CN102507769A - 一种金银花药材及其制剂中绿原酸和三种异绿原酸的定量测定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种金银花药材及其制剂中绿原酸和三种异绿原酸的定量测定方法。其特征:首次采用普通的等度洗脱,以体积比为15~14∶6.5~6∶78.5~80的乙腈-甲醇-0.1%磷酸为流动相,在326±2nm处,同时测定了金银花药材及其制剂中绿原酸和三种异绿原酸的含量。方法简便、快捷,易于普及掌握;在三种不同的色谱柱上,四种成分的定量色谱图,各波峰分离良好,基线平稳,在20~30分钟内出峰完毕。与梯度洗脱比较,仪器成本大幅度降低,方法普及率提高,测定时间减少。本发明为多指标评价金银花药材及其制剂质量提供了测定方法与参考数据。
Description
技术领域
本发明涉及一种金银花药材及其制剂中绿原酸和三种异绿原酸的定量测定方法。
背景技术
金银花为忍冬科植物Lonicera japonica Thunb.的干燥花蕾或带初开的花。是一种常用中药,具清热解毒,疏散风热的功效。用于痈肿疔疮,喉痹,丹毒,热毒血痢,风热感冒,温病发热。制剂系指含蔗糖的和不含蔗糖的小儿咽扁颗粒,为小儿用药,是中国药典2010年版一部收载的品种,具清热利咽,解毒止痛的功效。用于小儿肺卫热盛所致的喉痹、乳蛾,症见咽喉肿痛、咳嗽痰盛、口舌糜烂;急性咽炎、急性扁桃腺炎见上述证候者。不含蔗糖的小儿咽扁颗粒处方及制法如下:
处方:金银花 218.8g 射干 125g 金果榄 156.2g
桔梗 156.2g 玄参 156.2g 麦冬 156.2g
人工牛黄 0.62g 冰片 0.32g
制法:以上八味,除人工牛黄、冰片外,其余金银花等6味加水煎煮二次,第一次2.5小时,第二次1.5小时,滤过,滤液合并,减压浓缩至相对密度为1.32~1.35(50℃),加入甜菊素约18g、适量糊精及人工牛黄,混匀,制成颗粒,干燥,加入冰片,混匀,制成1000g,即得。
含蔗糖的小儿咽扁颗粒处方及制法如下:
处方:金银花 109.4g 射干 62.5g 金果榄 78.1g
桔梗 78.1g 玄参 78.1g 麦冬 78.1g
人工牛黄 0.31g 冰片 0.16g
制法:以上八味,除人工牛黄、冰片外,其余金银花等6味加水煎煮二次,第一次2.5小时,第二次1.5小时,滤过,滤液合并,减压浓缩至相对密度为1.32~1.35(50℃),加入蔗糖700~800g、适量糊精及人工牛黄,混匀,制成颗粒,干燥,加入冰片,混匀,制成1000g。
文献报道,金银花的主要有效成分有绿原酸类,即绿原酸、隐绿原酸、新绿原酸等;异绿原酸类,即异绿原酸A、B、C等;黄酮类,即木犀草苷、木犀草素等。在金银花药材中含量最高的是绿原酸,可高达5.19%;其次是异绿原酸A,可达2%;黄酮类的木犀草苷含量最低,药典规定不得少于0.05%。上述成分都具有较强的抗菌、消炎与解热镇痛作用。在中国药典2010年版一部金银花药材项下,收载了绿原酸和木犀草苷的含量测定,前者是采用等度洗脱,后者是采用梯度洗脱。本发明人员在探讨绿原酸、异绿原酸和木犀草苷的含量测定中,从测定图谱得知木犀草苷的含量远较绿原酸和异绿原酸A低得多,既便在木犀草苷最大波长348nm处(绿原酸的非最大波长)测定,木犀草苷的波峰面积也仅为绿原酸的1/63,异绿原酸A的1/42。由于金银花药材中木犀草苷的含量太低,投料到复方制剂中后,加上提取率以及其他药味的成分干扰,其波峰是不能检出的,所以在制剂中目前都是以单一的绿原酸为指标,进行定量测定的。