CN102283879B

CN102283879B - 一种苦碟子注射液的制备方法

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Publication number: CN102283879B
Application number: CN2011102021668A
Authority: CN
Inventors: 陈玉香; 王学东
Original assignee: SHUANGDING PHARMACEUTICAL CO Ltd SHENYANG
Current assignee: Shuangding Pharmaceutical Co., Ltd, Shenyang
Priority date: 2011-07-19
Filing date: 2011-07-19
Publication date: 2013-11-13
Anticipated expiration: 2031-07-19
Also published as: CN102283879A

Abstract

一种苦碟子注射液的制备方法和质量控制方法。一种苦碟子注射液的制备方法，是用抱茎苦荬菜水煎煮液，用10%氧化钙调pH值至10，取离心沉淀物称重，悬浮于95%乙醇中，加硫酸溶液调pH值至3-4，反应后滤液用氢氧化钠中和pH至7，滤液回收乙醇，挥去乙醇，用注射用水稀释至1ml相当于原生药10g，-5度以下静置24小时，过滤，取苦碟子浓缩液，用30KD分子量超滤膜过滤，滤液用水稀释至规定量，调pH值至7.0-7.5，灭菌，即得。采用本发明方法制备的苦碟子注射液有效成分保留率高，稳定性好，工艺成本低，适于工业化生产。

Description

一种苦碟子注射液的制备方法

技术领域

本发明涉及一种中药提取物的制备方法和质量控制方法及其制药用途，特别涉及一种苦碟子注射液的制备方法和质量控制方法。

背景技术

苦碟子为菊科苦荬菜属抱茎苦荬菜[Ixeris sonchifolia (Bge)Hance] 的两年生干燥地上部分，主产于我国东北、华北等地。《卫生部药品标准内蒙古分册》记载，抱茎苦荬菜味苦、辛，锐、凉，具开胃，解毒，接骨，去痞作用，用于不思饮食，解毒，骨折，牙痛。民间主要用于治疗阑尾炎、扁桃体炎、无名肿痛等症。

对苦碟子药材及制剂的研究近几年有了很大的发展，据文献报道抱茎苦荬菜含有黄酮、腺苷、内酯等化学成分。药理研究表明黄酮类成分是其中的主要活性成分类别之一，化学研究表明抱茎苦荬菜黄酮类成分以木犀草素－7-O-β-D－葡萄糖醛酸苷、木犀草素7-O-β-D-葡萄糖苷、芹菜素7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、芹菜素7-O-β-D-葡萄糖苷以及其他数种黄酮类成分含量较高。

发明内容

本发明的目的，在于公开一种苦碟子注射液的制备方法；

本发明的另一目的，在于公开一种苦碟子注射液的质量控制方法。

采用的技术方案是：

一种苦碟子注射液的制备方法，其特征在于该方法为：

取抱茎苦荬菜，加水煎煮二次，第一次1小时，第二次0.5小时，合并煎液，浓缩至每1ml相当于原生药0.5g，放冷至40℃以下，在搅拌下加10%氧化钙乳调节pH值至10，放置12-24小时，离心，离心沉淀物称重，悬浮于适量95%乙醇中（使含醇量达80%），加50%硫酸溶液调节pH值至3～4，充分搅拌使反应完全，离心或过滤，离心液或过滤液加40%氢氧化钠溶液中和pH值至7，离心或滤过，滤液回收乙醇，并挥尽乙醇，用注射用水稀释至每1ml相当于原生药10g，置-5℃以下放置12-24小时，滤过，滤液加0.1～0.2%药用活性炭粉末，煮沸15分钟，置-5℃以下放置达24-48小时，滤过，滤液121 ℃加热45分钟，得苦碟子浓缩液，置-5℃以下放置。取苦碟子浓缩液，滤过，用30KD分子量超滤膜超滤，滤液加注射用水稀释至规定量，调节pH值至7.0～7.5，用10KD分子量超滤膜超滤，后用微孔滤膜（孔径0.22μm）滤过，灌封，在115 ℃灭菌35分钟，即得苦碟子注射液；

通过本发明方法制得的苦碟子注射液中每10ml含总黄铜以无水芦丁（C₂₇H₃₀O₁₆）计为4.0-15.0mg；每10ml含抱茎苦荬菜以腺苷（C₁₀H₁₂N₅O₄）计含量不少于0.025mg；每1ml含木犀草素7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷含量不得少于0.010mg，含菊苣酸不得少于0.010mg。

