CN109212082B - 一种复方罗汉果清肺制剂的含量检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于中药制剂检测领域,具体地说,涉及一种复方罗汉果清肺制剂的含量检测方法,所述含量检测方法为检测复方罗汉果清肺制剂中罗汉果皂苷V和木犀草苷的含量。本发明的有益效果为首次建立HPLC法同时测定复方罗汉果清肺制剂中罗汉果皂苷V和木犀草苷两个主要特征成分含量的方法。该方法分离效果好、操作简便、重复性好,可用于同时测定复方罗汉果清肺制剂中罗汉果皂苷V和木犀草苷的含量。
Description
技术领域
本发明属于中药制剂检测领域,具体地说,涉及一种复方罗汉果清肺制剂的含量检测方法。
背景技术
复方罗汉果清肺糖浆(颗粒)由罗汉果、枇杷叶、菊花、苦杏仁等6味中药组成,具有清热化痰,润肺止咳之功。用于咳嗽痰黄、咯痰不畅、咽干舌燥等证属痰热咳嗽者,取得良好临床效果。罗汉果为本方的君药,文献研究表明:葫芦烷三萜苷类成分是罗汉果主要的药效成分,其中罗汉果皂苷V(mogroside V)是罗汉果皂苷的主要成分之一,具有止咳祛痰等药理作用。药用菊花是菊科植物菊(Chrysanthemum morifolium Ramat.)的干燥头状花序。具有散风清热,平肝明目,清热解毒。菊花中黄酮类成分量较高,其中木犀草苷临床和药理作用明显,木犀草苷具有止咳、祛痰、平喘的作用。目前尚无对复方罗汉果清肺制剂进行含量检测的方法,质量的可控性差。
有鉴于此特提出本发明。
发明内容
本发明要解决的技术问题在于克服现有技术的不足,提供一种复方罗汉果清肺制剂的含量检测方法,采用该方法检测复方罗汉果清肺制剂的中的药效成分含量,精密度良好、重复性良好、稳定性良好。
为解决上述技术问题,本发明采用技术方案的基本构思是:
一种复方罗汉果清肺制剂的含量检测方法,所述含量检测方法为检测复方罗汉果清肺制剂中罗汉果皂苷V和木犀草苷的含量。
本发明的检测方法是针对复方罗汉果清肺制剂的含量检测方法,复方罗汉果清肺制剂中罗汉果皂苷V和木犀草苷是其重要的药效成分,本发明的检测方法首次实现了对罗汉果皂苷V和木犀草苷的分离和含量的测定,实现了对复方罗汉果清肺制剂的质量进行科学、精确和快速的检测,且以此作为药效成分控制复方罗汉果清肺制剂质量,具有较好的质量药效相关性。
复方罗汉果清肺制剂中罗汉果皂苷V含量为0.1964-0.2180mg/mL,木犀草苷含量为0.0366-0.0398mg/mL。
采用本发明的含量检测方法,罗汉果皂苷V和木犀草苷两个峰的峰形好、峰之间的分离度高,罗汉果皂苷V含量为0.1964-0.2180mg/mL,木犀草苷含量为0.0366-0.0398mg/mL时,具有较好的止咳、祛痰、平喘等效果。
所述的含量检测方法包括以下步骤:
1)对照品溶液的制备:取木犀草苷对照品、罗汉果皂苷V对照品适量,精密称定,加甲醇制成每1mL含木犀草苷0.04mg、罗汉果皂苷V 0.18mg的混合对照品溶液;
2)供试品溶液的制备:取复方罗汉果清肺制剂样品,加水溶解或加碱溶液调pH至中性,采用层析柱分离技术,依次采用水、体积分数为30%的乙醇洗脱,弃去洗脱液,再用体积分数为70%的乙醇洗脱,收集洗脱液,蒸干得到残渣,加甲醇适量使残渣溶解,转移至量瓶中,再加甲醇定容至刻度,摇匀,即得;
3)色谱条件
采用Waters Sunfire C18液相色谱柱;以乙腈-磷酸水为流动相进行梯度洗脱,流速:0.8mL/min;柱温:25℃;检测波长:210nm;进样量:10μL;
4)测定法
分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μL,注入液相色谱仪,进行测定,即得罗汉果皂苷V和木犀草苷的含量。
