CN111956734A - 一种咽康含片的优化提取方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于药材提取技术领域，公开了一种咽康含片的优化提取方法，称取玄参、麦冬、桔梗和甘草，加入一定量水，煎煮两次，合并煎液；将合并的煎液浓缩至60mL左右，移至100mL量瓶中并加水至刻度，即得咽康含片水提浸膏；所述咽康含片醇提优化方法包括：将冬凌草药材切细，称取切细的冬凌草药材50g，加入到圆底三颈烧瓶中，搭回流装置；加乙醇进行回流提取，过滤，收集滤液并进行水浴锅上浓缩；浓缩到60ml后进行冷却，冷却后转移到100ml的容量瓶中，加提取浓度的乙醇至刻度，得到冬凌草浸膏。本发明对药材提取分离过程进行优化，减少了挥发性成分的损失，明确提取分离过程中所需要精准参数。

Description

一种咽康含片的优化提取方法
技术领域
本发明属于药材提取技术领域，尤其涉及一种咽康含片的优化提取方法。
背景技术
呼吸系统疾病、急慢性咽炎的发病率也随之上升，咽康含片原名咽特佳， 咽康含片原名为咽特佳含片，具有清热解毒，养阴利咽功效，临床用于急慢性 咽喉炎治疗。咽康含片作为纯中药制剂，除具有一般化学药物疗效确切的特点 外，在安全指标方面大大优于化学药，符合当今世界范围“回归自然”的潮流。 随着中药现代化科技产业的实施及在生产中的运用，已经在很大程度上改变了 中药、天然药物制剂比较落后的状态，易为现代人所接受。如果进一步应用现 代化手段深入研究咽康含片，提高咽康含片生产工艺和质量控制标准，将会使 咽康含片成为一种有前途的治疗呼吸系统疾病的药物，即生物利用度高、疗效满意毒副作用少的新药。可以预计，咽康含片的市场前景是十分广阔的前景。
一、主要药材研究分析：
1.1处方中君药冬凌草
冬凌草的主要化学成分是萜类化合物，还含有挥发油、甾体、黄酮、生物 碱、氨基酸、有机酸、单糖，其中主要成分，主要骨架构包括对映贝壳杉烷型 和螺断贝壳杉烷型.其中对映贝壳杉烷型包括:冬凌草甲素、冬凌草乙素、冬 凌草丙素、lasiodonin、suimiyainA、eEffusaninE、冬凌草丁素、冬凌草戊素、 鲁冬凌草甲素、鲁山冬凌草乙素、鲁山冬凌草丙素、山冬凌草丁素、鲁山冬凌 草戊素、信阳冬凌草甲、信阳冬凌草乙素、lasiodoninacetonide等。冬凌草具有 消炎镇痛，解除痉挛，抗菌作用对金葡菌、甲型溶链菌有明显的抑制作用；抗 肿瘤作用，冬凌草的主要药理作用有抗炎、抗氧化作用，免疫增强作用。
1.2处方中臣药玄参、麦冬、甘草、桔梗
玄参主要含环烯醚萜类、苯丙素苷类，尚含有植物甾醇，有机酸，黄酮类， 三萜皂苷，挥发油，糖类，其物碱及微量的单萜和二萜成分等。玄参对心血管 系统有扩血管、降压、纤溶作用，还有镇痛，抗炎，免疫增强，保肝等药理作 用。
麦冬的主要含有为麦冬皂苷等。苷元是麦冬中甾体皂苷成分的主要活性结 构。麦冬皂苷主要有薯蓣型(diosgenin)和鲁斯可型皂苷元(ruscogenin)两种， 两种苷元均为25(S)的异构体，它们主要以单糖链方式连接三糖苷或二糖苷， 其次高异黄酮是麦冬中的另一种主要有效成分。麦冬具有降糖，抗心肌缺血， 抗疲劳，抗衰老等药理作用。
甘草中主要化合物成分主要有，三萜皂苷、黄酮、香豆索、有机酸、生物 碱、挥发油、糖类和氨基酸等类型峥。甘草具有保肝，抗病毒，抗炎止痒，抗 菌等药理作用
桔梗主要含有桔梗总皂苷，还含有多聚糖、甾醇类及其糖苷、脂肪油、脂 肪酸多聚糖、甾醇类及其糖苷、脂肪油、脂肪酸等。抗肿瘤，免疫增强，抗氧 化活性作用。
综上所述，咽康含片主要成分具有良好的药理活性，过去受科学技术条件 的限制，咽康含片在质量的控制上缺乏检验的方法手段。当今社会优良中药品 种，需要靠于现代制药技术，在质量控制方面，充分利用好中药指纹图谱HPLC 技术，该技术能够反映中药内在质量的整体变化情况，从而能更进一步控制咽 康含片的均一，尤其在保证产品批与批之间内在的质量的稳定性方面是切实可 行，并保护中药药物有效成分的完整性，运用现代先进的制药技术与分析技术， 对主药成分进一步分析研究，在原有产品设计的基础上，通过方法学研究改进 提取工艺，将会在中药治疗咽炎的市场上发挥更大的作用，为患者提安全、有 效、经济的治疗药物。
目前对咽康含片生产工艺的优化研究较少，未明确提取分离过程中所需要 精准参数，如溶媒的用量、加热搅拌方式、药材体积大小等等，更缺乏可靠的 检验方法和指标对生产过程进行有效的控制。同时，现行咽康含片质量标准含 量测定项目中所控制的成分和指标为薄荷脑，而该药中发挥主要药效的药材冬 凌草、玄参、甘草等却没有合适的方式进行控制。
