CN103698422A

CN103698422A - 一种检测清热灵颗粒中黄芩苷、连翘苷、靛玉红和甘草酸含量的方法

Info

Publication number: CN103698422A
Application number: CN201310667679.5A
Authority: CN
Inventors: 林徐剑; 吴碧元; 柴建国; 施晓萍; 沈莹
Original assignee: ZHENGDA QINGCHUNBAO PHARMACEUTICAL CO Ltd
Current assignee: ZHENGDA QINGCHUNBAO PHARMACEUTICAL CO Ltd
Priority date: 2013-12-10
Filing date: 2013-12-10
Publication date: 2014-04-02
Anticipated expiration: 2033-12-10
Also published as: CN103698422B

Abstract

本发明公开了一种检测清热灵颗粒中黄芩苷、连翘苷、靛玉红和甘草酸含量的方法：将清热灵颗粒预处理制成待测样品，待测样品注入高效液相色谱仪进行检测，获得待测样品的高效液相色谱图；根据待测样品的高效液相色谱图中相应吸收峰的峰面积及各个标准品的标准曲线计算待测样品中黄芩苷、连翘苷、靛玉红和甘草酸含量。本发明方法不仅测定《中华人民共和国药典》2010年版一部中清热灵颗粒含量测定项下黄芩苷的成分，又增加测定连翘中的连翘苷含量、大青叶中的靛玉红含量和甘草中的甘草酸含量，大大提高了清热灵颗粒的质量控制标准。该方法含量测定方法学验证完全符合规定，是一种先进的质量控制方法。本发明能节约检测时间和检测成本。

Description

一种检测清热灵颗粒中黄芩苷、连翘苷、靛玉红和甘草酸含量的方法

（一）技术领域

本发明涉及一种中药制剂的含量测定方法，具体涉及一种检测清热灵颗粒中黄芩苷、连翘苷、靛玉红和甘草酸含量的方法。

（二）背景技术

清热灵颗粒的处方组成为黄芩250g、连翘250g、大青叶250g、甘草50g。其制法以上四味药加水煎煮二次，每次1.5小时，合并滤液，滤过，滤液浓缩至相对密度1.20～1.25（80℃）的清膏，放冷，加入乙醇使含醇量达58%～60%，静置12小时以上，取上清液滤过，滤液回收乙醇并浓缩至相对密度1.29～1.31（80℃）的稠膏，加蔗糖粉740g及适量糊精，制成颗粒，干燥，制成1000g；或加入甜菊素6.66g及适量的糊精制成颗粒，干燥，制成333g，即得。本品为棕黄色至黄棕色的颗粒，味甜、微苦。功能与主治为：清热解毒。用于感冒热邪壅肺证，症见发热、咽喉肿痛。

清热灵颗粒在《中华人民共和国药典》2010年版一部中含量测定项下只是测定了黄芩中的黄芩苷这一个成分，难以反应出整个药品的质量，有一定的不足。

（三）发明内容

本发明针对目前清热灵颗粒含量测定方法的不足，提供了一种更加合理有效的含量测定方法用于产品的质量控制，在测定黄芩中黄芩苷含量的基础上，增加测定连翘中连翘苷含量，大青叶中靛玉红含量和甘草中的甘草酸含量。

本发明采用高效液相色谱法，在同一色谱条件下，采用流动相梯度洗脱，使用DAD紫外检测器，在不同波长处同时测定黄芩苷、连翘苷、靛玉红和甘草酸含量。

本发明采用的技术方案是：

本发明提供一种检测清热灵颗粒中黄芩苷、连翘苷、靛玉红和甘草酸含量的方法，所述方法包括以下步骤：

（1）制备待测样品：将清热灵颗粒研细混匀后加入体积浓度0～100%乙醇水溶液a中，制成混合液a，将混合液a在超声频率25KHz、超声功率80～100W的条件下超声处理10～30分钟，冷却后取超声处理后的混合液a加入体积浓度0～100%乙醇水溶液b补足重量，制成混合液b，使混合液b与混合液a的质量相同，将混合液b摇匀、过滤，取滤液，获得待测样品；所述乙醇水溶液b与乙醇水溶液a的体积浓度相同；

