CN109270201B - 一种复方罗汉果清肺制剂的hplc特征图谱及其构建方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于药物成份鉴别和质量检测技术领域，具体地说，涉及一种复方罗汉果清肺制剂的HPLC特征图谱及其构建方法。所述的HPLC特征图谱包括10个特征峰，其中以4号峰木犀草苷为对照峰，其它9个特征峰的相对保留时间为：1号峰0.4345，2号峰0.4631，3号峰0.9312，5号峰1.2985，6号峰1.3391，7号峰1.4585，8号峰1.6630，9号峰1.9871，10号峰2.2534，各共有峰相对保留时间的RSD在0.09％～0.79％之间，均小于3.0％。本发明的有益效果为本发明首次建立了以处方药材特征性成分为基础的特征图谱，为复方罗汉果清肺制剂的质量标准的提升奠定基础。

Description

一种复方罗汉果清肺制剂的HPLC特征图谱及其构建方法

技术领域

本发明属于药物成份鉴别和质量检测技术领域，具体地说，涉及一种复方罗汉果清肺制剂的HPLC特征图谱及其构建方法。

背景技术

复方罗汉果清肺糖浆(颗粒)由罗汉果、枇杷叶、菊花、苦杏仁等6味中药组成，具有清热化痰，润肺止咳之功。用于咳嗽痰黄、咯痰不畅、咽干舌燥等证属痰热咳嗽者，取得良好临床效果。罗汉果为本方的君药,文献研究表明：葫芦烷三萜苷类成分是罗汉果主要的药效成分，其中罗汉果皂苷V(mogroside V)是罗汉果皂苷的主要成分之一，具有止咳祛痰等药理作用。药用菊花是菊科植物菊(Chrysanthemum morifolium Ramat.)的干燥头状花序。具有散风清热，平肝明目，清热解毒。菊花中黄酮类成分量较高,其中木犀草苷临床和药理作用明显，木犀草苷具有止咳、祛痰、平喘的作用。复方罗汉果清肺制剂现行标准包括罗汉果、菊花和枇杷叶药材的薄层鉴别项等内容，尚未建立谱效质量控制方法，不利于全面评价药品质量。

有鉴于此特提出本发明。

发明内容

本发明要解决的技术问题在于克服现有技术的不足，本发明提供一种复方罗汉果清肺制剂的HPLC特征图谱及应用；其次，本发明还提供了利用复方罗汉果清肺制剂的HPLC特征图谱对复方罗汉果清肺制剂进行质量检测的方法；最后，本发明还提供了上述HPLC特征图谱的构建方法。

通过以下技术方案来实现：

一种复方罗汉果清肺制剂的HPLC特征图谱，所述的HPLC特征图谱包括10个特征峰，其中以4号峰木犀草苷为对照峰，其它9个特征峰的相对保留时间为：1号峰0.4345，2号峰0.4631，3号峰0.9312，5号峰1.2985，6号峰1.3391，7号峰1.4585，8号峰1.6630，9号峰1.9871，10号峰2.2534。上述各共有峰的相对保留时间RSD依次为0.17％、0.79％、0.09％、0.16％、0.12％、0.20％、0.46％、0.32％、0.28％，各特征峰的相对保留时间RSD均小于0.8％。

所述的HPLC特征图谱的10个特征峰分别归属为：1号峰来自苦杏仁，2、8号峰来自罗汉果，3、4、5、6、7、9、10号峰来自菊花。

一种复方罗汉果清肺制剂的质量检测方法，所述的质量检测方法包括将待检测复方罗汉果清肺制剂的HPLC特征图谱与上述的复方罗汉果清肺制剂的HPLC特征图谱进行比较。

所述的质量检测方法包括如下步骤：

1)使用HPLC法得到待检测复方罗汉果清肺制剂的HPLC特征图谱，并使用木犀草苷为对照峰，计算各色谱峰的相对保留时间；

2)将步骤1)得到的相对保留时间与上述复方罗汉果清肺制剂的HPLC特征图谱中特征峰相对保留时间比较；

3)根据步骤2)的比较结果判断所述待检测复方罗汉果清肺制剂的质量是否符合标准；

优选地，3)中，根据步骤2)的比较结果判断所述待检测复方罗汉果清肺制剂中是否同时包含上述复方罗汉果清肺制剂的HPLC特征图谱中的10个特征峰，如果是，则符合标准，如果否，则不符合标准。