通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：目前对咽康含片生产工艺 的优化研究较少，未明确提取分离过程中所需要精准参数，也缺乏可靠的检验 方法和指标对生产过程进行有效的控制。
针对以上问题,本发明对咽康含片生产工艺进行了系统研究,对溶媒用量、提 取方式和时间、药材体积等关键因素进行了明确规定,并建立了针对咽康含片中 主要成份的测量方式,从而能方便有效地生产均一的、品质可控的咽康含片。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种咽康含片的优化提取方法。
本发明是这样实现的，一种咽康含片的优化提取方法，所述咽康含片的优 化提取方法包括：咽康含片水提优化方法以及咽康含片醇提优化方法；
所述咽康含片水提优化方法包括：
步骤一，称取玄参20g、麦冬20g、桔梗20g和甘草10g，加入一定量水， 煎煮两次，合并煎液；
步骤二，将合并的煎液浓缩至60mL左右，移至100mL量瓶中并加水至刻 度，即得咽康含片水提浸膏；
所述咽康含片醇提优化方法包括：
(1)将冬凌草药材切细，称取切细的冬凌草药材50g，加入到圆底三颈烧 瓶中，搭回流装置；
(2)加乙醇进行回流提取，过滤，收集滤液并进行水浴锅上浓缩；
(3)浓缩到60ml后进行冷却，冷却后转移到100ml的容量瓶中，加提取 浓度的乙醇至刻度，得到冬凌草浸膏。
进一步，步骤一中，所述加入一定量水，煎煮两次，合并煎液包括：
加8倍水，第1次煎煮时间为3小时，过滤，收集滤液；再加入和8倍数 的水进行第2次煎煮，第2次煎煮时间为2小时，过滤，合并滤液。
进一步，步骤(2)中，所述加乙醇进行回流提取包括：
加入乙醇浓度为95％，加水量为10倍，提取时间为1小时。
本发明的另一目的在于提供一种HPLC法同时测定咽康含片中水提部分甘 草苷、甘草酸铵、迷迭香酸和哈巴俄苷的测定方法，所述HPLC法同时测定咽 康含片中水提部分甘草苷、甘草酸铵、迷迭香酸和哈巴俄苷的测定方法包括：
1)制备甘草苷、甘草酸铵、迷迭香酸和哈巴俄苷的对照溶液；
2)制备缺甘草阴性样品以及缺玄参阴性样品；
3)制备测定样品；
4)分别吸取对照品溶液和测定品溶液进样，以SPD-20A检测器检测，选择 230nm作为甘草苷、甘草酸铵、迷迭香酸和哈巴俄苷含量测定检测波长。
进一步，步骤1)中，所述对照溶液制备方法包括：
取甘草苷对照品5.33mg、甘草酸铵对照品9.90mg、哈巴俄苷对照品9.36mg 和迷迭香酸对照品9.70mg，分别置于10ml容量瓶中，精密称定，加甲醇溶解并 稀释至刻度，得储备液1、储备液2、储备液3和储备液4；分别精密吸取储备 液1、2、3、4各1ml于5ml容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，得混合对照品标准 溶液。
进一步，步骤2)中，所述缺甘草阴性样品以及缺玄参阴性样品制备方法包 括：
缺甘草阴性样品的制备：称取玄参20g、麦冬20g、桔梗20g，共60g，加 入10倍量的水600mL进行煎煮，第1次煎煮时间为3小时，过滤，收集滤液， 再加入10倍数的水进行第2次煎煮，第2次煎煮时间为2小时，过滤，合并滤 液，浓缩至60mL左右，移至100mL量瓶中并加水至刻度，然后转移到密封瓶 中贴标签，得到缺甘草阴性样品水提浸膏，放置备用；
缺玄参阴性样品的制备：称取麦冬20g、桔梗20g、甘草10g，共50g，加 入10倍量的水500mL进行煎煮，第1次煎煮时间为3小时，过滤，收集滤液， 再加入10倍水进行第2次煎煮，第2次煎煮时间为2小时，过滤，合并滤液， 浓缩至60mL左右，移至100mL量瓶中并加水至刻度，然后转移到密封瓶中贴 标签，得到缺玄参阴性样品水提浸膏，放置备用。
进一步，步骤3)中，所述测定样品制备方法包括：
称取玄参20g、麦冬20g、桔梗20g和甘草10g，加入8倍水，进行煎煮， 第1次煎煮时间为3小时，过滤，收集滤液，再加入8倍数的水进行第2次煎 煮，第2次煎煮时间为2小时，过滤，合并滤液，浓缩至60mL左右，移至100mL 量瓶中并加水至刻度，然后转移到密封瓶中贴标签，得到正交试验水提浸膏， 放置备用。
结合上述的所有技术方案，本发明所具备的优点及积极效果为：本发明对 药材提取分离过程进行优化，减少了挥发性成分的损失，明确提取分离过程中 所需要精准参数。本发明建立了HPLC法同时测定咽康含片中水提部分甘草苷、 甘草酸铵、迷迭香酸和哈巴俄苷4种主要成分。该方法精密度高、重现性好、 操作简便，测定结果准确可靠，是一种高效、可行的质量评价技术。为咽康含 片的质量控制提供了科学依据本实验为工业大批量生产提供参考数据。
