CN108918721A - 一种款冬花中绿原酸含量的测定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种款冬花中绿原酸含量的测定方法，涉及中药活性成分含量测定技术领域。本发明绿原酸含量测定方法包括如下步骤：(1)款冬花经50％甲醇提取后过滤膜得测试溶液；(2)经高效液相色谱仪检测得化学图谱；(3)经分析标准品和供试品图谱中绿原酸的峰面积计算款冬花中绿原酸的含量。本发明样本前处理简单、方便、重现性好，且能准确反映款冬花药材的活性成分含量，该方法可用于款冬花药材的质量控制。
Description
技术领域
本发明涉及中药活性成分含量测定领域，特别涉及一种款冬花中绿原酸含量的测定方法。
背景技术
款冬花为我国传统中药材，具有润肺下气，止咳化痰的功效，含有苯丙素类、萜类、黄酮类、甾体类、生物碱、挥发油等成分。现行的《中国药典》仅以款冬酮含量作为款冬花药材质量评价的单一指标。前期研究发现以绿原酸为代表的酚酸类成分是款冬花止咳化痰的主要活性成分(Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis,2013,75,158-164)，应作为款冬花药材的质量控制指标。
已有文献(高效液相色谱法同时测定款冬花中芦丁、异槲皮苷、绿原酸的含量.吴笛等.中国中药杂志,2010,35(20):2722-2725；HPLC法测定款冬花中绿原酸和芦丁的含量.张文懿等.药物分析杂志,2008,28(12):2106-2108.)中绿原酸的含量测定方法均为多种成分同时测定，检测时间较长(25-70分钟)，而且由于同时测定多种成分，绿原酸与其保留时间相近的新绿原酸和隐绿原酸分离度较差，影响了绿原酸的准确测定。因此，为了准确评价款冬花药材质量，需要建立一种能准确测定款冬花中绿原酸含量的方法。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术存在的问题，提供一种能准确测定款冬花中绿原酸含量的方法。
本发明的目的通过如下技术方案实现：
一种款冬花中绿原酸含量的测定方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)对照品溶液的制备：取绿原酸对照品，精密称定，置棕色量瓶中，加入50％甲醇(体积浓度)，制成600μg/mL绿原酸对照品溶液；
(2)供试品溶液的制备：精密称取款冬花粉末1g，置具塞锥形瓶中，加入50％甲醇20mL，称定重量，超声处理30分钟，放置冷却至室温，用50％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液；
(3)分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各10μL，注入高效液相色谱仪，进行测定，所述液相色谱条件如下：
色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；柱温：25℃；紫外检测波长：327nm检测；流动相：体积比13：87的乙腈和0.4％磷酸的混合溶液；分析时间15min；
(4)采用外标一点法计算供试品款冬花中绿原酸的含量。
本发明所建立的款冬花绿原酸含量测定方法与现有技术相比具有如下优点和效果：1.样本前处理简单、快捷，重现性好；2.分析时间短；3.绿原酸与新绿原酸和隐绿原酸分离度较好，可准确测定绿原酸的含量。该方法可用于款冬花的药材质量评价。
附图说明
图1为不同提取溶剂得到的款冬花绿原酸液相图谱对比
图2为不同流动相条件下款冬花绿原酸液相图谱对比
图3为不同色谱柱考察结果
图4为不同液相仪器考察结果
图5为绿原酸含量测定标准曲线
图6为不同产地款冬花中绿原酸含量比较
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细、完整的说明。
各实施例中使用到的试剂和器材如下：
1仪器
Agilent 1260高效液相色谱仪(Agilent公司)，G1311C四元梯度泵，G1329B自动进样器，G1316A柱温箱，G1314F紫外检测器，超声波清洗器(KQ5200E，昆山市超声仪器有限公司)，色谱柱Venusil MP C18(250mm×4.6mm，5μm)。
2试剂
乙腈(色谱纯，Fisher公司)，甲醇(色谱纯，Fisher公司)，超纯水，磷酸(色谱纯，Fisher公司)，其余试剂均为分析纯。
实施例1供试品溶液制备条件及色谱条件的确定
1、供试品溶液制备方法的选择
六种不同供试品溶液制备方法比较：