一种苦碟子注射液的质量控制方法，其特征在于该方法中包含如下测定步骤：

1、总黄酮对照品溶液的制备：精密称取芦丁对照品适量，加60%乙醇制成每1ml含0.1mg的溶液（必要时，可置80℃水浴中加热，使溶解），即得；

供试品溶液的制备精密量取装置差异项下的本品10ml，置50ml量瓶中，加60%乙醇稀释至刻度，摇匀，即得；

测定法精密吸取对照品溶液与供试品溶液各5ml，分别置10ml量瓶中，各加入5%亚硝酸钠溶液0.3ml，摇匀，放置6分钟。分别加入10%硝酸铝溶液0.3ml，摇匀，放置6分钟，再加入1mol/L氢氧化钠溶液4ml，用60%乙醇稀释至刻度，摇匀，放置10分钟。同时取供试品溶液5ml，加60%乙醇稀释至10ml，作为空白。照分光光度法（中国药典2010年版一部附录Ⅴ B），在505nm波长处测定吸收度，减去校正，计算，即得。

本品每10ml含总黄酮以无水芦丁（C₂₇H₃₀O₁₆）计，应为4.0mg-15.0mg。

2、腺苷照高效液相色谱法（中国药典2010年版一部附录Ⅵ D）测定。

色谱条件与系统适用性试验用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；乙腈-水（6:94）为流动相；检测波长为260nm。理论板数按腺苷峰计算应不低于5000。

对照品溶液的制备精密称取腺苷对照品适量，加10%甲醇制成每1ml含35μg的溶液，即得。

供试品溶液的制备取本品6支，内容物混匀，精密吸取25ml，置分液漏斗中，加三氯甲烷振摇提取2次，每次10ml，弃去三氯甲烷液，将水溶液蒸干，残渣加10%甲醇使溶解，定量转移至5ml量瓶中，加10%甲醇稀释至刻度，摇匀，用微孔滤膜（0.45μm）滤过，即得。

测定法分别精密吸取对照品溶液10μl与供试品溶液10～15μl，注入液相色谱仪，测定，即得。

本品每10ml含抱茎苦荬菜以腺苷（C₁₀H₁₂N₅O₄）计，不得少于0.025mg。

3、木犀草素7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷和菊苣酸照高效液相色谱法（中国药典2010年版一部附录Ⅵ D）测定。

色谱条件与系统适用性试验用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；乙腈－0.4％磷酸溶液（ml/ml）（16：84）为流动相；检测波长为327nm。理论板数按木犀草素7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷峰计算应不低于5000。

对照品溶液的制备取木犀草素7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、菊苣酸对照品适量，分别加甲醇制成毎1ml含木犀草素7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷0.1mg，含菊苣酸0.05mg的溶液，即得。

供试品溶液的制备取本品适量，用0.45μm滤膜滤过，即得。

测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各5μl，注入液相色谱仪，测定，即得。

本品每ml含木犀草素7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷不得少于0.010mg，含菊苣酸不得少于0.010mg。

4、指纹图谱

色谱条件色谱柱Phenomenex Luna C18 4.6mm×250mm 5μ;流动相A为乙腈，B为0.4％磷酸溶液（ml/ml）,按表1 程序进行梯度洗脱，流速0.9ml/min;检测波长为327nm;柱温40℃。

表1 梯度洗脱程序

参照物溶液的制备取菊苣酸对照品适量，加50%甲醇制成每1ml含0.05mg的溶液，即得。

标准提取物溶液的制备取本品约0.1g，置25ml量瓶中，加50%甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。

供试品溶液的制备取本品适量，用0.45μm滤膜滤过，即得。

测定法精密吸取上述叁种溶液，注入高效液相色谱仪，记录90分钟内的色谱图。供试品液相色谱图应与对照指纹图谱基本一致，有相对应的10个特征峰。按中药色谱指纹图谱相似度评价系统，供试品指纹图谱与对照指纹图谱经相似度计算，相似度不得低于0.80。