附图说明
图1是本发明实施例提供的咽康含片水提优化方法流程图。
图2是本发明实施例提供的咽康含片醇提优化方法流程图。
图3是本发明实施例提供的HPLC法同时测定咽康含片中水提部分甘草苷、 甘草酸铵、迷迭香酸和哈巴俄苷的测定方法流程图。
图4是本发明实施例提供的各定量成分色谱峰与对照品色谱峰图1。
图中：1.甘草苷；2迷迭香酸；3.哈巴俄苷；4甘草酸铵。
图5是本发明实施例提供的各定量成分色谱峰与对照品色谱峰图2。
图中：1.甘草苷；2迷迭香酸；3.哈巴俄苷；4甘草酸铵。
图6是本发明实施例提供的冬凌草甲素对照品示意图。
图7是本发明实施例提供的冬凌草甲素含量测定示意图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例， 对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以 解释本发明，并不用于限定本发明。
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种咽康含片的优化提取方法， 下面结合附图对本发明作详细的描述。
本发明实施例提供的咽康含片的优化提取方法包括：咽康含片水提优化方 法以及咽康含片醇提优化方法。
如图1所示，本发明实施例提供的咽康含片水提优化方法包括：
S101，称取玄参20g、麦冬20g、桔梗20g和甘草10g，加入一定量水，煎 煮两次，合并煎液；
S102，将合并的煎液浓缩至60mL左右，移至100mL量瓶中并加水至刻度， 即得咽康含片水提浸膏；
如图2所示，本发明实施例提供的咽康含片醇提优化方法包括：
S201，将冬凌草药材切细，称取切细的冬凌草药材50g，加入到圆底三颈烧 瓶中，搭回流装置；
S202，加乙醇进行回流提取，过滤，收集滤液并进行水浴锅上浓缩；
S203，浓缩到60ml后进行冷却，冷却后转移到100ml的容量瓶中，加提取 浓度的乙醇至刻度，得到冬凌草浸膏。
步骤S101中，本发明实施例提供的加入一定量水，煎煮两次，合并煎液包 括：
加8倍水，第1次煎煮时间为3小时，过滤，收集滤液；再加入和8倍数 的水进行第2次煎煮，第2次煎煮时间为2小时，过滤，合并滤液。
步骤S202中，本发明实施例提供的加乙醇进行回流提取包括：
加入乙醇浓度为95％，加水量为10倍，提取时间为1小时。
如图3所示，本发明实施例提供的HPLC法同时测定咽康含片中水提部分 甘草苷、甘草酸铵、迷迭香酸和哈巴俄苷的测定方法包括：
S301，制备甘草苷、甘草酸铵、迷迭香酸和哈巴俄苷的对照溶液；
S302，制备缺甘草阴性样品以及缺玄参阴性样品；
S303，制备测定样品；
S304，分别吸取对照品溶液和测定品溶液进样，以SPD-20A检测器检测， 选择230nm作为甘草苷、甘草酸铵、迷迭香酸和哈巴俄苷含量测定检测波长。
步骤S301中，本发明实施例提供的对照溶液制备方法包括：
取甘草苷对照品5.33mg、甘草酸铵对照品9.90mg、哈巴俄苷对照品9.36mg 和迷迭香酸对照品9.70mg，分别置于10ml容量瓶中，精密称定，加甲醇溶解并 稀释至刻度，得储备液1、储备液2、储备液3和储备液4；分别精密吸取储备 液1、2、3、4各1ml于5ml容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，得混合对照品标准 溶液。
步骤S302中，本发明实施例提供的缺甘草阴性样品以及缺玄参阴性样品制 备方法包括：
缺甘草阴性样品的制备：称取玄参20g、麦冬20g、桔梗20g，共60g，加 入10倍量的水600mL进行煎煮，第1次煎煮时间为3小时，过滤，收集滤液， 再加入10倍数的水进行第2次煎煮，第2次煎煮时间为2小时，过滤，合并滤 液，浓缩至60mL左右，移至100mL量瓶中并加水至刻度，然后转移到密封瓶 中贴标签，得到缺甘草阴性样品水提浸膏，放置备用；
缺玄参阴性样品的制备：称取麦冬20g、桔梗20g、甘草10g，共50g，加 入10倍量的水500mL进行煎煮，第1次煎煮时间为3小时，过滤，收集滤液， 再加入10倍水进行第2次煎煮，第2次煎煮时间为2小时，过滤，合并滤液， 浓缩至60mL左右，移至100mL量瓶中并加水至刻度，然后转移到密封瓶中贴 标签，得到缺玄参阴性样品水提浸膏，放置备用。
步骤S303中，本发明实施例提供的测定样品制备方法包括：
称取玄参20g、麦冬20g、桔梗20g和甘草10g，加入8倍水，进行煎煮， 第1次煎煮时间为3小时，过滤，收集滤液，再加入8倍数的水进行第2次煎 煮，第2次煎煮时间为2小时，过滤，合并滤液，浓缩至60mL左右，移至100mL 量瓶中并加水至刻度，然后转移到密封瓶中贴标签，得到正交试验水提浸膏， 放置备用。