试验发现,在2)中的柱层析前,如果不调中性,会在HPLC图谱中出现强度很高的干扰峰,实验发现,通过改变梯度洗脱的流动相的配比或者改变流动相种类均无法消除该干扰峰的影响,可见,干扰成分与待测两组分在Waters Sunfire C18液相色谱柱上的洗脱能力相当,该干扰成分严重影响目标组分吸收峰的呈现和含量计算。本发明人通过大量的实验,发现在采用层析柱分离前,将复方罗汉果清肺糖浆加碱溶液调pH至中性,再经层析柱分离技术分离和液相色谱仪检测,该干扰峰消失。初步分析认为,干扰成分可能为一种酸性物质,经调至中性后转化为盐,并经层析柱后被洗脱掉,在采用液相色谱仪检测时,该干扰峰消失,对目标峰不再产生干扰。
2)中,调pH所用的碱可以为弱碱溶液;
优选地,弱碱溶液为氨水。
罗汉果皂苷V和木犀草苷均含有环状醚结构,试验发现,在调节pH时加入的碱的碱性如果过强,会造成环状结构开环或者形成异构体。此外,木犀草苷含有酚羟基,很容易与强碱发生反应结合生成盐,因此,强碱会对该成分的含量测定造成较大影响。本发明在调pH时,采用弱碱溶液,既能酸性干扰成分成盐,易于洗脱去除,消除该干扰成分在液相分离中对目标成分含量测定的影响,又不会对罗汉果皂苷V和木犀草苷的结构造成破坏,使检测结构更加准确。
氨水是一种常见的弱碱溶液,经试验证明,可用作复方罗汉果清肺制剂中罗汉果皂苷V和木犀草苷含量测定试验中调pH用,既可以消除干扰峰对待测成分的吸收峰的影响,又不会对罗汉果皂苷V和木犀草苷含量测定造成影响,且经氨水调pH后,样品的吸收峰的峰型有所改善。
3)中,所述梯度洗脱的流动相为乙腈-0.2%磷酸水。
实验发现,采用甲醇-水、乙腈-水或者乙腈-磷酸水均可作为流动相进行洗脱,但是,甲醇-水、乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸系统,基线波动较大,峰形不理想,以乙腈-0.2%磷酸水溶液为流动相梯度洗脱,峰形较好,出峰时间合适。
3)中,流动相的梯度为:0min→21min→41min→45min,流动相中乙腈的体积浓度变化为18%→20%→24%→24%,流动相中磷酸水的体积浓度变化为82%→80%→76%→76%。
优选地,流动相为乙腈-0.2%磷酸水,流动相梯度为:0min→21min→41min→45min,流动相中乙腈的体积浓度变化为18%→20%→24%→24%,流动相中0.2%磷酸水的体积浓度变化为82%→80%→76%→76%。
梯度的优势在于可以缩短洗脱时间、提高分离能力和改善峰型。本发明待测物质之一木犀草苷的吸收峰在以乙腈-0.2%磷酸水溶液为流动相时,在检测波长为210nm条件下,其前面有一个干扰峰,在乙腈浓度偏高时,木犀草苷吸收峰与干扰峰的分离度较差,另一方面,当乙腈浓度较低时,其洗脱时间会被延长。经试验得出,当乙腈浓度为18%→20%时,能将木犀草苷与干扰成分有效分离,呈现较好的峰形。为此,设定0-21min内乙腈浓度变化为18%→20%。在本发明的另一待测成分罗汉果皂苷V只有紫外末端吸收,在乙腈浓度20%→24%时,其他成分对其干扰较小,且在该条件下,相应成分均被洗脱。为此,设定210nm条件下,梯度为21→41min,乙腈浓度的变化20%→24%。上述流动相的梯度洗脱条件,使相邻峰之间的分离度均达到要求,空白对照溶液在供试品溶液中的木犀草苷和罗汉果皂苷V的出峰处无色谱峰出现,无干扰。
更优选地,木犀草苷的保留时间为20.069min,罗汉果皂苷V的保留时间为40.816min。
2)中,取复方罗汉果清肺制剂样品,加水溶解或加碱溶液调pH至中性,精密量取5mL,采用层析柱分离的洗脱过程包括:
以水20mL洗脱,弃去水液,再用体积分数为30%的乙醇15mL洗脱,弃去洗脱液,继续用体积分数为70%的乙醇20mL洗脱,收集洗脱液。
复方罗汉果清肺制剂是一种复方制剂,成分复杂,需要通过不同溶剂进行有效洗脱和除杂,以减少杂质成分对目标色谱峰形成的干扰。本实验中,先水洗,主要去除调pH后的苯甲酸盐,同时还可去除复方罗汉果清肺制剂中的糖及溶于水的强极性干扰成分。然后,再用体积分数30%的乙醇洗脱,去除复方罗汉果清肺制剂溶液中极性较强一点的杂质成分。最后考虑到木犀草苷和罗汉果皂苷V在体积分数70%乙醇溶液中有较好的溶解性,为此再用体积分数70%乙醇洗脱,以使收集的洗脱液主要为木犀草苷和罗汉果皂苷V。