方法一：精密称定款冬花粉末1g，置于具塞锥形瓶中，精密加入甲醇20mL，称定重量，超声提取半小时，放置冷却至室温，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，用0.22μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。
方法二：精密称定款冬花粉末1g，置于具塞锥形瓶中，精密加入乙醇20mL，称定重量，超声提取半小时，放置冷却至室温，用乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，用0.22μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。
方法三：精密称定款冬花粉末1g，置于具塞锥形瓶中，精密加入30％甲醇20mL，称定重量，超声提取半小时，放置冷却至室温，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，用0.22μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。
方法四：精密称定款冬花粉末1g，置于具塞锥形瓶中，精密加入50％甲醇20mL，称定重量，超声提取半小时，放置冷却至室温，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，用0.22μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。
方法五：精密称定款冬花粉末1g，置于具塞锥形瓶中，精密加入75％甲醇20mL，称定重量，超声提取半小时，放置冷却至室温，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，用0.22μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。
方法六：精密称定款冬花粉末1g，置于具塞锥形瓶中，精密加入50％甲醇20mL，称定重量，超声提取一小时，放置冷却至室温，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，用0.22μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。
通过不同溶剂(乙醇、甲醇)，不同提取时间(0.5h、1h)、不同体积分数甲醇(30％、50％、75％)对款冬花中绿原酸的提取效率考察结果比较显示：50％甲醇，料液比1:20，超声提取0.5h，款冬花中绿原酸的提取效率最高，即方法四中绿原酸峰面积最大，分离度较好，作为最终实验方法，如附图1所示。
2、分析时间的选择
对款冬花进行了30min的色谱图的测定，对款冬花进行了30min色谱图的测定，从色谱图可知，15min内绿原酸色谱峰完全洗脱，因此以上述洗脱条件等度洗脱15min。
3、检测波长的选择
以2015版《中国药典》对金银花、杜仲叶、茵陈等药材中绿原酸含量测定项下的检测波长为参照依据，作为款冬花中绿原酸的最大吸收波长。
4、流动相的选择
实验中共选择五种流动相系统(有机相和水相体积比均为13：87)：即甲醇-水系统、乙腈-水系统、乙腈-水(0.03％-甲酸)系统、乙腈-水(0.03％-乙酸)系统、乙腈-水(0.3％-磷酸)系统、乙腈-水(0.4％-磷酸)系统、乙腈-水(0.5％-磷酸)系统对款冬花进行高效液相色谱的测定。如附图2所示，甲醇-水系统与乙腈-水系统不能对绿原酸进行较好的检测，未检出绿原酸色谱峰；乙腈-0.03％乙酸水系统与乙腈-0.03％甲酸水系统中不能使绿原酸峰与邻近峰较好的分离，而乙腈-0.4％磷酸水系统中绿原酸可达到较好分离度，峰宽较窄且保留时间适中。
实施例2绿原酸含量测定方法学考察
下述实验的供试品溶液均采用如下方法制备：
取款冬花粉末(过四号筛)1.0g，加入50％甲醇20mL，超声提取0.5h，以50％甲醇补足损失重量，溶液过0.22μm微孔滤膜即得测试溶液。
耐用性试验：
采用拟定的方法，分别采用Agela Venusil MP C18(250mm×4.6mm,5μm)色谱柱、Agela Venusil XBP C18(250mm×4.6mm,5μm)色谱柱；Agela Venusil Plus C18(250mm×4.6mm,5μm)三根不同填料的色谱柱，以及Waters高效液相色谱仪、Agilent 1200高效液相色谱仪、Agilent1260高效液相色谱仪对同一样品进行测定，结果表明，绿原酸色谱峰在上述色谱柱下均达到较好分离。如附图3和附图4所示。