下面结合具体实施例对本发明的技术方案作进一步描述。
实施例1：
一、咽康含片水提部分工艺的研究
根据现有的玄参、麦冬、桔梗、甘草煎液制备过程分别是加水煎煮二次， 第一次3小时，第二次2小时，将煎液合并后过滤，滤液浓缩至相对密度为1.10～ 1.20(60℃)的清膏。此生产过程应细化如加水的倍数、浸泡时间、提取时间， 因此将上述三种条件作为考察因素对咽康含片中水提部分工艺提进行L9(34)正 交试验，以主要成分甘草苷、甘草酸铵、迷迭香酸和哈巴俄苷含量为指标进行 评价，为提高4种成分含量测定效率，本部分应用液相色谱仪系统(技术同时 测定甘草苷、甘草酸铵、迷迭香酸和哈巴俄苷的含量。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1试药
甘草苷(Liquiritin，供含量测定用，批号：111610-201106，中国药品生物 制品检定所)、甘草酸铵(Monoammonium Glycyrrhizinate，供含量测定用，批 号：110731-201317，中国药品生物制品检定所)、哈巴俄苷(Harpagoside，供 含量测定用，批号：111730-201307，中国药品生物制品检定所)、迷迭香酸 (Rosmarinic acid，供含量测定用，批号：111871-201203，中国药品生物制品检 定所)、甲醇(色谱纯，SK Chemicals公司)、乙腈(色谱纯，SK Chemicals公司)， 其余试剂均为分析纯；
1.1.2仪器
Prominenece HPLC超快速液相色谱仪系统(岛津公司，包括两台LC-20AD 二元梯度泵、DGU-20A3真空脱气机、SIL-20AHT自动进样器、CTO-10ASvp 柱温箱、SPD-20A紫外检测器、LC-Solution色谱工作站)；AE240十万分之一 电子天平(梅特勒-托利多仪器上海有限公司)；超纯水机(四川沃特尔科技发 展有限公司)
1.2甘草苷、甘草酸铵、迷迭香酸和哈巴俄苷含量测定方法的建立
1.2.1混合对照品溶液的制备
取甘草苷对照品约5.33mg、甘草酸铵对照品约9.90mg、哈巴俄苷对照品约 9.36mg和迷迭香酸对照品约9.70mg，分别置于10ml容量瓶中，精密称定，加 甲醇溶解并稀释至刻度，得储备液1、储备液2、储备液3和储备液4。分别精 密吸取储备液1、2、3、4各1ml于5ml容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，得混合 对照品标准溶液。
1.2.2阴性样品制备
缺甘草阴性样品的制备，称取玄参20g、麦冬20g、桔梗20g，共60g，加 入10倍量的水600mL进行煎煮，第1次煎煮时间为3小时，过滤，收集滤液， 再加入和上次相同倍数的水进行第2次煎煮，第2次煎煮时间为2小时，过滤， 合并滤液，浓缩至60mL左右，移至100mL量瓶中并加水至刻度，然后转移到 密封瓶中贴标签，得到缺甘草阴性样品水提浸膏(0.6g/ml)，放置备用。缺玄参阴 性样品的制备，称取麦冬20g、桔梗20g、甘草10g，共50g，加入10倍量的水 500mL进行煎煮，第1次煎煮时间为3小时，过滤，收集滤液，再加入和上次 相同倍数的水进行第2次煎煮，第2次煎煮时间为2小时，过滤，合并滤液， 浓缩至60mL左右，移至100mL量瓶中并加水至刻度，然后转移到密封瓶中贴 标签，得到缺玄参阴性样品水提浸膏(0.5g/ml)，放置备用。
1.2.3供试样品制备
称取玄参20g、麦冬20g、桔梗20g和甘草10g，加入设计倍数的水，按设 计的浸泡进行浸泡，接着进行煎煮，第1次煎煮时间为设计时间，过滤，收集 滤液，再加入和上次相同倍数的水进行第2次煎煮，第2次煎煮时间均为2小 时，过滤，合并滤液，浓缩至60mL左右，移至100mL量瓶中并加水至刻度， 然后转移到密封瓶中贴标签，得到正交试验水提浸膏(0.7g/ml)1--9号，放置备用。
1.2.4含量测定检测波长的选择
按拟定的色谱条件，分别吸取对照品溶液和供试品溶液进样，以SPD-20A 检测器检测，结果在检测波长为230nm时，在供试品色谱中基本能兼顾各成分 色谱峰的丰度、分离度和基线，因此选择230nm作为甘草苷等4种成分含量测 定检测波长。
1.3方法学考察
1.3.1线性关系试验
分别精密吸取混合对照品标准溶液0.5、1、2、4、8、16、22μl，按拟定 的色谱条件，注入色谱仪中，以进样浓度为横坐标，峰面积为纵坐标绘制工作 曲线，进样对照品系列浓度见表1，计算回归方程，结果见表2。