（2）含量测定：将步骤（1）制备的待测样品注入高效液相色谱仪进行检测，获得待测样品的高效液相色谱图；将黄芩苷标准品用体积浓度0～100%乙醇水溶液配制成黄芩苷标准品溶液，取不同体积的黄芩苷标准品溶液与待测样品相同的条件下进行入高效液相色谱检测，获得黄芩苷标准品溶液的高效液相色谱图，以黄芩苷标准品溶液的高效液相色谱图中吸收峰的峰面积为横坐标，以黄芩苷准品溶液进样量为纵坐标制作黄芩苷标准曲线，按同样方法制作连翘苷标准曲线、靛玉红标准曲线和甘草酸铵标准曲线；根据待测样品的高效液相色谱图中相应吸收峰的峰面积及各个标准品的标准曲线计算待测样品中黄芩苷、连翘苷、靛玉红和甘草酸含量，其中甘草酸的重量=甘草酸铵重量/1.0207，相应换算得到清热灵颗粒中黄芩苷、连翘苷、靛玉红和甘草酸含量；高效液相色谱仪测试条件为：色谱柱以苯基键合硅胶为填充剂，以体积浓度0.5%冰乙酸水溶液为流动相A，以乙腈为流动相B进行梯度洗脱，梯度洗脱条件为0～20min时流动相A的体积分数为80～72%，20～35min时流动相A的体积分数为72～57%，35～50min时流动相A的体积分数为57%，DAD紫外检测器，分别同时在280nm、277nm、289nm和252nm处检测吸收峰。

进一步，所述步骤（1）中，所述乙醇水溶液a优选为体积浓度50%乙醇水溶液或70%乙醇水溶液，乙醇水溶液b优选为体积浓度50%乙醇水溶液或70%乙醇水溶液，乙醇水溶液b与乙醇水溶液a的体积浓度相同。

进一步，所述步骤（1）中，超声处理时间优选为20～30分钟。

所述步骤（1）中，混合液a或混合液b的质量通常以清热灵颗粒的质量计为5～15mL/g，优选8～10mL/g。

进一步，所述步骤（2）中，所述色谱柱中填充剂的粒径优选为5μm。

进一步，所述步骤（2）中，所述色谱柱长优选为250mm，内径优选为4.6mm。

进一步，所述步骤（2）中，洗脱剂的流速优选为1.0ml/min。

所述步骤（2）中，梯度洗脱时，流动相A的体积分数是指流动相A相对于流动相A与流动相B的总体积的体积分数。

所述步骤（2）中，0～20min时流动相A的体积分数为80～72%，是指起始时，流动相A的体积分数为80%，设定0至20min，流动相A的体积分数从80%线性下降至72%。

20～35min时流动相A的体积分数为72～57%，是20～35min，流动相A的体积分数从72%线性下降至57%。

35～50min时流动相A的体积分数为57%，此时间内，流动相A的体积分数保持57%不变。

本发明所述清热灵颗粒配方为黄芩、连翘、大青叶、甘草，厂家：正大青春宝药业有限公司。

本发明方法中，检测清热灵颗粒中黄芩苷的含量远高于连翘苷、靛玉红或甘草酸的含量，在液相色谱图中最大峰面积与最小峰面积相差约两个数量级，为提高黄芩苷的检测准确度，优选本发明方法按以下步骤操作：

（a）制备待测样品：将清热灵颗粒研细混匀后加入体积浓度0～100%乙醇水溶液a中，制成混合液a，将混合液a在超声频率25KHz、超声功率80～100W的条件下超声处理10～30分钟，冷却后取超声处理后的混合液a加入体积浓度0～100%乙醇水溶液b补足重量，制成混合液b，使混合液b与混合液a的质量相同，将混合液b摇匀、过滤，取滤液，获得用于检测连翘苷、靛玉红和甘草酸的待测样品A；取部分待测样品A，用体积浓度0～100%的乙醇水溶液c稀释30～100倍（优选50倍），获得用于检测黄芩苷的待测样品B；所述乙醇水溶液a、b、c的体积浓度相同；