最终,以水20mL洗脱,弃去水液,再用体积分数为30%的乙醇15mL洗脱,弃去洗脱液,继续用体积分数为70%的乙醇20mL洗脱,收集洗脱液,经以上操作既可以实现有效洗脱和去除杂质的目的,又能有效的将样品中木犀草苷和罗汉果皂苷V转移出来,保证样品中以上两个成分含量的有效测定。
1)和2)中,甲醇的体积分数为80%。
溶剂的选择既要考虑对样品的溶解性,又需考虑对样品色谱峰是否有影响,甲醇的体积分数为80%时,对木犀草苷和罗汉果皂苷V的溶解性较好,且对样品的色谱峰没影响。
层析柱为MCI GEL CHP 20/P120柱,Waters Sunfire C18液相色谱柱的规格为4.6mm×250mm,5μm;
优选地,MCI GEL CHP 20/P120柱的内径为1cm,柱高为10cm。
层析柱的选择,复方罗汉果清肺制剂含有大量的糖及水溶性成分,容易对目标色谱峰(罗汉果皂苷V和木犀草苷)的分离产生干扰,故考察了不同类型树脂的纯化效果,包括大孔吸附树脂柱D101、AB-8、NKA-9不同型号,SPE小柱以及MCI GEL CHP 20/P120柱,结合样品本身的性质以及不同色谱柱的性能,最终,选择MCI GEL CHP 20/P120柱能有效去除糖及其他水溶性干扰成分,对待测定成分分离、纯化效果最好。
复方罗汉果清肺制剂包括复方罗汉果清肺糖浆或复方罗汉果清肺颗粒。
采用上述技术方案后,本发明与现有技术相比具有以下有益效果:
1、本发明实现了应用层析柱分离技术HPLC法首次同步测定了复方罗汉果清肺制剂中的药效成分木犀草苷和罗汉果皂苷V,对复方罗汉果清肺制剂的检测和质量标准具有重要意义;
2、本发明的含量检测方法的空白对照溶液在木犀草苷和罗汉果皂苷V的出峰处无色谱峰出现,无干扰;木犀草苷和罗汉果皂苷V分别在0.1632-0.8160μg、0.7308-3.6540μg范围内呈良好的线性关系;混合对照品溶液连续进样6次,结果木犀草苷和罗汉果皂苷V峰面积的RSD均为0.44%,表明该仪器精密度良好;复方罗汉果清肺制剂样品溶液,分别在0、4、8、12、18、24h进样10μL,结果木犀草苷和罗汉果皂苷V峰面积的RSD分别为1.26%、0.80%,表明复方罗汉果清肺制剂在24h内稳定性良好。平行处理同一批次样品6份,结果木犀草苷和罗汉果皂苷V峰面积的RSD分别为1.28%、0.56%,表明该方法重复性良好;精密量取已知含量的同一批样品2.5mL,共6份,分别精密加入一定量的木犀草苷和罗汉果皂苷V对照品,按供试品溶液的方法制备,结果木犀草苷和罗汉果皂苷V平均加样回收率分别为96.30%、95.11%,RSD分别为2.28%、2.87%,结果表明该方法的回收率良好;
3、选择MCI GEL CHP 20/P120柱能有效去除复方罗汉果清肺制剂中的糖及其他水溶性成分的干扰,对目标成分分离、纯化效果最好。
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的描述。
附图说明
附图作为本发明的一部分,用来提供对本发明的进一步的理解,本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明,但不构成对本发明的不当限定。显然,下面描述中的附图仅仅是一些实施例,对于本领域普通技术人员来说,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图获得其他附图。在附图中:
图1是本发明复方罗汉果清肺制剂供试品溶液HPLC图;
图2是本发明混合对照品溶液HPLC图;
图3是本发明空白对照溶液HPLC图;
图4是本发明试验流动相体系为甲醇-水时HPLC图;