实验实施例1：加水煎煮时间的研究

1、加水煎煮时间考察：根据苦碟子药材性质，将其（苦碟子干燥地上部分）剪成2-3cm小段儿，混匀，随机称取2份，每份40g。

2、加水煎煮：分别煎煮2次，一份煎煮时间（1.0，0.5h），一份煎煮时间（2.0，1.0h）。

3、检测：第一、二次煎煮液分别检测，研究煎煮次数的提取率；合并两次煎煮液，减压浓缩，检测水量对含测的影响。

4、固体物：将减压浓缩物，水浴蒸干，称重，比较差异。

5、检测数据如下表所示：

表2 苦碟子加水煎煮时间的研究结果

结论：综合考虑各种因素，苦碟子注射液水煎煮优选工艺为加水煎煮2次，第一次1.0小时，第二次0.5小时，水量以15倍量为好。

实验实施例2：苦碟子石灰乳沉淀物乙醇分散液调酸影响因素试验

表3石灰乳沉淀物乙醇分散液调酸实验结果

由上表所示，苦碟子石灰乳乙醇分散液用硫酸调节pH值越小，含量测定值越大，优选pH值为3.0-4.0。

实验实施例3：苦碟子硫酸乙醇解析液用NaOH调节pH值影响因素实验

表4硫酸乙醇解析液用NaOH调节pH值影响因素实验结果

由上表所示，苦碟子硫酸乙醇解析液用NaOH调节pH值，黄酮类化合物（木犀草素醛酸苷）含量随着pH值增加而降低，而考虑到去除杂质的因素，最佳pH值为7.0。

实验实施例4：超滤实验方法及结果

1．实验方法

（1）超滤前后腺苷含量测定

色谱条件色谱柱 ODS柱(250mm×4．6 mm)；柱温：30℃；流动相：甲醇-水(体积比13：87)；流速为1mL／min；检测波长：260nm 。

样品测定取超滤前后样品溶液，经0.45μm滤膜滤过，注入高效液相色谱仪，测定腺苷峰面积，计算含量。结果，超滤前后腺苷含量变化不大，见表5 。

表5 苦碟子注射液超滤前后腺苷含量测定比较结果

（2）超滤前后木犀草素7-O-β-D葡萄糖醛酸苷的含量测定

色谱条件色谱柱 ODS柱(250mm×4．6 mm)；柱温：30℃；流动相：乙腈-0.4%磷酸溶液（20：80）；流速为1mL／min；检测波长：348nm。

样品测定取超滤前后样品溶液，经0.45μm滤膜滤过，精密吸取一定量，注入高效液相色谱仪，测定醛酸苷峰面积，计算，即得。结果见下表。

表6木犀草素7-O-β-D葡萄糖醛酸苷的含量测定

（3）超滤前后总黄酮的含量测定，结果见下表。

表7 苦碟子注射液超滤前后紫外吸收度值检测结果

（4）超滤前后指纹图谱比较

色谱条件与系统适用性试验用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂 (色谱柱250mm×4．6mm 5μm)；柱温：40℃；流动相A为乙腈；B为0.4%磷酸溶液（ml/ml）,按下表程序进行梯度洗脱；流速为1mL／min；检测波长：348nm。

测定法精密吸取供试品溶液5μl，注入高效液相色谱仪，记录40分钟内各峰的保留时间和积分面积。具体检测结果如图1所示。

依据上述试验结果，暂定应有11个共同色谱峰，照中药色谱指纹图谱相似度分析系统检验，超滤前后供试品色谱图基本一致，相似度均大于0.9。

（5）超滤前后苦碟子注射液中杂质检测结果，见表8 ：

表8 超滤前后苦碟子注射液中杂质检测结果

综合实验结果来看，超滤膜纯化苦碟子提液的工艺，有效成分保留率高，提取液稳定性好，工艺成本低的特点，提示该超滤工艺可适用于苦碟子注射液的工业化纯化过程。

实验实施例5：木犀草素7-O-β-D葡萄糖醛酸苷和菊苣酸的方法学考察

1、测定波长的确定

通过绘制木犀草素7-O-β-D葡萄糖醛酸苷和菊苣酸的紫外吸收图谱，结果显示木犀草素7-O-β-D葡萄糖醛酸苷在348nm处有最大吸收，菊苣酸在330nm处有最大吸收。

2、线性

精密称取木犀草素7-O-β-D葡萄糖醛酸苷对照品和蒲公英素对照品适量配成浓度为（0.2018mg/ml、0.116 mg/ml）的混合对照品溶液，精密吸取1、3、5、7、9、13、15、20μl，分别注入液相色谱仪，测定色谱峰面积，进行线性回归，结果如图2，图3所示。

结论：木犀草素7-O-β-D葡萄糖醛酸苷对照品溶液在浓度0.2018mg～4.036mg之间线性关系良好；菊苣酸对照品溶液在浓度0.116mg～2.32mg之间线性关系良好。