系统适用性试验：
在上述优选色谱条件下，理论塔板数N＝15181，分离度R＝3.19，对称因子f＝0.90。
线性范围试验：
取绿原酸标准品配置成浓度为0.1mg/mL、0.2mg/mL、0.4mg/mL、0.5mg/mL、0.8mg/mL、1.0mg/mL的溶液。分别吸取10μL，进样2次，取平均值作为该浓度平均峰面积。以浓度对峰面积进行线性回归，得线性方程：y＝29645x+194.93，r2＝0.9998的直线，表明绿原酸在0.1mg/mL～1.0mg/mL范围内具有线性良好。结果见表1和图5。
表1标准曲线结果
精密度试验：
取款冬花药材粉末(No.14)制备供试品溶液，连续进样6次，测定样品中绿原酸的峰面积，其同一供试品溶液绿原酸峰面积RSD＝0.19％，表明款冬花待测溶液通过高效液相色谱分析时，整个检测系统的精密度良好，结果见下表。
表2精密度试验结果(n＝6)
重复性试验：
精密称取款冬花药材粉末(No.14)，平行备样6份，进行高效液相色谱的测定，结果显示，6份供试品溶液中绿原酸峰面积的RSD＝1.01％，表明该方法重现性良好，结果见下表。
表3重复性试验结果(n＝6)
稳定性试验：
取款冬花药材粉末(No.14)制备供试品溶液，在0小时、2小时、4小时、8小时、12小时、24小时测定绿原酸峰的峰面积，结果显示，绿原酸峰面积的RSD＝1.25％，表明款冬花的待测溶液在24h内通过高效液相色谱分析稳定性良好，结果见下表。
表4稳定性试验结果(n＝6)
加样回收试验：
款冬花药材(No.14)作为加样回收试验样本，取0.5g该药材粉末进行重复性实验，所得绿原酸峰面积的平均值作为该药材中绿原酸含量的真实值，绿原酸的具体含量为0.2402mg/mL。按《中国药典》通则9101中药化学成分测定方法准确度项下要求，依据款冬花药材中绿原酸含量的50％、100％、150％分别加入对照品储备液，每个浓度下平行备样三份，按供试品制备方法四制成供试液，测定绿原酸含量，并依据如下公式计算绿原酸回收率及RSD，具体结果见表5。
表5回收率试验结果
实施例3不同产地款冬花液相绿原酸含量比较
利用上述建立的款冬花绿原酸含量测定条件对52批不同产地款冬花药材(表6)进行测定。
取款冬花粉末(过四号筛)1.0g，加入50％甲醇20mL，超声提取0.5h，以50％甲醇补足损失重量，溶液过0.22μm微孔滤膜，取续滤液即得待测液。以色谱柱Venusil MP(250mm×4.6mm，5μm)为固定相，按照如下液相条件进行测试：
紫外检测波长为327nm；柱温为25℃；进样量为10μL；流速为1mL/min；；以乙腈-0.4％磷酸水(13：87)为流动相；
采用外标一点法计算供试品款冬花中绿原酸的含量。
如表6和图6所示，款冬花中绿原酸含量范围在0.601％-1.845％之间。其中，不同产地款冬花中绿原酸的含量差异显著，其中山西沁县的款冬花样品含量最高(1.845％)、甘肃宁县的款冬花样品含量最低(0.601％)，含量最高者是含量最低者的3.07倍。山西省绿原酸平均含量最高；同时发现河北省款冬花各种植地区质量差异最小，而甘肃省作为现阶段款冬花的主要种植地区，各地区间质量差异最大。2017年样品中绿原酸平均含量最高，而2014年样品平均含量最低，推测可能原因为随储存时间的延长，款冬花药材绿原酸含量存在下降趋势。
表6不同产地款冬花药材信息及绿原酸含量测定结果表
Claims (1)
1.一种款冬花绿原酸含量的测定方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)对照品溶液的制备：取绿原酸对照品，精密称定，置棕色量瓶中，加入50％甲醇，制成600μg/mL绿原酸对照品溶液；
(2)供试品溶液的制备：精密称取款冬花粉末1g，置具塞锥形瓶中，加入50％甲醇20mL，称定重量，超声处理30分钟，放置冷却至室温，用50％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液；
(3)分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各10μL，注入高效液相色谱仪，进行测定，所述液相色谱条件如下：
色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；柱温：25℃；紫外检测波长：327nm检测；流动相：体积比13：87的乙腈和0.4％磷酸的混合溶液；分析时间15min；
(4)采用外标一点法计算供试品款冬花中绿原酸的含量。
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