（b）含量测定：将步骤（1）制备的待测样品A和待测样品B分别注入高效液相色谱仪进行检测，按相同条件检测，分别获得待测样品A和B的高效液相色谱图；将黄芩苷标准品用体积浓度0～100%乙醇水溶液配制成黄芩苷标准品溶液，取不同体积的黄芩苷标准品溶液与待测样品A或B相同的条件下进行入高效液相色谱检测，获得黄芩苷标准品溶液的高效液相色谱图，以黄芩苷标准品溶液的高效液相色谱图中吸收峰的峰面积为横坐标，以黄芩苷准品溶液进样量为纵坐标制作黄芩苷标准曲线，按同样方法制作连翘苷标准曲线、靛玉红标准曲线和甘草酸铵标准曲线；根据待测样品A的高效液相色谱图中相应吸收峰的峰面积及连翘苷、靛玉红和甘草酸的标准品的标准曲线计算得到待测样品A中连翘苷、靛玉红和甘草酸的含量，其中甘草酸的重量=甘草酸铵重量/1.0207，根据待测样品B的高效液相色谱图中黄芩苷吸收峰的峰面积及黄芩苷的标准品的标准曲线计算得到待测样品B中黄芩苷的含量，最后分别换算得到清热灵颗粒中黄芩苷、连翘苷、靛玉红和甘草酸含量；高效液相色谱仪测试条件为：色谱柱以苯基键合硅胶为填充剂，以体积浓度0.5%冰乙酸水溶液为流动相A，以乙腈为流动相B进行梯度洗脱，梯度洗脱条件为0～20min时流动相A的体积分数为80～72%，20～35min时流动相A的体积分数为72～57%，35～50min时流动相A的体积分数为57%，DAD紫外检测器，分别同时在280nm、277nm、289nm和252nm处检测吸收峰。

进一步，所述步骤（a）中，所述乙醇水溶液a优选为体积浓度50%乙醇水溶液或70%乙醇水溶液，乙醇水溶液b优选为体积浓度50%乙醇水溶液或70%乙醇水溶液，所述乙醇水溶液c优选为体积浓度50%乙醇水溶液或70%乙醇水溶液，乙醇水溶液a、b、c的体积浓度相同。

进一步，所述步骤（a）中，超声处理时间优选为20～30分钟。

所述步骤（a）中，混合液a或混合液b的质量通常以清热灵颗粒的质量计为5～15mL/g，优选8～10mL/g。

进一步，所述步骤（b）中，所述色谱柱中填充剂的粒径优选为5μm。

进一步，所述步骤（b）中，所述色谱柱长优选为250mm，内径优选为4.6mm。

进一步，所述步骤（b）中，洗脱剂的流速优选为1.0ml/min。

所述步骤（b）中，梯度洗脱时，流动相A的体积分数是指流动相A相对于流动相A与流动相B的总体积的体积分数。

待测样品B经过稀释，检测黄芩苷含量时，数据更为准确。

本发明所述乙醇水溶液a、乙醇水溶液b均为乙醇水溶液，为了便于区分不同步骤所用量不同而命名，混合液a和混合液b均为混合液，为了便于区分不同步骤所获得混合液不同而命名，字母本身没有化学含义。

与现有技术相比，本发明的优势体现在：《中华人民共和国药典》2010年版一部中清热灵颗粒含量测定项下只是测定了黄芩中的黄芩苷含量，本发明方法不仅测定黄芩苷含量，又增加测定连翘中的连翘苷含量、大青叶中的靛玉红含量和甘草中的甘草酸含量，大大提高了清热灵颗粒的质量控制标准。且采用同一色谱条件，在流动相梯度洗脱的方法下，利用DAD紫外检测器同时在280nm处测定黄芩苷、在277nm处测定连翘苷、在289nm处测定靛玉红、在252nm处测定甘草酸。该方法含量测定方法学验证完全符合规定，是一种先进的质量控制方法。