表1 4种化合物浓度(mg·ml-1)
Figure BDA0002597714980000101
表2各成分的回归方程
Figure BDA0002597714980000111
1.3.2精密度试验
取同一供试品溶液10μl，连续进样6次，测定峰面积，结果6次进样峰面 积平均值的RSD％在0.18～0.65之间，说明精密度良好。结果见表3。
表3精密度试验结果
Figure BDA0002597714980000112
1.3.3重复性试验
照供试品溶液制备方法制备供试品溶液，分别测定个指标成分，计算各指 标含量。RSD％在0.2～0.7之间，表明试验的重复性良好。结果见表4。
表4重复性试验结果
Figure BDA0002597714980000113
Figure BDA0002597714980000121
1.3.4稳定性试验
照供试品溶液制备方法制备供试品溶液，分别称取20ul按0、2、4、6、8、 24小时分别进样，测定各指标成分峰面积，结果供试品溶液在24小时内稳定。 结果见表5。
表5稳定性试验结果
Figure BDA0002597714980000122
1.3.5回收率试验
分别称取20ul已测定含量的供试液6份，精密加入含有4种被测成分混合 对照品的甲醇溶液，按供试品溶液制备方法制备供试品溶液，测定指标成分含 量，结果见表6至表9所示。
表6甘草苷回收率试验结果
Figure BDA0002597714980000131
表7迷迭香酸回收率试验结果
Figure BDA0002597714980000132
表8哈巴俄苷回收率试验结果
Figure BDA0002597714980000133
表9甘草酸铵回收率试验结果
Figure BDA0002597714980000141
1.4正交试验优化水提生产工艺
1.4.1正交试验设计
本发明选取了提取物中主要有效成分甘草苷、甘草酸铵、迷迭香酸和哈巴 俄苷的含量做考查指标，选用L9(34)正交方案，考察了浸泡时间、加水量和第一 次提取时间3个因素，每个因素3个水平，设计试验方案见表10，
称取玄参20g、麦冬20g、桔梗20g和甘草10g，加入设计倍数的水，按设 计的浸泡进行浸泡，接着进行煎煮，第1次煎煮时间为设计时间，过滤，收集 滤液，再加入和上次相同倍数的水进行第2次煎煮，第2次煎煮时间均为2小 时，过滤，合并滤液，浓缩至60mL左右，移至100mL量瓶中并加水至刻度， 然后转移到密封瓶中贴标签，得到正交试验水提浸膏(0.7g/ml)1--9号，放置备用。 见表1.4.1-1。
表10水提工艺条件L9(34)因素水平表
Figure BDA0002597714980000142
表11水提工艺条件L9(34)正交试验安排
Figure BDA0002597714980000151
1.5样品含量测定的预处理
1.5.1萃取溶媒的选择
分别吸取缺玄参阴性对照样品(20131121)20mL，置于60mL梨形分离漏 斗中，加20mL用水饱和过的正丁醇萃取3次，合并上层的正丁醇萃取液，水浴 蒸干，残渣用甲醇溶解并移至50mL量瓶中，用甲醇定容，得缺玄参阴性对照样 品A；同法用乙酸乙酯萃取，得缺玄参阴性对照样品B。
分别吸取缺甘草阴性对照样品(20131121)20mL，置于60mL梨形分离漏 斗中，加20mL用水饱和过的正丁醇萃取3次，合并上层的正丁醇萃取液，水浴 蒸干，残渣用甲醇溶解并移至50mL量瓶中，用甲醇定容，得缺甘草阴性对照样 品A；同法用乙酸乙酯萃取，得缺甘草阴性对照样品B。
分别吸取模拟生产样品(201311271)20mL，置于60mL梨形分离漏斗中， 加20mL用水饱和过的正丁醇萃取3次，合并上层的正丁醇萃取液，水浴蒸干， 残渣用甲醇溶解并移至50mL量瓶中，用甲醇定容，得模拟生产样品A；同法用 乙酸乙酯萃取，得模拟生产样品B。
1.5.2实验样品的处理
预实验中溶媒选择正丁醇时出峰面积大，分离度较好，故选之作为溶媒， 分别吸取正交实验样品1～9号各20mL，置于60mL梨形分离漏斗中，加20mL 用水饱和过的正丁醇萃取3次，合并上层的正丁醇萃取液，水浴蒸干，残渣用 甲醇溶解并移至50mL量瓶中，用甲醇定容，得正交实验样品1～9号。
1.6正交试验样品含量的测定
取正交实验制备1～9号样品分别取10ul进样。按图3项色谱条件测定，记 录并计算甘草酸铵、甘草苷、哈巴俄苷的含量，结果见表12。
表12正交试验样品含量测定结果
Figure BDA0002597714980000161
2结果
表13正交试验结果直观分析