本发明提供的一种上述复方罗汉果清肺制剂的特征图谱的构建方法，所述的HPLC特征图谱的构建方法包括以下步骤：

(1)制备对照品溶液：称取苦杏仁苷对照品、木犀草苷对照品、罗汉果皂苷V对照品加甲醇溶解，制成每1ml含苦杏仁苷30μg、木犀草苷10μg、罗汉果皂苷V40μg的混合对照品溶液；

(2)制备供试品溶液：取复方罗汉果清肺制剂样品，加水溶解或加碱溶液调pH至中性，采用层析柱分离技术，依次采用水、稀乙醇洗脱，弃去洗脱液，再用体积分数为70％的乙醇洗脱，收集洗脱液，蒸干得到残渣，加甲醇溶解残渣，转移至量瓶中，定容至刻度，摇匀，即得；

(3)色谱条件：采用Waters Sunfire C₁₈液相色谱柱；以乙腈-磷酸水为流动相进行检测，流速：0.8mL/min；柱温：25℃；检测波长：210nm；进样量：10μL；

(4)特征图谱构建：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液，注入液相色谱仪，测定，即得复方罗汉果清肺制剂的HPLC特征图谱。

复方罗汉果清肺制剂现行标准包括罗汉果、菊花和枇杷叶药材的薄层鉴别项等内容，薄层鉴别误差大，外界因素对检测结果影响较大，且只能定性分析少量物质，对多种成分分析的操作复杂，目前尚未建立谱效质量控制方法，不利于全面评价药品质量。本发明首次建立了以复方罗汉果清肺制剂中的处方药材特征性成分为基础的特征图谱，为该产品的质量标准的提升奠定基础。

在采用液相色谱法对供试品溶液进行检测时，如果不调节pH，得到的色谱图的中会出现电信号极强的干扰峰，严重影响特征峰的峰形呈现和计算，通过大量的实验，发现通过加入碱将溶液调至中性后，该物质会转化为盐，在经过层析柱时被洗脱掉，不会对色谱图的其他特征峰造成影响，如果仅加碱，而不通过层析柱法将该盐洗脱掉，还会对其他特征峰造成影响，同时影响色谱柱的使用寿命。因此，采用碱液调pH和过柱法相结合的处理方式，使复方罗汉果清肺制剂的特征图谱更干净，特征峰峰形好、而且互不干扰，采用该特征谱图进行定性分析，检测结果更加准确。通过进一步的实验发现，该物质为防腐剂苯甲酸，加碱后与碱成盐。采用柱层析法操作简便、省时、选择性好。

所述供试品溶液的制备中，调pH至中性所用的碱溶液为弱碱溶液；

优选地，所用的弱碱溶液为氨水。

罗汉果皂苷V和木犀草苷均含有环状醚结构，试验发现，在调节pH时加入的碱的碱性如果过强，会造成环状结构开环或者形成异构体。此外，木犀草苷含有酚羟基，很容易与强碱发生反应结合生成盐，因此，强碱会对该成分的含量测定造成较大影响。实验发现，在调节pH时加入的碱的碱性如果过强，罗汉果皂苷V和木犀草苷的含量会有所降低，因此，本发明在调pH时，采用弱碱溶液，既能使苯甲酸成盐，易于洗脱去除，消除了苯甲酸在液相分离中对目标成分含量测定的干扰，又不会对罗汉果皂苷V和木犀草苷的结构造成破坏，使检测结构更加准确。