目前已公开的关于清热灵颗粒含量测定的文献中只是测定黄芩和连翘两种药物中的一些成分的含量，对于大青叶和甘草的成分并没有同时测定。而本发明对于清热灵颗粒中的四味药物每种都做了含量测定，且是在同一个色谱条件下测得。相对于一般中药固体制剂如果要用高效液相色谱法检测不同成分的含量需要不同的色谱条件，因此需要大量的检测时间及检测成本，采用本发明则能节约时间和检测成本，且能更加有效控制产品的质量。

（四）附图说明

图1为实施例1中黄芩苷标准曲线图。

图2为实施例1中连翘苷标准曲线图。

图3为实施例1中靛玉红标准曲线图。

图4为实施例1中甘草酸铵标准曲线图。

图5为实施例1中黄芩苷标准品溶液的色谱图，峰a为黄芩苷。

图6为实施例1中连翘苷标准品溶液的色谱图，峰b为连翘苷。

图7为实施例1中靛玉红标准品溶液的色谱图，峰c为靛玉红。

图8为实施例1中甘草酸铵标准品溶液的色谱图，峰d为甘草酸铵。

图9为实施例5中方法学验证中专属性考察缺黄芩处方提取液色谱图，检测波长280nm。

图10为实施例5中方法学验证中专属性考察有黄芩处方的提取液色谱图，峰a为黄芩苷，检测波长280nm。

图11为实施例5方法学验证中专属性考察缺连翘处方提取液色谱图，检测波长277nm。

图12为实施例5方法学验证中专属性考察有连翘处方的提取液色谱图，峰b为连翘苷，检测波长277nm。

图13为实施例5方法学验证中专属性考察缺大青叶处方提取液色谱图，检测波长289nm。

图14为实施例5方法学验证中专属性考察有大青叶处方的提取液色谱图，峰c为靛玉红，检测波长289nm。

图15为实施例5方法学验证中专属性考察缺甘草处方提取液色谱图，检测波长252nm。

图16为实施例5方法学验证中专属性考察有甘草处方的提取液色谱图，峰d为甘草酸，检测波长252nm。

图17为实施例1中清热灵颗粒的黄芩苷含量测定色谱图，检测波长280nm。

图18为实施例1中清热灵颗粒的连翘苷含量测定色谱图，检测波长277nm。

图19为实施例1中清热灵颗粒的靛玉红含量测定色谱图，检测波长289nm。

图20为实施例1中清热灵颗粒的甘草酸含量测定色谱图，检测波长252nm。

图21为实施例2中清热灵颗粒的黄芩苷含量测定色谱图，检测波长280nm。

图22为实施例2中清热灵颗粒的连翘苷含量测定色谱图，检测波长277nm。

图23为实施例2中清热灵颗粒的靛玉红含量测定色谱图，检测波长289nm。

图24为实施例2中清热灵颗粒的甘草酸含量测定色谱图，检测波长252nm。

（五）具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1：采用高效液相色谱法测定清热灵颗粒中黄芩苷、连翘苷、靛玉红和甘草酸的含量。

（1）高效液相色谱条件

仪器名称：安捷伦1100高效液相色谱仪

色谱条件：色谱柱：ZORBAX SB—phenyl（柱长250mm，内径4.6mm），填充剂：苯基键合硅胶（粒径5μm），流速：1.0ml/min，柱温：25℃

DAD紫外检测器检测波长：280nm、277nm、289nm、252nm

以体积浓度0.5%冰乙酸水溶液为流动相A，以乙腈为流动相B，按表1进行梯度洗脱。

表1梯度洗脱条件

时间（分钟）	流动相A（%）	流动相B（%）
			0～20	80→72	20→28
20～35	72→57	28→43
			35～50	57	43

（2）标准品溶液的制备：

a、黄芩苷标准品溶液：精密称取黄芩苷标准品，加入体积浓度50%乙醇水溶液，制成36.8μg/ml的黄芩苷标准品溶液。

b、连翘苷标准品溶液：精密称取连翘苷标准品，加入体积浓度50%乙醇水溶液，制成88μg/ml的连翘苷标准品溶液。

c、靛玉红标准品溶液：精密称取靛玉红标准品，加入体积浓度50%乙醇水溶液，制成2.64μg/ml的靛玉红标准品溶液。

d、甘草酸铵标准品溶液：精密称取甘草酸铵标准品，加入体积浓度50%乙醇水溶液，制成172μg/ml的甘草酸铵标准品溶液。（甘草酸重量=甘草酸铵重量/1.0207）。