图5是本发明试验流动相体系为乙腈-水时HPLC图;
图6是本发明试验流动相体系为乙腈-0.1%磷酸水时HPLC图;
图7是本发明试验流动相梯度b时HPLC图;
图8是本发明试验流动相梯度c时HPLC图;
图9是本发明木犀草苷的标曲图;
图10是本发明罗汉果皂苷V的标曲图;
需要说明的是,这些附图和文字描述并不旨在以任何方式限制本发明的构思范围,而是通过参考特定实施例为本领域技术人员说明本发明的概念。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚,下面将结合本发明实施例中的附图,对实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述,以下实施例用于说明本发明,但不用来限制本发明的范围。
实施例一
一种复方罗汉果清肺糖浆的含量检测方法,包括以下步骤:
1)对照品溶液的制备:取木犀草苷对照品、罗汉果皂苷V对照品适量,加体积分数80%的甲醇制成每1mL含木犀草苷0.04mg、罗汉果皂苷V 0.18mg的混合对照品溶液;
2)供试品溶液的制备:
取复方罗汉果清肺糖浆样品10mL,加氨水适量,调pH至中性。精密量取5mL,通过MCI GEL CHP 20/P120柱(内径为1cm,柱高为10cm),以水20mL洗脱,弃去水液,再用体积分数30%的乙醇15mL洗脱,弃去洗脱液,继续用体积分数70%的乙醇20mL洗脱,收集洗脱液,蒸干,残渣加体积分数80%的甲醇适量使溶解,转移至5mL容量瓶中,定容至刻度,摇匀,即得;
3)色谱条件
采用Waters Sunfire C18色谱柱(4.6mm×250mm,5μm);以乙腈-0.2%磷酸水为流动相进行梯度洗脱,流动相梯度为:0min→21min→41min→45min,流动相中乙腈的体积浓度变化为18%→20%→24%→24%,流动相中0.2%磷酸水的体积浓度变化为82%→80%→76%→76%;流速:0.8mL/min;柱温:25℃;检测波长:210nm;进样量:10μL;
4)测定法
分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μL,注入液相色谱仪,进行测定,即得罗汉果皂苷V和木犀草苷的含量。
采用上述方法,对6批复方罗汉果清肺糖浆样品(分别是170111、170206、170302、170425、170506、170616)进行测定,记录峰面积,测定结果如下表所示:
表1样品测定结果(mg/mL)
上述六组样品得到的液相色谱图基本相同,以复方罗汉果清肺糖浆样品(170206)得到的液相色谱图(图1)为例,从液相色谱图可以得出,木犀草苷的保留时间为20.069min,罗汉果皂苷V的保留时间为40.816min。
从上述实验结果可以看出,采用上述方法检测的复方罗汉果清肺制剂中罗汉果皂苷V含量为0.1964-0.2180mg/mL,木犀草苷含量为0.0366-0.0398mg/mL。
实施例二
本实施例与实施例一的区别在于,本实施例中采用复方罗汉果清肺颗粒制备供试品溶液。
该含量检测方法与实施例一的区别在于,在2)供试品溶液的制备时,取复方罗汉果清肺颗粒7g,加水适量使溶解,加氨水调pH至中性,转移至10mL量瓶中,定容至刻度,摇匀,精密量取5mL,然后过柱,进行后续实验。
本实施例得到的实验结果与实施例一的液相谱图相似,实验结果相似。
实施例三
本实施例与实施例一的区别在于,调节pH的弱碱溶液为5%碳酸氢钠溶液。
本实施例得到的实验结果与实施例一的实验结果相似。
实验例1
1、仪器与试药
1.1仪器
1260系列高效液相色谱仪(美国安捷伦公司);Milli-Q Direct 8超纯水一体化系统(美国默克密理博公司);XP404S型电子天平(瑞士Mettler公司);数显式电热恒温水浴锅(HHS-21-4);循环水式多用真空泵(SHB-III);S7540-06型数控超声波清洗器(上海市必能信超声有限公司)。