氨水是一种常见的弱碱溶液，经试验证明，可用作复方罗汉果清肺制剂中罗汉果皂苷V和木犀草苷含量测定试验中调pH用，既可以消除干扰峰对待测成分的吸收峰的影响，又不会对罗汉果皂苷V和木犀草苷含量测定造成影响，且经氨水调pH后，样品的吸收峰的对称性好。

所述供试品溶液的制备中，依次采用水、稀乙醇洗脱，弃去洗脱液，再用体积分数为70％的乙醇洗脱，收集洗脱液，蒸干得到残渣，加甲醇溶解残渣，转移至量瓶中，定容至刻度，摇匀，即得；

优选地，取复方罗汉果清肺制剂样品，加水溶解或加碱溶液调pH至中性，精密量取5ml，加至大孔吸附树脂柱D101上，以水20mL洗脱，弃去水液，再用体积分数为30％的乙醇20ml洗脱，弃去洗脱液，继续用体积分数为70％的乙醇20mL洗脱，收集洗脱液；蒸干后，取蒸干得到残渣，加体积分数为80％甲醇溶解，转移至5ml容量瓶中，定容至刻度，摇匀，即得。

复方罗汉果清肺制剂是一种复方制剂，成分复杂，需要通过不同溶剂进行有效洗脱和除杂，以减少杂质成分对目标色谱峰形成的干扰。本实验中，先水洗，有效可去除复方罗汉果清肺制剂溶液中的有机盐、糖及溶于水的强极性干扰成分。然后，再用体积分数30％的乙醇洗脱，去除复方罗汉果清肺制剂溶液中极性稍弱的杂质成分。最后考虑到木犀草苷和罗汉果皂苷V在体积分数70％乙醇溶液中有较好的溶解性，为此再用体积分数70％乙醇洗脱，以使收集的洗脱液主要为木犀草苷和罗汉果皂苷V。

采用体积分数为80％甲醇作为溶剂，复方罗汉果清肺制剂中的药效成分(苦杏仁苷、罗汉果皂苷V和木犀草苷)在该溶剂中的溶解度大，且对样品的其他色谱峰没影响。

所述色谱条件中，以乙腈-0.2％磷酸水为流动相进行梯度洗脱；

优选地，所述的梯度洗脱为:0min→10min→20min→47min→60min→90min→95min，流动相中乙腈的体积浓度变化为10％→13％→17％→20％→23％→26％→26％，流动相中0.2％磷酸水的体积浓度为90％→87％→83％→80％→77％→74％→74％；

更优选地，色谱柱为Waters Sunfire C₁₈色谱柱，规格为4.6mm×250mm，5μm。

实验发现，采用甲醇-水、乙腈-水或者乙腈-磷酸水均可作为流动相进行洗脱，但是，甲醇-水、乙腈-水、乙腈-0.1％磷酸系统，基线波动较大，峰形不理想，以乙腈-0.2％磷酸水溶液为流动相梯度洗脱，峰形较好，出峰时间合适。

梯度的优势在于可以缩短洗脱时间和提高各吸收峰之间的分离度，减少拖尾，改善峰型。分多段进行梯度洗脱，主要是为了更好的分开各个吸收峰，减少相互间的干扰，进而根据待分析样品中各种成分吸收峰的特性设定不同时间各流动相的比例。罗汉果、菊花和苦杏仁是复方罗汉果清肺制剂中用量较大的主要组成成分，也是在构建复方罗汉果清肺制剂检测方法时主要考量的因素。本发明采用的梯度，第一个梯度在乙腈低浓度时，可以有效平稳基线，在10min-20min过程中，按照本发明的梯度进行分离，提高乙腈浓度，可以将苦杏仁苷吸收峰与2号峰较好的分离，得到很好峰型的吸收峰，20min-95min过程中，按照本发明的梯度进行分离，提高乙腈浓度，可使3号峰和木犀草苷吸收峰分离，并根据菊花中各物质吸收峰的特性，逐步提高乙腈浓度，将各个物质吸收峰进行有效分离。