查阅到一些金银花药材及其提取物的指纹图谱报道,但都是梯度洗脱方式,以绿原酸为参照物,计算多种峰的相对保留时间和相对峰面积比值的,无法得到定量数值和限度规定。还未查阅到以等度洗脱的方式,同时测定金银花药材及其制剂中绿原酸和三种异绿原酸含量报道的文献。绿原酸和异绿原酸类都是金银花的有效成分,其光谱扫描图基本相同(见图1、图2、图3、图4),且异绿原酸A、B、C的含量之和约为绿原酸的70~110%,所以只测定绿原酸,无法正确评价药材与制剂的整体质量。但异绿原酸A、B、C的含量比例,在药材和制剂中差异较大,在药材中绿原酸A的含量最高,绿原酸C的含量极微;而在制剂中三者的含量比例相差不大,应是提取过程中由A转变而成。
在上述背景情况下,为简便、快捷、科学、规范、多指标控制药材与其制剂的质量,发明了金银花药材及其制剂中绿原酸和三种异绿原酸的定量测定方法。
发明内容
首次采用普通的等度洗脱,以体积比为15~14∶6.5~6∶78.5~80的乙腈-甲醇-0.1%磷酸为流动相,在326±2nm处,同时测定了金银花药材及其制剂中绿原酸和三种异绿原酸A、B、C的含量。方法简便、快捷,易于普及掌握;在三种不同的色谱柱上,四种成分的定量色谱图,各波峰分离良好,基线平稳,在20~30分钟内出峰完毕。
通过方法学考察,绿原酸的进样量在0.0542~1.355μg,与峰面积呈良好的线性关系(见图5),回归方程为:Y=3051617.7X-4337,γ=0.99998;异绿原酸A进样量在0.022~0.44μg,与峰面积呈良好的线性关系(见图6),回归方程为:Y=2881764.6X-3951,γ=0.99999;异绿原酸B进样量在0.0316~0.5056μg,与峰面积呈良好的线性关系(见图7),回归方程为:Y=3034728X-6113,γ=0.99996;异绿原酸C进样量在0.05346~0.6415μg,与峰面积呈良好的线性关系(见图8),回归方程为:Y=1906873.4X+1562,γ=0.99994。采用加样回收实验,结果表明:绿原酸的平均回收率为99.12%(n=9),RSD为0.94%(见表1);异绿原酸A的平均回收率为99.45%(n=9),RSD为1.67%(见表2)。异绿原酸B的平均回收率为99.16%(n=9),RSD为1.70%(见表3);异绿原酸C的平均回收率为99.19%(n=9),RSD为1.68%(见表4)。精密度(见表5)、稳定性(见表6)、重复性(见表7)、专属性(见图9.10.11.12.13)与柱耐用性(见表8、图14.15.16.)实验均符合方法学要求。适用于金银花药材及其制剂中绿原酸和三种异绿原酸的定量测定。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案为:
1.色谱条件与系统适用性试验色谱条件与系统适用性试验以体积比为15~14∶6.5~6∶78.5~80的乙腈-甲醇-0.1%磷酸为流动相;柱温:40℃;检测波长为326nm;理论板数按绿原酸A峰计算应不低于2000;
2.对照品溶液的制备分别取绿原酸、异绿原酸A、异绿原酸B、异绿原酸C对照品适量,精密称定,置棕色量瓶中,加甲醇制成每1ml含绿原酸40μg,异绿原酸A、异绿原酸B、异绿原酸C各为5~20μg的溶液,作为对照品溶液;
3.供试品溶液的制备取金银花药材细粉0.1~0.15g或金银花制剂0.5~1.0g,分别精密称定,置具塞锥形瓶中,精密加入70%甲醇25ml,密塞,称定重量,以功率250W,频率33kHz超声处理10~30分钟,放冷,再称定重量,用70%甲醇补足减失的重量,摇匀,滤纸滤过,取续滤液再用0.45μm的微孔滤膜滤过,取续滤液作为供试品溶液;