1.2试药
罗汉果皂苷V(批号111754-201502);木犀草苷(批号111720-201609),均由中国食品药品检定研究院提供。乙腈为色谱纯(德国Merck公司),水为超纯水,其他试剂均为分析纯。
2、方法与结果
2.1对照品溶液的制备
取木犀草苷对照品、罗汉果皂苷V对照品适量,精密称定,加甲醇制成每1mL含木犀草苷0.04mg、罗汉果皂苷V 0.18mg的混合溶液,即得;
2.2供试品溶液的制备
取复方罗汉果清肺糖浆样品10mL,加氨水适量,调pH至中性。精密量取5mL,通过MCI GEL CHP 20/P120柱(内径为1cm,柱高为10cm),以水20mL洗脱,弃去水液,再用30%乙醇15mL洗脱,弃去洗脱液,继续用70%乙醇20mL洗脱,收集洗脱液,蒸干,残渣加80%甲醇适量使溶解,转移至5mL量瓶中,定容至刻度,摇匀,即得;
2.3液相色谱条件的选择
2.3.1流动相的选择
选择流动相时,先后考察甲醇-水、乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸水和乙腈-0.2%磷酸水系统,流动相选择为甲醇-水、乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸水体系时,液相色谱图依次为图4、图5、图6,流动相选择为乙腈-0.2%磷酸系统时,液相色谱图见图1。图4、图5、图6与图1相比,基线波动较大,影响含量测定,尤其在初始时间段内,多个峰出现重叠,目标峰出现拖尾,峰比较宽,峰形不理想,而以乙腈-0.2%磷酸水溶液为流动相梯度洗脱,目标峰与其前、后的峰均形成了较好的分离,目标峰的峰形较好,出峰时间合适。
2.3.2测定波长的选择
罗汉果皂苷V为葫芦烷三萜苷类,只有紫外末端吸收,而木犀草苷为黄酮苷类,其紫外最大吸收波长为350nm,经二极管阵列检测器(diode array detector,DAD)全波长扫描,结果显示在210nm处,各色谱峰均有较好的吸收,基线平稳。
2.3.3流动相梯度的选择
采用Waters Sunfire C18色谱柱(4.6mm×250mm,5μm),流动相为乙腈-0.2%磷酸水,流速:0.8mL/min;柱温:25℃;检测波长:210nm;进样量:10μL。
将供试品溶液在以下三组不同梯度的流动相下进行检测:
流动相梯度a为:流动相梯度为:0min→21min→41min→45min,流动相中乙腈的体积浓度变化为18%→20%→24%→24%,流动相中0.2%磷酸水的体积浓度变化为82%→80%→76%→76%;
流动相梯度b为:流动相梯度为:0min→19min→45min,流动相中乙腈的体积浓度变化为18%→20%→24%,流动相中0.2%磷酸水的体积浓度变化为82%→80%→76%;
流动相梯度c为:流动相梯度为:0min→20min→45min,流动相中乙腈的体积浓度变化为18%→20%→24%,流动相中0.2%磷酸水的体积浓度变化为82%→80%→76%。
流动相梯度a的实验结果见图1、流动相梯度b的实验结果见图7、流动相梯度c的实验结果见图8。
从上述实验的色谱图可以看出,流动相梯度为:0min→21min→41min→45min,流动相中乙腈的体积浓度变化为18%→20%→24%→24%,流动相中0.2%磷酸水的体积浓度变化为82%→80%→76%→76%的条件下,木犀草苷与前面干扰峰能够更好的分离,且在该条件下各吸收峰的峰型较好,具有较好的对称因子,能尽可能的与相近吸收峰进行分离;木犀草苷和罗汉果皂苷V吸收峰的分离度好,均达到要求;空白对照溶液在供试品溶液各主要色谱峰相应位置处无色谱峰出现,无干扰。