(2)中，柱层析技术中采用的层析柱为大孔吸附树脂柱D101；

优选地，所述大孔吸附树脂柱D101的内径为1cm、柱高为20cm。

采用大孔吸附树脂柱D101再生容易。采用大孔吸附树脂柱D101配以上述的梯度洗脱过程，能够将复方罗汉果清肺制剂中的有效成分更好的分开，是建立复方罗汉果清肺制剂的特征图谱的关键步骤，保证了复方罗汉果清肺制剂的特征图谱的准确性。

本发明研究考察了大孔吸附树脂柱D101、AB-8、NKA-9等型号，SPE小柱以及MCIGEL CHP 20/P120柱。实验发现，大孔吸附树脂柱D101对复方罗汉果清肺制剂分离洗脱效果最佳。这是因为，大孔吸附树脂柱D101是一种非极性吸附柱，根据类似物吸附类似物的原则，对溶剂中非极性或极性弱的有机物质具有较强的吸附作用，对中等剂型或强极性物质的吸附能力弱。复方罗汉果清肺制剂中含有大量的糖和其他强极性成分，大孔吸附树脂柱D101对其吸附能力差，容易被洗脱下来，苦杏仁苷、木犀草苷和罗汉果皂苷V等皂苷类、黄酮类化合物与大孔吸附树脂柱D101的极性相当，大孔吸附树脂柱D101对这类成分具有较好的选择吸附性能，难以被洗脱下来，为此，使用大孔吸附树脂柱D101容易去除掉复方罗汉果清肺制剂中含有大量的糖和其他强极性杂质成分。此外，大孔吸附树脂柱D101具多孔性结构而具筛选性，还可以通过表面吸附、表面电性或形成氢键而具吸附性等方式去除其他杂质成分，所以采用大孔吸附树脂柱D101分离纯化复方罗汉果清肺制剂的效果最佳。此外，还考虑到大孔吸附树脂柱D101对这类成分具有吸附快，解吸率高和洗脱率高的特点。

上述复方罗汉果清肺制剂的HPLC特征图谱在复方罗汉果清肺制剂的质量检测中的应用；

优选地，所述的复方罗汉果清肺制剂为复方罗汉果清肺糖浆或复方罗汉果清肺颗粒。

采用上述技术方案后，本发明与现有技术相比具有以下有益效果：

1、复方罗汉果清肺制剂现行标准包括罗汉果、菊花和枇杷叶药材的薄层鉴别项等内容，薄层鉴别误差大，只定性分析了其中少量物质，目前尚未建立谱效质量控制方法，不利于全面评价药品质量。本发明首次建立了以处方药材特征性成分为基础的特征图谱，为该产品的质量标准的提升奠定基础；

2、在制备供试品溶液的过程中，采用层析柱分离技术前，先将溶液调至中性(即pH＝7)，使其中干扰成分成盐，然后通过层析柱分离除去，以消除其干扰成分对待检测物质吸收峰的影响。调PH值使干扰成分成盐，再与柱层析结合是建立复方罗汉果清肺制剂的特征图谱的关键步骤，保证了复方罗汉果清肺制剂的特征图谱的准确性。

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的描述。

附图说明

附图作为本发明的一部分，用来提供对本发明的进一步的理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，但不构成对本发明的不当限定。显然，下面描述中的附图仅仅是一些实施例，对于本领域普通技术人员来说，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他附图。在附图中：

图1是本发明罗汉果清肺糖浆供试品、混合对照品和空白溶剂的HPLC图；

图2是本发明15批复方罗汉果清肺糖浆的HPLC图谱；

图3是本发明的复方罗汉果清肺制剂的特征图谱；

图4是本发明复方罗汉果清肺糖浆、菊花、罗汉果、苦杏仁对比复方罗汉果清肺制剂的特征图谱。

图中，峰1：苦杏仁苷 峰4：木犀草苷 峰8：罗汉果皂苷V。

需要说明的是，这些附图和文字描述并不旨在以任何方式限制本发明的构思范围，而是通过参考特定实施例为本领域技术人员说明本发明的概念。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例一：复方罗汉果清肺糖浆的HPLC特征图谱的构建