4.测定法分别精密吸取上述对照品溶液与供试品溶液各5~15μl,注入液相色谱仪,测定绿原酸和三种异绿原酸的含量。
对于金银花药材优选的测定技术方案为:
1.色谱条件与系统适用性试验以体积比为15∶6.5∶78.5的乙腈-甲醇-0.1%磷酸为流动相;柱温:40℃;检测波长为326nm;理论板数按绿原酸A峰计算应不低于2000;
2.对照品溶液的制备分别取绿原酸、异绿原酸A、异绿原酸B、异绿原酸C对照品适量,精密称定,置棕色量瓶中,加甲醇制成每1ml含绿原酸40μg、异绿原酸A20μg、异绿原酸B10μg、异绿原酸C5μg的溶液,作为对照品溶液;
3.供试品溶液的制备取金银花药材细粉0.1g,精密称定,置具塞锥形瓶中,精密加入70%甲醇25ml,密塞,称定重量,以功率250W,频率33kHz超声处理30分钟,放冷,再称定重量,用70%甲醇补足减失的重量,摇匀,滤纸滤过,取续滤液再用0.45μm的微孔滤膜滤过,取续滤液作为供试品溶液;
4.测定法分别精密吸取上述对照品溶液与供试品溶液各5μl,注入液相色谱仪,测定绿原酸和三种异绿原酸的含量。
对于无蔗糖的小儿咽扁颗粒优选的测定技术方案为:
1.色谱条件与系统适用性试验以体积比为14.5∶6.3∶79.2的乙腈-甲醇-0.1%磷酸为流动相;柱温:40℃;检测波长为326nm;理论板数按绿原酸A峰计算应不低于2000;
2.对照品溶液的制备分别取绿原酸、异绿原酸A、异绿原酸B、异绿原酸C对照品适量,精密称定,置棕色量瓶中,加甲醇制成每1ml含绿原酸40μg,异绿原酸A、异绿原酸B、异绿原酸C各为12μg的溶液,作为对照品溶液;
3.供试品溶液的制备取无蔗糖的小儿咽扁颗粒0.5g,精密称定,置具塞锥形瓶中,精密加入70%甲醇25ml,密塞,称定重量,以功率250W,频率33kHz超声处理10分钟,放冷,再称定重量,用70%甲醇补足减失的重量,摇匀,滤纸滤过,取续滤液再用0.45μm的微孔滤膜滤过,取续滤液作为供试品溶液;
4.测定法分别精密吸取上述对照品溶液5μl、供试品溶液15μl,注入液相色谱仪,测定绿原酸和三种异绿原酸的含量。
对于含蔗糖的小儿咽扁颗粒优选的测定技术方案为:
1.色谱条件与系统适用性试验以体积比为14∶6∶80的乙腈-甲醇-0.1%磷酸为流动相;柱温:40℃;检测波长为326nm;理论板数按绿原酸A峰计算应不低于2000;
2.对照品溶液的制备分别取绿原酸、异绿原酸A、异绿原酸B、异绿原酸C对照品适量,精密称定,置棕色量瓶中,加甲醇制成每1ml含绿原酸40μg,异绿原酸A、异绿原酸B、异绿原酸C各为12μg的溶液,作为对照品溶液;
3.供试品溶液的制备含蔗糖的小儿咽扁颗粒1.0g,精密称定,置具塞锥形瓶中,精密加入70%甲醇25ml,密塞,称定重量,以功率250W,频率33kHz超声处理10分钟,放冷,再称定重量,用70%甲醇补足减失的重量,摇匀,滤纸滤过,取续滤液再用0.45μm的微孔滤膜滤过,取续滤液作为供试品溶液;
4.测定法分别精密吸取上述对照品溶液5μl、供试品溶液15μl,注入液相色谱仪,测定绿原酸和三种异绿原酸的含量。
本发明的原理如下:
绿原酸及异绿原酸类,都是咖啡酰与奎宁酸在不同的位置,以不同的咖啡酰数目,结合形成的酯(也称缩酚酸),易溶于含水醇。所以直接以含水甲醇超声提取药材或制剂中的绿原酸及异绿原酸类,滤过后,进样即可。无萃取、无蒸干、简便、快捷、实用。通过调整乙腈、甲醇与0.1%磷酸的体积比,使四种成分在不同的色谱柱上,20~30分钟内出峰完毕。再依据四种成分的进样量在一定范围内,与其峰面积呈现良好的线性关系,而用于定量测定。
本发明的创新点及有益效果如下:
(1)首次采用普通等度洗脱、反相色谱柱,以体积比为15~14∶6.5~6∶78.5~80的乙腈-甲醇-0.1%磷酸为流动相;同时测定了金银花药材及其制剂小儿咽扁颗粒中的绿原酸及三种异绿原酸的含量。通过调整流动相的比例,使四种成分的定量色谱图,在三种不同的色谱柱上,20~30分钟出峰完毕,各波峰分离良好。比梯度洗脱节约2/5时间,实现了简便、快捷、科学、规范、多指标控制药材与其制剂质量的愿望。
(2)在绿原酸及异绿原酸的含量上,本方法与已报道的梯度洗脱法相比,对仪器的性能要求降低,不必再配备带梯度洗脱的高效液相色谱仪,只要有一台普通的紫外检测高效液相色谱仪,即可顺利进行四成分的定量测定,测定成本大幅度降低。
(3)不但测定成本降低,还使3种异绿原酸的分离度提高到3以上,远优于专利文献(专利申请号:200610145989.0)的分离度(见图12、17),且基线平稳,波峰的重现性好。
(4)从同一样品,同一色谱柱,相同进样量的波峰面积数值得知,文献报道的梯度洗脱条件,异绿原酸C包含有杂质峰,影响了含量测定的准确性。数据结果见表9。
(5)本发明方法的问世,解决了金银花药材及小儿咽扁颗粒中绿原酸及三种异绿原酸简便、快捷、低成本测定的难题,实现了多成分、多指标、综合判断药品质量的目的。还为含金银花药材的其他制剂,提供了多指标定量测定的新途径,具表帅与示范作用。
附图说明
图1绿原酸峰的光谱扫描图
图2异绿原酸A峰的光谱扫描图
图3异绿原酸B峰的光谱扫描图
图4异绿原酸C峰的光谱扫描图
图5绿原酸的线性关系图
图6异绿原酸A的线性关系图
图7异绿原酸B的线性关系图
图8异绿原酸C的线性关系图
图9为绿原酸、异绿原酸A、B、C对照品HPLC色谱图
图10为金银花药材HPLC色谱图
图11为无蔗糖的小儿咽扁颗粒HPLC色谱图
图12为含蔗糖的小儿咽扁颗粒HPLC色谱图
图13为小儿咽扁颗粒空白样品的HPLC色谱图
图14耐用性试验-岛津ODS-SP柱(4.6×150mm)的样品HPLC色谱图
图15耐用性试验-迪马dimonsil柱(4.6×150mm)的样品HPLC色谱图
图16耐用性试验-岛津ODS-VP柱(4.6×150mm)的样品HPLC色谱图
图17采用专利梯度洗脱条件,测定的含蔗糖小儿咽扁颗粒HPLC色谱图
图1、图2、图3、图4中所扫描的波峰来自于图9,其保留时间(分钟)分别为:3.67、11.82、13.67、19.58
图5、图6、图7、图8中,纵坐标为峰面积;横坐标为进样量(μg)
图9~图17中,1为绿原酸峰,2为异绿原酸C峰,3为异绿原酸A峰,4为异绿原酸B峰
本发明具体实施方式
实施例1:
1.色谱条件与系统适用性试验以体积比为15∶6.5∶78.5的乙腈-甲醇-0.1%磷酸为流动相;柱温:40℃;检测波长为326nm;理论板数按绿原酸峰计算应不低于2000;
2.对照品溶液的制备分别取绿原酸、异绿原酸A、异绿原酸B、异绿原酸C对照品适量,精密称定,置棕色量瓶中,加甲醇制成每1ml含绿原酸40μg、异绿原酸A20μg、异绿原酸B10μg、异绿原酸C5μg的溶液,作为对照品溶液;
3.供试品溶液的制备取金银花药材细粉0.1g,精密称定,置具塞锥形瓶中,精密加入70%甲醇25ml,密塞,称定重量,以功率250W,频率33kHz超声处理30分钟,放冷,再称定重量,用70%甲醇补足减失的重量,摇匀,滤纸滤过,取续滤液再用0.45μm的微孔滤膜滤过,取续滤液作为供试品溶液;
4.测定法分别精密吸取上述对照品溶液与供试品溶液各5μl,注入液相色谱仪,测定绿原酸和三种异绿原酸的含量。测定了市售3批金银花药材含量,结果见表10。
实施例2:
1.色谱条件与系统适用性试验以体积比为14.5∶6.3∶79.2的乙腈-甲醇-0.1%磷酸为流动相;柱温:40℃;检测波长为326nm;理论板数按绿原酸A峰计算应不低于2000;
2.对照品溶液的制备分别取绿原酸、异绿原酸A、异绿原酸B、异绿原酸C对照品适量,精密称定,置棕色量瓶中,加甲醇制成每1ml含绿原酸40μg,异绿原酸A、异绿原酸B、异绿原酸C各为12μg的溶液,作为对照品溶液;
3.供试品溶液的制备取无蔗糖的小儿咽扁颗粒0.5g,精密称定,置具塞锥形瓶中,精密加入70%甲醇25ml,密塞,称定重量,以功率250W,频率33kHz超声处理10分钟,放冷,再称定重量,用70%甲醇补足减失的重量,摇匀,滤纸滤过,取续滤液再用0.45μm的微孔滤膜滤过,取续滤液作为供试品溶液;
4.测定法分别精密吸取上述对照品溶液5μl、供试品溶液各15μl,注入液相色谱仪,测定绿原酸和三种异绿原酸的含量。测定了市售3批无蔗糖的小儿咽扁颗粒含量,结果见表10。
实施例3:
1.色谱条件与系统适用性试验以体积比为14∶6∶80的乙腈-甲醇-0.1%磷酸为流动相;柱温:40℃;检测波长为326nm;理论板数按绿原酸A峰计算应不低于2000;
2.对照品溶液的制备分别取绿原酸、异绿原酸A、异绿原酸B、异绿原酸C对照品适量,精密称定,置棕色量瓶中,加甲醇制成每1ml含绿原酸40μg,异绿原酸A、异绿原酸B、异绿原酸C各为12μg的溶液,作为对照品溶液;
3.供试品溶液的制备含蔗糖的小儿咽扁颗粒1.0g,精密称定,置具塞锥形瓶中,精密加入70%甲醇25ml,密塞,称定重量,以功率250W,频率33kHz超声处理10分钟,放冷,再称定重量,用70%甲醇补足减失的重量,摇匀,滤纸滤过,取续滤液再用0.45μm的微孔滤膜滤过,取续滤液作为供试品溶液;
4.测定法分别精密吸取上述对照品溶液5μl、供试品溶液各15μl,注入液相色谱仪,测定绿原酸和三种异绿原酸的含量。测定了市售3批含蔗糖的小儿咽扁颗粒含量,结果见表10。
表1 小儿咽扁颗粒中绿原酸的回收率试验结果
表2 小儿咽扁颗粒中异绿原酸A的回收率试验结果
表3 小儿咽扁颗粒中异绿原酸B的回收率试验结果
表4 小儿咽扁颗粒中异绿原酸C的回收率试验结果
表5 样品精密度实验结果(峰面积)
表6 样品稳定性实验结果(峰面积)
表7 重复性试验结果
表8 耐用性试验~不同色谱柱对同一样品的含量测定结果(mg/g)
表9 同一样品同一色谱柱相同进样量,本发明与专利文献的峰面积值比较
表10 金银花药材和小儿咽扁颗粒的含量测定结果(mg/g)
注:无蔗糖小儿咽扁颗粒一袋装4g,与含蔗糖小儿咽扁颗粒一袋8g含生药量相同。
Claims (5)
1.一种金银花药材及其制剂中绿原酸和三种异绿原酸的定量测定方法,其特征在于:
(1)色谱条件与系统适用性试验以体积比为15~14∶6.5~6∶78.5~80的乙腈-甲醇-0.1%磷酸为流动相;柱温:40℃;检测波长为326nm;理论板数按绿原酸A峰计算应不低于2000;
(2)对照品溶液的制备分别取绿原酸、异绿原酸A、异绿原酸B、异绿原酸C对照品适量,精密称定,置棕色量瓶中,加甲醇制成每1ml含绿原酸40μg,异绿原酸A、异绿原酸B、异绿原酸C各为5~20μg的溶液,作为对照品溶液;
(3)供试品溶液的制备取金银花药材细粉0.1~0.15g,精密称定;或金银花制剂0.5~1.0g,精密称定,分别置具塞锥形瓶中,精密加入70%甲醇25ml,密塞,称定重量,以功率250W,频率33kHz超声处理10~30分钟,放冷,再称定重量,用70%甲醇补足减失的重量,摇匀,滤纸滤过,取续滤液再用0.45μm的微孔滤膜滤过,取续滤液作为供试品溶液;