（3）待测样品溶液的制备：

清热灵颗粒：黄芩、连翘、大青叶、甘草。厂家：正大青春宝药业有限公司。

精密称取已研细混匀的清热灵颗粒3g至具塞锥形瓶中，加入体积浓度50%乙醇水溶液25ml，精密称重，超声处理30分钟，超声频率25khz，超声功率100w。然后取出，放冷。再次称重，用体积浓度50%乙醇水溶液补足减失的重量。摇匀，过滤，取滤液即得待测样品溶液A（测定连翘苷、靛玉红、甘草酸含量）。再精密吸取1ml滤液至50ml容量瓶中，加入50%乙醇水溶液至刻度，摇匀，得待测样品溶液B（测定黄芩苷）。

（4）标准曲线的制作：

分别取36.8ng/μl黄芩苷标准品溶液2、4、6、8、12、16、20、30、40μl注入高效液相色谱仪，根据表1所示测试条件进行检测，在280nm处检测吸收峰，以峰面积为横坐标，以黄芩苷标准品溶液进样量为纵坐标制作标准曲线，结果见图1所示，y=0.4099x+3.3901（R²=1）。黄芩苷标准品溶液的高效液相色谱图见图5所示。黄芩苷在73.6ng～1472ng的进样范围内线性关系良好。

分别取88ng/μl连翘苷标准品溶液2、4、6、8、12、16、20、30、40μl注入高效液相色谱仪，在277nm处检测吸收峰，其他操作同黄芩苷标准曲线的制作，结果见图2所示，y=1.5472x+3.9426（R²=1）。连翘苷标准品溶液的高效液相色谱图见图6所示。连翘苷在176ng～3520ng的进样范围内线性关系良好。

分别取2.64ng/μl靛玉红标准品溶液2、4、6、8、12、16、20、30、40μl注入高效液相色谱仪，在289nm处检测吸收峰，其他操作同黄芩苷标准曲线的制作，结果见图3所示，y=0.2207x+1.0478（R²=0.9999）。靛玉红标准品溶液的高效液相色谱图见图7所示。靛玉红在5.28ng～105.6ng的进样范围内线性关系良好。

分别取172ng/μl甘草酸铵标准品溶液2、4、6、8、12、16、20、30μl注入高效液相色谱仪，在252nm处检测吸收峰，其他操作同黄芩苷标准曲线的制作，结果见图4所示，y=1.3578x+0.1085（R²=1）。甘草酸铵标准品溶液的高效液相色谱图见图8所示。甘草酸铵在344ng～5160ng的进样范围内线性关系良好。

（5）待测样品含量测定：

分别精密吸取步骤（2）配制的黄芩苷标准品溶液20μl、连翘苷标准品溶液20μl，靛玉红标准品溶液20μl，甘草酸铵标准品溶液20μl，注入高效液相色谱仪，根据表1所示条件测定各个标准品分别在280nm、277nm、289nm和252nm处吸收峰作为对照。

精密吸取步骤（3）配制的待测样品溶液A20μl，注入高效液相色谱仪，根据表1所示条件测定待测样品吸收峰，分别在277nm、289nm和252nm处同时检测吸收峰，根据待测样品吸收峰面积及连翘苷标准曲线、靛玉红标准曲线和甘草酸铵标准曲线计算待测样品A中连翘苷、靛玉红和甘草酸含量，并计算得到清热灵颗粒中连翘苷、靛玉红和甘草酸含量。精密吸取步骤（3）配制的待测样品溶液B20μl，注入高效液相色谱仪，根据表1所示条件测定待测样品吸收峰，在280nm处检测吸收峰，根据吸收峰面积和黄芩苷标准曲线，计算待测样品B中黄芩苷的含量，并计算得到清热灵颗粒中黄芩苷的含量。