1仪器与试药

1.1仪器

1260系列高效液相色谱仪(美国安捷伦公司)；Milli-Q Direct 8超纯水一体化系统(美国默克密理博公司)；XP404S型电子天平(瑞士Mettler公司)；数显式电热恒温水浴锅(HHS-21-4)；循环水式多用真空泵(SHB-III)；S7540-06型数控超声波清洗器(上海市必能信超声有限公司)。

1.2试药

罗汉果皂苷V(批号111754-201502)；苦杏仁苷(批号110820-201607)；木犀草苷(批号111720-201609)，均由中国食品药品检定研究院提供。乙腈为色谱纯(德国Merck公司)，水为超纯水，其他试剂均为分析纯。

15批次的复方罗汉果清肺糖浆为桂林三金药业股份有限公司2016年3月至2017年9月留样样品。

2方法与结果

2.1对照品溶液的制备

取苦杏仁苷对照品、木犀草苷对照品、罗汉果皂苷V对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含苦杏仁苷30μg、木犀草苷10μg、罗汉果皂苷V40μg的混合对照品溶液。

2.2供试品溶液的制备

取复方罗汉果清肺糖浆10mL，加氨水适量，调pH至中性。精密量取5mL，通过大孔吸附树脂柱D101(内径为1cm，柱高为20cm)，以水20mL洗脱，弃去水液，再用体积分数为30％的乙醇20mL洗脱，弃去洗脱液，继续用体积分数为70％的乙醇20mL洗脱，收集洗脱液，蒸干得到残渣，加体积分数为80％甲醇溶解，转移至5mL容量瓶中，定容至刻度，摇匀，即得。

2.3色谱条件

采用Waters Sunfire C₁₈色谱柱(4.6mm×250mm，5μm)；以体积配比为乙腈-0.2％磷酸水为流动相进行梯度洗脱，流动相梯度为:0min→10min→20min→47min→60min→90min→95min，流动相中乙腈的体积浓度变化为10％→13％→17％→20％→23％→26％→26％，流动相中0.2％磷酸水的体积浓度为90％→87％→83％→80％→77％→74％→74％；流速:0.8ml/min；柱温:25℃；检测波长:210nm；进样量:10μL。

2.4方法学考察

2.4.1阴性干扰试验

以体积分数为80％的甲醇作为空白溶剂，取空白对照溶液和复方罗汉果清肺糖浆供试品溶液，按“2.3”项色谱条件进行测定，记录色谱图。结果显示，空白对照溶液在供试品溶液的各主要色谱峰相应位置处无色谱峰出现，不影响特征色谱峰的指认，空白对照溶液HPLC色谱图(如图1所示)。

2.4.2精密度试验

取同一批复方罗汉果清肺糖浆供试品，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.3”项色谱条件下重复进样6次，记录色谱图。以4号木犀草苷峰为对照峰S，结果各共有峰相对保留时间RSD在0.04％～0.49％之间，均小于2.0％，

2.4.3稳定性试验

取同一批样品，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.3”项色谱条件下分别在0、4、8、12、18、24h进样测定，记录色谱图。结果各共有峰相对保留时间的RSD在0.05％～0.49％之间，均小于2.0％，表明供试品溶液在24h内稳定性良好。

2.4.4重复性实验

取同一批样品，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.3”项色谱条件下进行测定，重复6次，记录色谱图。结果各共有峰相对保留时间的RSD在0.06％～0.49％之间，均小于2.0％，表明该方法重复性良好。

2.5特征图谱

2.5.1特征图谱的建立

精密吸取对照品溶液10μL，按“2.3”项色谱条件下进样分析，记录色谱图，得到对照品HPLC图谱；取复方罗汉果清肺糖浆样品适量，分别按“2.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.3”项色谱条件下进样分析，记录色谱图，得到复方罗汉果清肺糖浆的HPLC图谱(如图2所示R)。

