CN110376305A - 一种蒿茶中绿原酸类的含量测定方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种蒿茶中绿原酸类成分的含量测定方法，本发明绿原酸含量测定方法包括如下步骤：(1)蒿茶经水提取后过滤膜得测试溶液；(2)经高效液相色谱仪检测得化学图谱；(3)经分析标准品和供试品图谱中新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸的峰面积计算蒿茶中三种绿原酸的含量。本发明样本前处理简单、方便、重现性好，且能准确反映蒿茶的活性成分含量，该方法可用于蒿茶的质量控制。

Description

一种蒿茶中绿原酸类的含量测定方法
技术领域
本发明涉及中药活性成分含量测定，具体公开了一种蒿茶中绿原酸类成分的含量测定方法。
背景技术
金湖蒿茶是集食用与药用一身的养生保健佳品，素有“江淮一宝”之称。篓篙，中医称之茵陈。纯野生蒌蒿茶是以香蒌尖为原料，采用当代科技手段，针对现代人生理机能的特点，精心研制的产品。
野生蒿茶富含酚酸、维生素、无机盐、氨基酸和硒、锌、铁等多种微量元素，蒿茶中的有机酸是香气和滋味的主要成分之一，且其具有降脂、降压、明目、养肝、消炎、解热等作用。绿原酸类成分的检测方法包括分光光度法、薄层扫描法等，两者方法的灵敏度、稳定性低。2015版《中国药典》仅以绿原酸的含量作为蒌蒿质量评价的单一指标。
发明内容
发明目的：本发明公开了一种能准确测定蒿茶中绿原酸含量的方法，可以同时测定蒿茶中三种绿原酸含量，全面评价蒿茶的质量。
技术方案：本发明所述的一种蒿茶中绿原酸含量的测定方法，可准确测定三种绿原酸的含量。
1、一种蒿茶中绿原酸类成分的含量测定方法，包括如下步骤：
(1)对照品溶液的制备：取新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸对照品，精密称定，置棕色量瓶中，加入甲醇，均配成对照品溶液；临用时，分别吸取不同体积，混匀得对照品储备液。
(2)供试品溶液的制备：称取蒿茶样品，置具塞锥形瓶中，加入纯水，加热回流提取，提取三次合并滤液，离心过滤，上清液定容，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液；
(3)分别吸取对照品溶液和供试品溶液1-20μL，注入高效液相色谱仪，进行测定，色谱条件如下：
色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；柱温：30℃；检测波长：326nm；按照如下条件进行等度洗脱：
(4)采用外标法计算供试品蒿茶中新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸的含量。
2、所述的蒿茶中绿原酸类成分的含量测定方法，步骤(1)中，对照品溶液浓度为0.8mg/mL；临用时，分别吸取0.5-1.5ml的体积3-5次。
3、所述的蒿茶中绿原酸类成分的含量测定方法，步骤(2)中，称取蒿茶样品1.0g，80-100℃加热回流提取1.0h；上清液定容至250ml。
4、所述的蒿茶中绿原酸类成分的含量测定方法，步骤(3)中分析时间为15min。
5、所述的蒿茶中绿原酸类成分的含量测定方法，步骤(3)中流速为0.8-1.0ml/min。
有益效果：1.样本前处理简单、快捷，重现性好；2.分析时间短；3.绿原酸与新绿原酸和隐绿原酸分离度较好，可准确测定三种绿原酸的含量。该方法可用于蒿茶的质量评价。
附图说明
图1是不同提取方法色谱图(A是方法一；B是方法二；C是方法三；D是方法四；E是方法五)；
图2是不同流动相洗脱色谱图(A是流动相系统a；B是流动相系统b；C是流动相系统c；D是流动相系统d)；
图3是系统适应性图谱(A是供试品溶液；B是对照品溶液；C是阴性空白溶液)；
图4是新绿原酸的标准曲线；
图5是绿原酸的标准曲线；
图6是隐绿原酸的标准曲线。
具体实施方式
1、仪器
Agilent 1100型高效液相色谱仪(G1379A型脱气机，G1311A型四元泵、G1313A型自动进样器、G1316A型柱温箱、G1315B型DAD检测器)；Q/320683AFA02-2005型调温电热器(上海苏达实验仪器有限公司)；Allegra X-30型多功能台式高速离心机(美国BeckmanCoulter公司)；色谱柱Kromasil 100-5C18(250mm×4.6mm，5μm)。
2、试剂
乙腈(色谱纯，Fisher公司)，甲醇(色谱纯，Fisher公司)，超纯水，甲酸(色谱纯，Fisher公司)，其余试剂均为分析纯。对照品绿原酸(批号01330-1008)、对照品新绿原酸(批号RP190418)、隐绿原酸(批号RP190226)。
实施例1供试品溶液制备条件及色谱条件的确定
1、供试品溶液制备方法的选择
不同供试品溶液制备方法比较：
方法一：精密称定蒿茶1.0g，置于具塞锥形瓶中，精密加入纯水20mL，回流提取1h，提取三次，离心，上清液定容，摇匀，滤过，用0.22μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。
方法二：精密称定蒿茶1.0g，置于具塞锥形瓶中，精密加入纯水20mL，超声提取1h，提取三次，离心，上清液定容，摇匀，滤过，用0.22μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。
方法三：精密称定蒿茶1.0g，置于具塞锥形瓶中，精密加入纯水20mL，浸泡1h，提取三次，离心，上清液定容，摇匀，滤过，用0.22μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。
方法四：采用药典方法：精密称定蒿茶l.0g，置具塞锥形瓶中，精密加入50％甲醇50ml，称定重量，超声提取30分钟，放冷，再称定重量，用50％甲醇补足减失的重量，摇匀，离心，精密量取上清液5ml，置25ml棕色量瓶中，加50％甲醇至刻度，摇勻，滤过，取续滤液，即得。
方法五：精密称定蒿茶1.0g，置于具塞锥形瓶中，精密加入50％乙醇20mL，回流提取1h，提取三次，离心，上清液定容，摇匀，滤过，用0.22μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。
通过不同提取方法，不同提取溶剂、对蒿茶中三种绿原酸的提取效率考察结果比较显示：水回流提取1h，提取三次，蒿茶中绿原酸的提取效率最高，同时，方法一中的新绿原酸、隐绿原酸也获得了最高的提取效率，如表1、附图1所示。因此选择方法一作为最终实验提取方法。
表1不同方法提取三个成分含量(mg/g)
2、波长的选择
本发明对水提液中三种成分进行PDA全波长扫描，结果发现三个成分在326nm处存在最大吸收，因此选择326nm作为检测波长。
3、流动相的选择
实验中共选择四种流动相系统(A有机相-B水相)：
(a)甲醇-水系统
(b)乙腈-水系统
(c)甲醇-水(0.1％-甲酸)系统
(d)乙腈-水(0.1％-甲酸)系统
按照如下梯度方法进行检测：
对蒿茶进行高效液相色谱的测定。如附图2所示，甲醇-水系统与乙腈-水系统色谱峰提前，不能对绿原酸进行较好的检测；甲醇-0.1％甲酸水系统检测出的色谱峰小；乙腈-0.1％甲酸水系统中新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸可达到较好分离度，峰宽较窄且保留时间适中，可以看到在15min内出峰完毕，分析时间选为15min，色谱方法选择等度洗脱。
实施例2蒿茶中绿原酸类成分的含量测定方法学考察
精密称定蒿茶1.0g，置于具塞锥形瓶中，精密加入纯水20mL，回流提取1h，提取三次，离心，上清液定容，摇匀，滤过，用0.22μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。
系统适用性试验：在上述优选色谱条件下，各组分分离度均大于1.5。结果见图3。
线性范围试验：
精密吸取混合对照品溶液1μL、2μL、4μL、8μL、16μL，每个体积重复进样3次，注入高效液相色谱仪，按色谱条件测定，记录色谱图，以峰面积为纵坐标(Y)，进样量(X)为横坐标进行线性回归，得到回归方程。结果见表2、图4-6。
表2新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸线性回归方程
精密度实验：
取混合对照品溶液，连续进样6次，测定样品中新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸的峰面积，其RSD值分别为，表明仪器的精密度良好，结果见表3。
表3精密度实验结果
稳定性实验：
取蒿茶样品制备供试品溶液，在0小时、2小时、4小时、8小时、12小时、24小时测定新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸峰的峰面积，结果显示，新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸峰面积的RSD分别为，表明蒿茶溶液在24h内通过高效液相色谱分析稳定性良好，结果见表4。
表4稳定性试验结果
重复性实验：
精密称取蒿茶样品，平行制备6份，进行高效液相色谱的测定，结果显示，6份供试品溶液中新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸峰面积的RSD分别为，表明该方法重现性良好，结果见表5。
表5重复性试验结果
加样回收实验：
取0.5g蒿茶样品进行重复性实验，所得新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸峰面积的平均值作为该药材中的含量，新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸的具体含量分别为。依据蒿茶中绿原酸含量的50％、100％、150％分别加入对照品储备液，每个浓度下平行备样三份，按供试品制备方法制成供试液，测定新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸的含量，加样回收试验结果良好，具体数据见表6。
表6加样回收率试验结果