因此,液相色谱条件为Waters Sunfire C18色谱柱(4.6mm×250mm,5μm),流动相为乙腈-0.2%磷酸水,流速:0.8mL/min;柱温:25℃;检测波长:210nm;进样量:10μL,流动相梯度为:0min→21min→41min→45min,流动相中乙腈的体积浓度变化为18%→20%→24%→24%,流动相中0.2%磷酸水的体积浓度变化为82%→80%→76%→76%。
2.4供试品溶液的制备方法的考察
2.4.1制备过程的考察
组Ⅰ:取复方罗汉果清肺糖浆(170206)样品10mL,加氨水适量,调pH至中性。精密量取5mL,通过MCI GEL CHP 20/P120柱(内径为1cm,柱高为10cm)上,以水20mL洗脱,弃去水液,再用体积分数30%的乙醇15mL洗脱,弃去洗脱液,继续用体积分数70%的乙醇20mL洗脱,收集洗脱液,蒸干,残渣加体积分数80%的甲醇溶解,转移至5mL容量瓶中,定容至刻度,摇匀,即得。
组Ⅱ:与组Ⅰ的区别在于,取复方罗汉果清肺糖浆(170206)样品不加氨水调pH。
试验结果发现,组Ⅱ中不进行pH调节,谱图中出现了信号较强的干扰峰,严重影响了木犀草苷和罗汉果皂苷V的含量测定。
2.4.2层析柱的考察
组Ⅰ:取复方罗汉果清肺糖浆(170206)样品10mL,加氨水适量,调pH至中性。精密量取5mL,通过MCI GEL CHP 20/P120柱(内径为1cm,柱高为10cm),以水20mL洗脱,弃去水液,再用体积分数30%的乙醇15mL洗脱,弃去洗脱液,继续用体积分数70%的乙醇20mL洗脱,收集洗脱液,蒸干,残渣加体积分数80%的甲醇适量使溶解,转移至5mL容量瓶中,定容至刻度,摇匀,即得。
组Ⅱ:与组Ⅰ的区别在于,层析柱采用大孔吸附树脂柱D101。
组Ⅲ:与组Ⅰ的区别在于,层析柱采用大孔吸附树脂柱AB-8。
组Ⅳ:与组Ⅰ的区别在于,层析柱采用大孔吸附树脂柱NKA-9。
组Ⅴ:与组Ⅰ的区别在于,层析柱采用SPE小柱。
上述的试验结果显示,选用大孔吸附树脂柱D101、AB-8、NKA-9,和SPE小柱分离和纯化的效果均不太理想,还有少部分杂质影响样品的色谱峰,而组Ⅰ采用MCI GEL CHP 20/P120柱洗脱的,效果最为理想,处理得到样品的色谱峰的峰型最好。主要是因为MCI GELCHP 20柱是以吸附为主,不仅可以有效去除糖及其他水溶性干扰成分,而且对皂苷类(罗汉果皂苷V)、黄酮类(木犀草苷)成分分离、纯化效果好。
2.5方法学实验
2.5.1线性关系考察
精密吸取混合对照品溶液4μL,8μL,10μL,12μL,16μL,20μL,注入液相色谱仪,按照确定的色谱条件进行测试,记录峰面积。以峰面积(Y)为纵坐标,进样量(X)为横坐标进行线性回归,求得回归方程为:木犀草苷Y=136.8X+14.443(r=0.999 8);罗汉果皂苷V Y=24.072X+2.871 4(r=0.999 8)。结果见表2、图9-10。
表2 木犀草苷和罗汉果皂苷V的线性关系
结果表明,木犀草苷和罗汉果皂苷V分别在0.163 2~0.816 0μg、0.730 8~3.6540μg范围内呈良好的线性关系。
2.5.2精密度试验
取对照品溶液,按确定的色谱条件、测定法重复进样6次,每次进样10μL,记录峰面积。实验结果见表3。
表3 精密度试验
结果木犀草苷和罗汉果皂苷V峰面积的RSD均为0.44%,表明该方法精密度良好,结果见表3。
2.5.3稳定性试验
取供试品溶液(批号170206),按确定的色谱条件、测定法分别在制备后0h、4h、8h、12h、18h、24h时进样10μL,记录峰面积,结果见表4。
表4 稳定性试验
结果木犀草苷和罗汉果皂苷V峰面积的RSD分别为1.26%、0.80%,表明复方罗汉果清肺糖浆在24h内稳定性良好。
2.5.4重复性试验
按供试品溶液(批号170206)6份,按确定的色谱条件分别测定,每次进样10μL,记录峰面积。实验结果见表5。
表5 重复性试验
从上述实验结果可以看出,木犀草苷和罗汉果皂苷V峰面积的RSD分别为1.28%、0.56%,表明该方法重复性良好。