Figure BDA0002597714980000162
Figure BDA0002597714980000171
3讨论
提取条件的影响从表13的结果可看出，浸泡时间有三个，分别为0小时、 1小时、2小时，这三个时间条件对产率的影响结果表明，浸泡时间越短提取率 越高，根据该条件极差R值，浸泡对提取率无显著影响，试验中加入水的倍数 分别是，8倍、10倍、12倍，这三个加水倍数条件对产率的影响结果表明，加 入8倍水时提取效率最佳，根据该条件极差R值，浸泡对提取率有一定响；提 取时间有三个，分别为1小时、2小时、3小时，提取时间对产率的影响是越长 提取率越高，根据该条件极差R值，提取时间对提取率有显著影响。
4结论
本发明通过方法学研究，以ABC三因素设计正交试验得出的结果是，影响 提取效果的因素顺序为首次提取时间＞加水量＞侵泡时间，最佳提取条件为侵 泡时间为0，加水量为8倍，首次提取时间为3小时，同时建立了HPLC法同时 测定咽康含片中水提部分甘草苷、甘草酸铵、迷迭香酸和哈巴俄苷4种主要成 分。该方法精密度高、重现性好、操作简便，测定结果准确可靠，是一种高效、 可行的质量评价技术。为为咽康含片的质量控制提供了科学依据本发明为工业 大批量生产提供参考数据。
实施例2：咽康含片中醇提工艺的研究
咽康含片主君药冬凌草作为一种有良好活性，近年内受到国内外学者的关 注。冬凌草又名冰凌草、六月令，得名于冬天全株结满薄如蝉翼的银白色冰凌 片，植物来源为唇形科香茶菜属植物碎米桠，广布于黄河、长江流域，主产地 在河南济源太行山一带，济源当地民间用于治疗食管癌已有30余年的历史，据 记载：冬凌草味甘苦，性微寒，具清热解毒、消炎止痛、健胃活血及抗肿瘤之 功效。咽康含片的质量标准及其控制方法亦不适应现代医药的发展。本发明拟 采用正交实验法对冬凌草乙醇提取分离质量控制关键技术进行研究；近来通过 实验可知其主要成分为冬凌草甲素，因此以冬凌草甲素咽康含片醇提生产工艺，优选出最佳的工艺参数，建立各中间体质控方法，实现产品过程质量控制。为 了优化咽康含片生产工艺中冬凌草提取工艺，本发明拟采用正交实验法对冬凌 草乙醇提取分离质量控制关键技术进行研究；对冬凌草甲素进行含量测定，以 冬凌草甲素含量为指标，优选出最佳的工艺参数，确定乙醇的浓度及倍数，提 取时间，得到可靠的检验方法和指标对生产过程进行有效的控制。
1材料与方法
1.1试药与仪器
DIONEX UltiMate3000液相色谱工作系统(Thermo公司，四元梯度泵， DAD紫外检测器。Chromeleon7色谱工作站)，AE240十万分之一电子天平(梅 特勒-托利多仪器上海有限公司)；超纯水机(四川沃特尔科技发展有限公司)； 冬凌草甲素对照品(批号：1111721-200602，中国药品生物制品检定所)，甲醇 (色谱纯)、其余试剂均为分析纯；冬凌草药材(批号：20130301，贵州科辉 制药有限责任公司)，冬凌草流浸膏(批号：YKCJ130801，贵州科辉制药有限责 任公司)。
1.2冬凌草甲素含量测定方法的建立
色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇: 水(55：45)为流动相；流速1mL·min-1；柱温:30℃；检测波长为239nm。理论 板数按冬凌草甲素峰计算应不低于4000。
1.3对照品储备液的制备
取冬凌草甲素对照品15.3mg，精密称定，置50ml量瓶中，加甲醇适量， 超声溶解，加甲醇至刻度，摇匀，得对照品储备液(0.3060mg/ml)。
1.4对照品储备液的制备
取冬凌草甲素对照品储备液2ml，置10ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀， 即得(制成每1ml含61.20μg的溶液)。
1.5供试品溶液的制备
取冬凌草流浸膏约0.5g，精密称定，置50ml量瓶中，加入甲醇至刻度， 摇匀，用0.22μm滤膜过滤，取续滤液，即得。
1.6方法学考察
1.6.1线性关系试验
分别精密量取对照品储备液0.25、0.5、1、2、4mL，分别置五个10ml量 瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，得系列浓度的对照品溶液，按拟定的色谱条 件进样测定，测定结果见表14，以进样量为横坐标(X)，峰面积为纵坐标(Y)， 计算，得线性回归方程和线性范围，得回归方程Y＝15.8509X+0.0817r＝0.9999， 线性范围0.0765～1.224mg/ml。从线性回归方程结果表明：进样量在 0.0765～1.224mg/ml范围内与峰面积线性关系良好。