3、精密度

精密吸取木犀草素7-O-β-D葡萄糖醛酸苷和菊苣酸混合对照品溶液5μl，注入液相色谱仪，测定色谱峰面积，连续进6次，结果如下：

表9 木犀草素7-O-β-D葡萄糖醛酸苷和菊苣酸混合对照品精密度

4、稳定性

按质量标准正文含量测定项下指纹图谱检测方法操作，精密吸取供试品溶液5μl分别于0、1、2、3、4、5、6小时间隔注入液相色谱仪，测定色谱峰面积，结果如下：

表10 苦碟子注射液含量测定稳定性

结论：供试品溶液在5小时内稳定。

5、重复性

取同一批号苦碟子注射液6支,按质量标准正文含量测定项下指纹图谱检测方法操作，精密吸取对照品溶液和供试品溶液各5μl分别注入液相色谱仪，测定色谱峰面积，计算含量，结果如下：

表11 苦碟子注射液含量测定重复性

结论：符合规定。

6、回收率

精密称取木犀草素7-O-β-D葡萄糖醛酸苷对照品和蒲公英素对照品适量配成浓度为（0.10812mg/ml、0.02368mg/ml）的混合对照品溶液取已知含量的样品（木犀草素7-O-β-D葡萄糖醛酸苷0.1169mg/ml；菊苣酸 0.02497mg/ml）各5ml，加入上述对照品溶液5ml，制备6个供试品溶液，精密吸取对照品溶液和供试品溶液各5μl分别注入液相色谱仪，测定色谱峰面积，计算含量，结果如下：

表12 木犀草素7-O-β-D葡萄糖醛酸苷加样回收率

表13 菊苣酸加样回收率

结论：符合规定。

实验实施例6：苦碟子注射液指纹图谱研究

色谱条件

色谱柱Phenomenex Luna C18 4.6mm×250mm 5μ;流动相A为乙腈，B为0.4％磷酸溶液（ml/ml）,按下表程序进行梯度洗脱，如表10所示，流速0.9ml/min;检测波长为327nm;柱温40℃。

表15梯度洗脱条件

供试品溶液的制备取本品适量，用0.45μm滤膜滤过，即得。

测定法精密吸取上述叁种溶液，注入高效液相色谱仪，记录90分钟内的色谱图。供试品液相色谱图应与对照指纹图谱基本一致，有相对应的10个特征峰。按中药色谱指纹图谱相似度评价系统，供试品指纹图谱与对照指纹图谱（图 1）经相似度计算，相似度为0.982-0.995，不低于0.8，符合相关规定，结果见图4和图5。

图1是超滤前后指纹图谱比较

图2是木犀草素7-O-β-D葡萄糖醛酸苷线性图

图3是菊苣酸线性图

图4是苦碟子注射液对照指纹图谱

图5是10批次苦碟子注射液指纹图谱研究结果

Claims

1.一种苦碟子注射液的制备方法，其特征在于该方法为：

取抱茎苦荬菜，加水煎煮二次，第一次1小时，第二次0.5小时，合并煎液，浓缩至每1ml相当于原生药0.5g，放冷至40℃以下，在搅拌下加10%氧化钙乳调节pH值至10，放置12-24小时，离心，离心沉淀物称重，悬浮于适量95%乙醇中使含醇量达80%，加50%硫酸溶液调节pH值至3～4，充分搅拌使反应完全，离心或过滤，离心液或过滤液加40%氢氧化钠溶液中和pH值至7，离心或滤过，滤液回收乙醇，并挥尽乙醇，用注射用水稀释至每1ml相当于原生药10g，置-5℃以下放置12-24小时，滤过，滤液加0.1～0.2%药用活性炭粉末，煮沸15分钟，置-5℃以下放置达24-48小时，滤过，滤液121 ℃灭菌45分钟，得苦碟子浓缩液，置-5℃以下放置；取苦碟子浓缩液，滤过，用30KD分子量超滤膜超滤，滤液加注射用水稀释至规定量，调节pH值至7.0～7.5，用10KD分子量超滤膜超滤，后用孔径0.22μm的微孔滤膜滤过，灌封，在115℃灭菌35分钟，即得苦碟子注射液；苦碟子注射液中每10ml含总黄铜以无水芦丁计为4.0-15.0mg；每10ml含抱茎苦荬菜以腺苷计含量不少于0.025mg；每1ml含木犀草素7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷含量不得少于0.010mg，含菊苣酸不得少于0.010mg。