2.5.5加样回收率试验
精密量取供试品溶液(批号170206)2.5mL,共6份,分别精密加入一定量的木犀草苷和罗汉果皂苷V对照品,按供试品溶液的制备方法制备,按确定的色谱条件进样10μL,记录峰面积,计算平均加样回收率,
结果木犀草苷和罗汉果皂苷V平均加样回收率分别为96.30%、95.11%,RSD分别为2.28%、2.87%,结果表明该方法的回收率良好。
以上所述仅是本发明的较佳实施例而已,并非对本发明作任何形式上的限制,虽然本发明已以较佳实施例揭露如上,然而并非用以限定本发明,任何熟悉本专利的技术人员在不脱离本发明技术方案范围内,当可利用上述提示的技术内容作出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例,但凡是未脱离本发明技术方案的内容,依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰,均仍属于本发明方案的范围内。
Claims (8)
1.一种复方罗汉果清肺制剂的含量检测方法,其特征在于,所述含量检测方法为检测复方罗汉果清肺制剂中罗汉果皂苷V和木犀草苷的含量;所述复方罗汉果清肺制剂包括复方罗汉果清肺糖浆或复方罗汉果清肺颗粒;
所述的含量检测方法包括以下步骤:
1)对照品溶液的制备:取木犀草苷对照品、罗汉果皂苷V对照品适量,精密称定,加甲醇制成每1mL含木犀草苷0.04mg、罗汉果皂苷V 0.18mg的混合对照品溶液;
2)供试品溶液的制备:取复方罗汉果清肺制剂样品,加弱碱溶液调pH至中性,采用层析柱分离技术,依次采用水、体积分数为30%的乙醇洗脱,弃去洗脱液,再用体积分数为70%的乙醇洗脱,收集洗脱液,蒸干得到残渣,加甲醇适量使残渣溶解,转移至量瓶中,再加甲醇定容至刻度,摇匀,即得;
其中,所述层析柱为MCI GEL CHP 20/P120柱;
3)色谱条件
采用Waters Sunfire C18液相色谱柱;以乙腈-0.2%磷酸水为流动相进行梯度洗脱,流动相梯度为:0min→21min→41min→45min,流动相中乙腈的体积浓度变化为18%→20%→24%→24%,流动相中0.2%磷酸水的体积浓度变化为82%→80%→76%→76%;流速:0.8mL/min;柱温:25℃;检测波长:210nm;进样量:10μL;
4)测定法
分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μL,注入液相色谱仪,进行测定,即得罗汉果皂苷V和木犀草苷的含量。
2.根据权利要求1所述的含量检测方法,其特征在于,复方罗汉果清肺制剂中罗汉果皂苷V含量为0.1964-0.2180mg/mL,木犀草苷含量为0.0366-0.0398mg/mL。
3.根据权利要求1所述的含量检测方法,其特征在于,2)中,弱碱溶液为氨水。
4.根据权利要求1所述的含量检测方法,其特征在于,木犀草苷的保留时间为20.069min,罗汉果皂苷V的保留时间为40.816min。
5.根据权利要求1-4任一所述的含量检测方法,其特征在于,2)中,取复方罗汉果清肺制剂样品,加弱碱溶液调pH至中性,精密量取5mL,采用层析柱分离的洗脱过程包括:
以水20mL洗脱,弃去水液,再用体积分数为30%的乙醇15mL洗脱,弃去洗脱液,继续用体积分数为70%的乙醇20mL洗脱,收集洗脱液。
6.根据权利要求1-4任一所述的含量检测方法,其特征在于,1)和2)中甲醇的体积分数为80%。
7.根据权利要求1-4任一所述的含量检测方法,其特征在于,Waters Sunfire C18液相色谱柱的规格为4.6mm×250mm,5μm。
8.根据权利要求1-4任一所述的含量检测方法,其特征在于,MCI GEL CHP 20/P120柱的内径为1cm,柱高为10cm。
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