Claims (5)

1.一种蒿茶中绿原酸类成分的含量测定方法，其特征在于包括如下步骤：
(1)对照品溶液的制备：取新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸对照品，精密称定，置棕色量瓶中，加入甲醇，均配成对照品溶液；临用时，分别吸取不同体积，混匀得对照品储备液。
(2)供试品溶液的制备：称取蒿茶样品，置具塞锥形瓶中，加入纯水，加热回流提取，提取三次合并滤液，离心过滤，上清液定容，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液；
(3)分别吸取对照品溶液和供试品溶液1-20μL，注入高效液相色谱仪，进行测定，色谱条件如下：
色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；柱温：30℃；检测波长：326nm；按照如下条件进行等度洗脱：
(4)采用外标法计算供试品蒿茶中新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸的含量。
2.根据权利要求1所述的蒿茶中绿原酸类成分的含量测定方法，其特征在于步骤(1)中，对照品溶液浓度为0.8mg/mL；临用时，分别吸取0.5-1.5ml的体积3-5次。
3.根据权利要求1所述的蒿茶中绿原酸类成分的含量测定方法，其特征在于步骤(2)中，称取蒿茶样品1.0g，80-100℃加热回流提取1.0h；上清液定容至250ml。
4.根据权利要求1所述的蒿茶中绿原酸类成分的含量测定方法，其特征在于步骤(3)中分析时间为15min。
5.根据权利要求1所述的蒿茶中绿原酸类成分的含量测定方法，其特征在于步骤(3)中流速为0.8-1.0ml/min。
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