表14冬凌草甲素进样量和峰面积
Figure BDA0002597714980000191
Figure BDA0002597714980000201
1.6.2精密度试验
精密量取冬凌草流浸膏(YKCJ130801)同一供试品溶液10μL，连续进样6 次，测定冬凌草甲素峰面积。从精密度试验结果得出：平均峰面积＝11.144， RSD＝0.141％，表明仪器精密度良好，见表15。
表15精密度试验结果
Figure BDA0002597714980000202
1.6.3重复性试验
取同一批号冬凌草流浸膏(YKCJ130801)供试品6份，每份约0.5g，精密称 定，按供试品溶液制备方法制备供试品溶液，分别测定，计算冬凌草甲素含量， 其结果见表1。
表16重复性试验表
Figure BDA0002597714980000203
注：冬凌草流浸膏(YKCJ130801)浓度为:6.9446mg/g。
从重复性试验结果得出：RSD＝1.25％(n＝6)，表明方法重复性良好。
1.6.3稳定性试验
精密量取同一冬凌草流浸膏(YKCJ130801)供试品溶液10μL，分别于0，1， 2，4，8小时进样，测定冬凌草甲素峰面积，从稳定性试验结果，见表17，得 出：RSD＝0.194％(n＝6)，表明冬凌草甲素在8小时内基本稳定。
表17稳定性实验结果
Figure BDA0002597714980000211
1.6.4回收率试验
精密称取已测定冬凌草甲素含量的冬凌草流浸膏(YKCJ130801)6份，每份约0.22g，置50ml量瓶中，分别精密加入冬凌草甲素对照品储备液5ml (0.3060mg/ml)，加甲醇至刻度，摇匀，用0.22μm滤膜过滤，取续滤液10μL， 按“1.2”项色谱条件测定，计算，结果见表18。
表18回收率实验
Figure BDA0002597714980000212
2正交试验优化生产工艺
2.1正交试验设计
本发明选取了提取物中主要有效成分冬凌草甲素的含量做考查指标，选用 L9(34)正交方案，考察了溶剂用量、溶剂的用量和提取时间3个因素，每个因素 3个水平，设计试验方案见表19至表20。
表19醇提工艺条件L9(34)因素水平表
Figure BDA0002597714980000221
表20醇提工艺条件L9(34)正交试验安排
Figure BDA0002597714980000222
2.2样品溶液的制备
将冬凌草药材切细，称取切细的冬凌草药材9份，每份50g，分别加入到圆 底三颈烧瓶中，搭回流装置，然后加乙醇进行回流提取，加入乙醇浓度为75％、 85％、95％，加入乙醇量按6倍(300ml)、8倍(400ml)、10倍(500ml)， 提取时间按1h、2h、3h；按正交试验表中的条件分别回流提取，过滤，收集滤 液并进行水浴锅上浓缩，浓缩大约到60ml后进行冷却，冷却后转移到100ml的 容量瓶中，加提取浓度的乙醇至刻度，得到冬凌草浸膏(0.5g/ml)，摇匀，转 移到密封瓶中贴标签，阴凉处放置备用。
2.3正交试验样品含量的测定
取正交实验制备的冬凌草流浸膏样品约0.5g，精密称定，置10ml量瓶中， 加甲醇至刻度，摇匀，用0.22μm滤膜过滤，取续滤液10μL，按“1.2”项色 谱条件测定，记录并计算冬凌草甲素的含量，结果见表21。
表21正交试验结果
Figure BDA0002597714980000231
3结果
表22正交试验结果直观分析
Figure BDA0002597714980000232
Figure BDA0002597714980000241
4讨论
以冬凌草甲素含量为指标，对冬凌草浸膏进行含量测定，提取条件的影响 从表3-1的结果可看出，各因素对试验指标的影响大小也不一致。因素A乙醇 浓度75％、85％、95％，三个浓度条件对产率的影响结果表明，乙醇浓度越高提 取率越高，同时浓度水平发生变动时，从水平极差R值看出该指标对试验指标 对提取率的影响较大；因素B加水倍数6倍、8倍、10倍，三个加水倍数10倍 时提取率最高，从水平极差R值看出该指标对提取率的影响较小。提取时间1h、 2h、3h，三个提取时间中1h最佳，从水平极差R值可看出该因素对提取率影响 较大。可以根据各个水平均数的极差R，来反映各因素发生变动时对试验指标影 响的大小。这样，本发明可以按各因素极差的大小，来排出影响试验指标的因 素主次顺序，在分清影响试验指标的因素主次顺序后，主要因素应取较好水平， 而次要因素，则可以根据成本、时间、收益等方面考虑。
5结论
