃去氯仿相，重复萃取2次，取水相用0.45 μm微孔滤膜过滤，备用，供HPLC分析。

3.4. 样品分析与结果计算

福建、贵州两个主产区相同采收期的各15个批次太子参将样品溶液按1.5项下色谱条件进行HPLC分析（见图4、图5），并记录色谱峰面积，然后将葡萄糖和半乳糖分别与内标物盐酸氨基葡萄糖峰面积的比值代入回归方程计算太子参中葡萄糖和半乳糖的含量，结果见表2、表3。

X=(C×V×f×10^-3)/m，

式中：

X-太子参单糖含量，单位为克每100克（g/100g）；

C-根据标准曲线回归方程算出太子参单糖的含量，单位为微克每毫升（μg/mL）；

f-溶液的稀释倍数；

V-样品的提取溶剂体积，单位为毫升（mL）；

m-样品的取样量，单位为克（g）。

表2 福建太子参中葡萄糖含量

表3 福建太子参中半乳糖含量

表4 贵州太子参中葡萄糖含量

表5 贵州太子参中半乳糖含量

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

Claims

1.一种同时测定太子参中葡萄糖和半乳糖含量的方法，其特征在于：包括如下步骤：

1）系列标准溶液的配制：精密称定对照品半乳糖及葡萄糖于容量瓶中，加水溶解并定容，得混合对照品母液；准确量取不同体积的混合对照品母液于容量瓶中，分别加入一定量的盐酸氨基葡萄糖内标物，加水定容至刻度，得系列标准溶液；

2）柱前衍生化：准确吸取步骤1）制备的系列标准溶液，按体积比1:1:1加入0.3 mol/L的NaOH溶液、0.5 mol/L的PMP甲醇溶液混匀，于70 ℃水浴反应1.5 h后冷却至室温，然后加入0.3 mol/L的HCl溶液进行中和，加入氯仿重复萃取2次后，取水相进行HPLC分析；

2. 根据权利要求1所述的同时测定太子参中葡萄糖和半乳糖含量的方法，其特征在于：所述HPLC分析的色谱条件为：采用Hypersil ODS色谱柱，规格为4.6 mm×250 mm、5μm，进样量20 μL，检测波长250 nm，柱温30℃，流速1.0 mL/min，流动相A为15vol%乙腈+50mmol/L磷酸缓冲液，流动相B为40vol%乙腈+50 mmol/L磷酸缓冲液，梯度洗脱程序为：0-15min，流动相A体积由100%降低到80%，15-35min，流动相A体积由80%降低到50%，35-38min，流动相A体积由50%提升到100%，38-45min，流动相A体积维持在100%。