(4)测定法分别精密吸取上述对照品溶液与供试品溶液各5~15μl,注入液相色谱仪,测定绿原酸和三种异绿原酸的含量。
2.根据权利要求1所述的一种金银花药材及其制剂中绿原酸和三种异绿原酸的定量测定方法,其特征在于所述的制剂是指含蔗糖的小儿咽扁颗粒和不含蔗糖的小儿咽扁颗粒。
3.根据权利要求1-2所述的一种金银花药材及其制剂中绿原酸和三种异绿原酸的定量测定方法,其特征还在于:
(1)色谱条件与系统适用性试验以体积比为15∶6.5∶78.5的乙腈-甲醇-0.1%磷酸为流动相;柱温:40℃;检测波长为326nm;理论板数按绿原酸A峰计算应不低于2000;
(2)对照品溶液的制备分别取绿原酸、异绿原酸A、异绿原酸B、异绿原酸C对照品适量,精密称定,置棕色量瓶中,加甲醇制成每1ml含绿原酸40μg、异绿原酸A 20μg、异绿原酸B10μg、异绿原酸C5μg的溶液,作为对照品溶液;
(3)供试品溶液的制备取金银花药材细粉0.1g,精密称定,置具塞锥形瓶中,精密加入70%甲醇25ml,密塞,称定重量,以功率250W,频率33kHz超声处理30分钟,放冷,再称定重量,用70%甲醇补足减失的重量,摇匀,滤纸滤过,取续滤液再用0.45μm的微孔滤膜滤过,取续滤液作为供试品溶液;
(4)测定法分别精密吸取上述对照品溶液与供试品溶液各5μl,注入液相色谱仪,测定绿原酸和三种异绿原酸的含量。
4.根据权利要求1-2所述的一种金银花药材及其制剂中绿原酸和三种异绿原酸的定量测定方法,其特征还在于:
(1)色谱条件与系统适用性试验以体积比为14.5∶6.3∶79.2的乙腈-甲醇-0.1%磷酸为流动相;柱温:40℃;检测波长为326nm;理论板数按绿原酸A峰计算应不低于2000;
(2)对照品溶液的制备分别取绿原酸、异绿原酸A、异绿原酸B、异绿原酸C对照品适量,精密称定,置棕色量瓶中,加甲醇制成每1ml含绿原酸40μg,异绿原酸A、异绿原酸B、异绿原酸C各为12μg的溶液,作为对照品溶液;
(3)供试品溶液的制备取无蔗糖的小儿咽扁颗粒0.5g,精密称定,置具塞锥形瓶中,精密加入70%甲醇25ml,密塞,称定重量,以功率250W,频率33kHz超声处理10分钟,放冷,再称定重量,用70%甲醇补足减失的重量,摇匀,滤纸滤过,取续滤液再用0.45μm的微孔滤膜滤过,取续滤液作为供试品溶液;
(4)测定法分别精密吸取上述对照品溶液5μl、供试品溶液15μl,注入液相色谱仪,测定绿原酸和三种异绿原酸的含量。
5.根据权利要求1-2所述的一种金银花药材及其制剂中绿原酸和三种异绿原酸的定量测定方法,其特征还在于:
(1)色谱条件与系统适用性试验以体积比为14∶6∶80的乙腈-甲醇-0.1%磷酸为流动相;柱温:40℃;检测波长为326nm;理论板数按绿原酸A峰计算应不低于2000;
(2)对照品溶液的制备分别取绿原酸、异绿原酸A、异绿原酸B、异绿原酸C对照品适量,精密称定,置棕色量瓶中,加甲醇制成每1ml含绿原酸40μg,异绿原酸A、异绿原酸B、异绿原酸C各为12μg的溶液,作为对照品溶液;
(3)供试品溶液的制备含蔗糖的小儿咽扁颗粒1.0g,精密称定,置具塞锥形瓶中,精密加入70%甲醇25ml,密塞,称定重量,以功率250W,频率33kHz超声处理10分钟,放冷,再称定重量,用70%甲醇补足减失的重量,摇匀,滤纸滤过,取续滤液再用0.45μm的微孔滤膜滤过,取续滤液作为供试品溶液;
(4)测定法分别精密吸取上述对照品溶液5μl、供试品溶液15μl,注入液相色谱仪,测定绿原酸和三种异绿原酸的含量。
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