本发明通过方法学研究，以ABC三因素设计正交试验得出的结果是，影响 提取效果的因素顺序为首次提取浓度＞提取时间＞加水倍数，最佳提取条件为 乙醇浓度95％，加水量为10倍，提取时间为1小时。该方法精密度高、重现 性好、操作简便，测定结果准确可靠，是一种高效、可行的质量评价技术。为 为咽康含片的质量控制提供了科学依据本发明为工业大批量生产提供参考数 据。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于 此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，凡在本发明 的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，都应涵盖在本发明的 保护范围之内。

Claims (7)

1.一种咽康含片的优化提取方法，其特征在于，所述咽康含片的优化提取方法包括：咽康含片水提优化方法以及咽康含片醇提优化方法；
所述咽康含片水提优化方法包括：
步骤一，称取玄参20g、麦冬20g、桔梗20g和甘草10g，加入一定量水，煎煮两次，合并煎液；
步骤二，将合并的煎液浓缩至60mL，移至100mL量瓶中并加水至刻度，即得咽康含片水提浸膏；
所述咽康含片醇提优化方法包括：
(1)将冬凌草药材切细，称取切细的冬凌草药材50g，加入到圆底三颈烧瓶中，搭回流装置；
(2)加乙醇进行回流提取，过滤，收集滤液并进行水浴锅上浓缩；
(3)浓缩到60ml后进行冷却，冷却后转移到100ml的容量瓶中，加提取浓度的乙醇至刻度，得到冬凌草浸膏。
2.如权利要求1所述咽康含片的优化提取方法，其特征在于，步骤一中，所述加入一定量水，煎煮两次，合并煎液包括：
加8倍水，第1次煎煮时间为3小时，过滤，收集滤液；再加入和8倍数的水进行第2次煎煮，第2次煎煮时间为2小时，过滤，合并滤液。
3.如权利要求1所述咽康含片的优化提取方法，其特征在于，步骤(2)中，所述加乙醇进行回流提取包括：
加入乙醇浓度为95％，加水量为10倍，提取时间为1小时。
4.如权利要求1所述咽康含片的优化提取方法，其特征在于，所述咽康含片的优化提取方法的HPLC法同时测定咽康含片中水提部分甘草苷、甘草酸铵、迷迭香酸和哈巴俄苷的测定方法包括：
1)制备甘草苷、甘草酸铵、迷迭香酸和哈巴俄苷的对照溶液；
2)制备缺甘草阴性样品以及缺玄参阴性样品；
3)制备测定样品；
4)分别吸取对照品溶液和测定品溶液进样，以SPD-20A检测器检测，选择230nm作为甘草苷、甘草酸铵、迷迭香酸和哈巴俄苷含量测定检测波长，并同时作为指纹图谱的检测波长。
5.如权利要求4所述咽康含片的优化提取方法，其特征在于，步骤1)中，所述对照溶液制备方法包括：
取甘草苷对照品5.33mg、甘草酸铵对照品9.90mg、哈巴俄苷对照品9.36mg和迷迭香酸对照品9.70mg，分别置于10ml容量瓶中，精密称定，加甲醇溶解并稀释至刻度，得储备液1、储备液2、储备液3和储备液4；分别精密吸取储备液1、2、3、4各1ml于5ml容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，得混合对照品标准溶液。
6.如权利要求4所述咽康含片的优化提取方法，其特征在于，步骤2)中，所述缺甘草阴性样品以及缺玄参阴性样品制备方法包括：
缺甘草阴性样品的制备：称取玄参20g、麦冬20g、桔梗20g，共60g，加入10倍量的水600mL进行煎煮，第1次煎煮时间为3小时，过滤，收集滤液，再加入10倍数的水进行第2次煎煮，第2次煎煮时间为2小时，过滤，合并滤液，浓缩至60mL左右，移至100mL量瓶中并加水至刻度，然后转移到密封瓶中贴标签，得到缺甘草阴性样品水提浸膏，放置备用；
缺玄参阴性样品的制备：称取麦冬20g、桔梗20g、甘草10g，共50g，加入10倍量的水500mL进行煎煮，第1次煎煮时间为3小时，过滤，收集滤液，再加入10倍水进行第2次煎煮，第2次煎煮时间为2小时，过滤，合并滤液，浓缩至60mL，移至100mL量瓶中并加水至刻度，然后转移到密封瓶中贴标签，得到缺玄参阴性样品水提浸膏，放置备用。
7.如权利要求4所述咽康含片的优化提取方法，其特征在于，步骤3)中，所述测定样品制备方法包括：
称取玄参20g、麦冬20g、桔梗20g和甘草10g，加入8倍水，进行煎煮，第1次煎煮时间为3小时，过滤，收集滤液，再加入8倍数的水进行第2次煎煮，第2次煎煮时间为2小时，过滤，合并滤液，浓缩至60mL，移至100mL量瓶中并加水至刻度，然后转移到密封瓶中贴标签，得到正交试验水提浸膏，放置备用。
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