2.5.2特征图谱中特征峰的标定

取15批复方罗汉果清肺糖浆供试品溶液，分别按“2.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.3”项色谱条件下进样分析，记录色谱图(如图2所示)，4号峰为对照品木犀草苷，出峰时间适中，峰形较好，含量相对较高，故选择以木犀草苷峰为对照峰S，分别对15批供试品溶液的共有峰的相对保留时间进行考察。

所述的HPLC特征图谱包括10个特征峰，其中以4号峰(木犀草苷)为对照峰，其它9个特征峰的相对保留时间为：1号峰0.4345，2号峰0.4631，3号峰0.9312，5号峰1.2985，6号峰1.3391，7号峰1.4585，8号峰1.6630，9号峰1.9871，10号峰2.2534，各共有峰相对保留时间的RSD在0.09％～0.79％之间(中药特征图谱要求小于3.0％)，本发明RSD<0.8％，说明精密度好。

将15批色谱图按照《中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012年版)》进行分析，选择稳定性、重复性好以及特征明显的色谱峰为共有峰，共标定10个共有峰，选定这10个峰进行峰匹配，建立了复方罗汉果清肺糖浆HPLC特征图谱(如图3所示)。

2.5.3共有色谱峰归属分析

取复方罗汉果清肺糖浆供试品、苦杏仁药材、罗汉果药材、菊花药材，苦杏仁药材、罗汉果药材、菊花药材制作提取液，按“2.2”项下方法制备复方罗汉果清肺糖浆供试品溶液、苦杏仁药材溶液、罗汉果药材溶液、菊花药材供试品溶液，在“2.3”项色谱条件下进样分析，通过各峰的保留时间和紫外光谱图对比分析，确定了共有色谱峰的归属。在图谱中指认的10个共有色谱峰中，其中1号峰来自苦杏仁，2、8号峰来自罗汉果，3、4、5、6、7、9、10号峰来自菊花(如图4所示)。

3其他条件选择

3.1检测波长的选择

对复方罗汉果清肺糖浆供试品溶液在190-400nm下进行二极管阵列检测器(diodearray detector,DAD)全波长扫描，结果显示在210nm处，各色谱峰均有较好的吸收，基线平稳。

3.2层析柱的选择

采用大孔吸附树脂柱D101、AB-8、NKA-9、SPE小柱以及MCI GEL CHP 20/P120层析柱，实验发现大孔吸附树脂柱AB-8、NKA-9、SPE小柱以及MCI GEL CHP 20/P120层析柱对皂苷类、黄酮类分离、纯化效果差，选择大孔吸附树脂柱D101洗去糖和其他水溶性成分，此柱对皂苷类、黄酮类分离、纯化效果较好。

本实验所建立复方罗汉果清肺糖浆HPLC特征图谱的方法，精密度、稳定性和重复性均符合特征图谱研究的技术要求，为制订复方罗汉果清肺糖浆的质量评价标准提供了科学依据。

上述建立复方罗汉果清肺糖浆HPLC特征图谱的方法中使用的复方罗汉果清肺糖浆也可更换为复方罗汉果清肺颗粒，在2.2中，取复方罗汉果清肺颗粒7g，加水适量使溶解，加氨水调pH至中性，转移至10mL量瓶中，定容至刻度，摇匀，精密量取5mL，然后过柱，进行后续实验。

采用复方罗汉果清肺颗粒所得到的HPLC特征图谱与采用复方罗汉果清肺糖浆所得到的HPLC特征图谱相同。

实施例二

本实施例与实施例一的区别在于，调节pH的弱碱溶液为5％碳酸氢钠溶液。

本实施例得到的复方罗汉果清肺糖浆的HPLC特征图谱与实施例一相同。

实施例三

准备待检测复方罗汉果清肺糖浆，其实际成分如下：

待检测品1 苦杏仁：菊花＝1:1(重量比)

待检测品2 罗汉果：菊花＝1:1(重量比)

待检测品3 苦杏仁：罗汉果：菊花＝1:1:1(重量比)

待检测品4 苦杏仁：罗汉果＝1:1(重量比)

利用实施例一得到的复方罗汉果清肺制剂的HPLC特征图谱，对上述待检测品进行质量检测，质量检测方法步骤如下：

1)将待检测品1、2、3、4按“2.2”项制备供试品溶液的方法进行处理，在“2.3”项色谱条件下进行HPLC法测定，记录色谱图，分别得到待检测品1、2、3、4的HPLC色谱图，并以木犀草苷为对照峰，计算各色谱峰的相对保留时间；

2)将步骤1)得到的相对保留时间与实施例一得到的复方罗汉果清肺制剂的HPLC特征图谱中特征峰的相对保留时间进行比较，结果见表5。

表5待检测品中的检测结果

特征峰	相对保留时间	待检测品1	待检测品2	待检测品3
					1号峰	0.4345	0.4345	——	0.4345
2号峰	0.4631	——	0.4631	0.4631
					3号峰	0.9312	0.9312	0.9312	0.9312
4号峰	1.00	1.00	1.00	1.00
					5号峰	1.2985	1.2985	1.2985	1.2985
6号峰	1.3391	1.3391	1.3391	1.3391
					7号峰	1.4585	1.4585	1.4585	1.4585
8号峰	1.6630	——	1.6630	1.6630
					9号峰	1.9871	1.9871	1.9871	1.9871
10号峰	2.2534	2.2534	2.2534	2.2534

从上述表格可以看出，待检测品1(苦杏仁和菊花)，具有苦杏仁的1号峰以及菊花的3、4、5、6、7、9、10号峰，表明：待检测品1的糖浆中不含有罗汉果，与实际成分相符。

待检测品2(罗汉果和菊花)，具有罗汉果的2、8号峰以及菊花的3、4、5、6、7、9、10号峰，表明：待检测品2的糖浆中不含有苦杏仁，与实际成分相符。

待检测品3(苦杏仁、罗汉果和菊花)，具有苦杏仁的1号峰，罗汉果的2、8号峰以及菊花的3、4、5、6、7、9、10号峰，表明：待检测品3的糖浆中含有苦杏仁、罗汉果和菊花，与实际成分相符。

待检测品4中没有4号峰，只存在1、2、8号峰，无法计算相对保留时间，实验表明：待检测品4的糖浆中含有苦杏仁、罗汉果，与实际成分相符。

以上结果，待检测品3符合复方罗汉果清肺制剂的质量标准，其他三组均不符合复方罗汉果清肺制剂的质量标准。

通过上述实验充分验证了，本发明得到的复方罗汉果清肺制剂的HPLC特征图谱，可以作为复方罗汉果清肺糖浆的质量检测，该检测方法简单、准确、有效。

实施例四

本实施例与实施例三的区别在于，本实施例中将待检测品1、待检测品2和待检测品3中的成分制成颗粒，质量检测方法的步骤1)中，在按“2.2”项制备供试品溶液时，取复方罗汉果清肺颗粒7g，加水适量使溶解，加氨水调pH至中性，转移至10mL量瓶中，定容至刻度，摇匀，精密量取5mL，其他步骤与实施例三相同。

所得的实验结果与实施例三的实验结果相同。通过上述实验充分验证了，本发明得到的复方罗汉果清肺制剂的HPLC特征图谱，可以作为复方罗汉果清肺颗粒的质量检测，该检测方法简单、准确、有效。

以上所述仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，虽然本发明已以较佳实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本专利的技术人员在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用上述提示的技术内容作出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明方案的范围内。

Claims (9)

1.一种复方罗汉果清肺制剂的HPLC特征图谱的构建方法，其特征在于，所述的HPLC特征图谱的构建方法包括如下步骤：

(1)制备对照品溶液：称取苦杏仁苷对照品、木犀草苷对照品、罗汉果皂苷V对照品加甲醇溶解，制成每1ml含苦杏仁苷30μg、木犀草苷10μg、罗汉果皂苷V40μg的混合对照品溶液；

(2)制备供试品溶液：取复方罗汉果清肺制剂样品，加碱溶液调pH至中性，采用层析柱分离技术，依次采用水、稀乙醇洗脱，弃去洗脱液，再用体积分数为70％的乙醇洗脱，收集洗脱液，蒸干得到残渣，加甲醇溶解残渣，转移至量瓶中，定容至刻度，摇匀，即得；

所述的复方罗汉果清肺制剂为复方罗汉果清肺糖浆或复方罗汉果清肺颗粒；

所述供试品溶液的制备中，调pH至中性所用的碱溶液为弱碱溶液；所述层析柱分离技术中采用的层析柱为大孔吸附树脂柱D101；

(3)色谱条件：采用Waters Sunfire C18液相色谱柱；以乙腈-磷酸水为流动相进行检测，流速：0 .8mL/min；柱温：25℃；检测波长：210nm；进样量：10μL；

所述色谱条件中，以乙腈-0 .2％磷酸水为流动相进行梯度洗脱，所述的梯度洗脱为:0min→10min→20min→47min→60min→90min→95min，流动相中乙腈的体积浓度变化为10％→13％→17％→20％→23％→26％→26％，流动相中0.2％磷酸水的体积浓度为90％→87％→83％→80％→77％→74％→74％；

(4)特征图谱构建：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液，注入液相色谱仪，测定，即得复方罗汉果清肺制剂的HPLC特征图谱。

2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所用的弱碱溶液为氨水或5％碳酸氢钠溶液。

3.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，取复方罗汉果清肺制剂样品，加弱碱溶液调pH至中性，精密量取5ml，加至大孔吸附树脂柱D101上，以水20mL洗脱，弃去水液，再用体积分数为30％的乙醇20ml洗脱，弃去洗脱液，继续用体积分数为70％的乙醇20mL洗脱，收集洗脱液；蒸干后，取蒸干得到残渣，加体积分数为80％甲醇溶解，转移至5ml容量瓶中，定容至刻度，摇匀，即得。

4.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，色谱柱规格为4.6mm×250mm，5μm。

5.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述大孔吸附树脂柱D101的内径为1cm、柱高为20cm。

6.一种如权利要求1-5任一所述的复方罗汉果清肺制剂的HPLC特征图谱的构建方法在复方罗汉果清肺制剂的质量检测中的应用。

7.一种复方罗汉果清肺制剂的质量检测方法，其特征在于，所述的质量检测方法包括：采用如权利要求1-5任一所述的构建方法得到待检测复方罗汉果清肺制剂的HPLC图谱，并将其与权利要求1-5任一所述的构建方法构建的复方罗汉果清肺制剂的HPLC特征图谱进行比较。

8.根据权利要求7所述的质量检测方法，其特征在于，所述的质量检测方法包括如下步骤：

1)使用HPLC法得到待检测复方罗汉果清肺制剂的HPLC图谱，并使用木犀草苷为对照峰，计算各色谱峰的相对保留时间；

2)将步骤1)得到的相对保留时间与权利要求1-5任一所述的构建方法构建的复方罗汉果清肺制剂的HPLC特征图谱中特征峰相对保留时间进行比较；

3)根据步骤2)的比较结果判断所述待检测复方罗汉果清肺制剂的质量是否符合标准。

9.根据权利要求8所述的质量检测方法，其特征在于，3)中，根据步骤2)的比较结果判断所述待检测复方罗汉果清肺制剂中是否同时包含如权利要求1-5任一所述的构建方法构建的复方罗汉果清肺制剂的HPLC特征图谱中的特征峰，如果是，则符合标准，如果否，则不符合标准。

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