结果为：每袋（5g）清热灵颗粒中黄芩苷含量为77.78mg，连翘苷含量为2.78mg，靛玉红含量为0.064mg，甘草酸含量为5.78mg。高效液相色谱图见图17～图20所示，图17～图20分别为检测波长在280nm处测定待测样品溶液B中的黄芩苷、在277nm处测定待测样品溶液A中的连翘苷、在289nm处测定待测样品溶液A中的靛玉红、在252nm处测定待测样品溶液A中的甘草酸的高效液相色谱图。

实施例2：

精密称取黄芩苷标准品，加入体积浓度70%乙醇水溶液，制成每1ml含黄芩苷36μg的标准品溶液。

精密称取连翘苷标准品，加入体积浓度70%乙醇水溶液，制成每1ml含连翘苷100μg的标准品溶液。

精密称取靛玉红标准品，加入体积浓度70%乙醇水溶液，制成每1ml含靛玉红2.8μg的标准品溶液。

精密称取甘草酸铵标准品，加入体积浓度70%乙醇水溶液，制成每1ml含甘草酸铵120μg的标准品溶液。（甘草酸重量=甘草酸铵重量/1.0207）。

将实施例1中步骤（3）中体积浓度50%乙醇水溶液更换为体积浓度70%乙醇水溶液，超声时间30分钟更换为20分钟，其他操作同实施例1，测定结果：每袋（5g）清热灵颗粒中黄芩苷含量为78.05mg，连翘苷含量为2.81mg，靛玉红含量为0.063mg，甘草酸含量为5.81mg。高效液相色谱图见图21～图24所示，图21～图24分别为检测波长在280nm处测定黄芩苷、在277nm处测定连翘苷、在289nm处测定靛玉红、在252nm处测定甘草酸的高效液相色谱图。。

实施例3：

将实施例1待测样品制备中体积浓度50%乙醇水溶液更换为表2所示溶液，对待测样品A进行检测，色谱条件同实施例1，分别在280nm，277nm、289nm和252nm处同时检测吸收峰，记录峰面积，结果见表2所示。

根据表2可以看出，待测样品溶液制备中采用的乙醇水溶液优选50%乙醇溶液或70%乙醇溶液。原因是通过采用蒸馏水、50%乙醇溶液、70%乙醇溶液、无水乙醇、50%甲醇溶液、甲醇这6种提取溶剂超声提取的清热灵颗粒供试品溶液中，黄芩苷、连翘苷、靛玉红和甘草酸的色谱峰峰面积在采用50%乙醇溶液、70%乙醇溶液提取时峰面积最大。

表2溶剂对吸收峰的影响

实施例4

将实施例1步骤（3）中超声处理时间更换为表3所示，待测样品溶液的制备及测试方法同实施例1，对待测样品A进行检测，色谱条件同实施例1，分别在280nm，277nm、289nm和252nm处同时检测吸收峰，记录峰面积，结果见表3所示。

在上述方法中，待测样品溶液的制备中超声处理的时间为10～30分钟，其中优选20分钟或30分钟，原因是超声处理20分钟或30分钟后，各被测成分的色谱图峰面积最大。

表3超声处理时间对峰面积的影响

实施例5

将实施例1中清热灵颗粒中黄芩去除作为待测样品，即只有连翘、大青叶、甘草这三味药，按照实施例1的方法获得待测样品A的高效液相色谱图，缺黄芩处方提取液样品色谱图见图9，正常处方提取液样品色谱图见图10，检测波长均为280nm。图10中，峰a为黄芩苷。图9中，在黄芩苷色谱峰保留时间处无其它色谱峰出现。

将实施例1中清热灵颗粒中连翘去除作为待测样品，即只有黄芩、大青叶、甘草这三味药，按照实施例1的方法获得待测样品A的高效液相色谱图，缺连翘处方提取液样品色谱图见图11，正常处方提取液样品色谱图见图12，检测波长均为277nm。图12中，峰b为连翘苷。图11中，在连翘苷色谱峰保留时间处无其它色谱峰出现。

将实施例1中清热灵颗粒中大青叶去除作为待测样品，即只有黄芩、连翘、甘草这三味药，按照实施例1的方法获得待测样品A的高效液相色谱图，缺大青叶处方提取液样品色谱图见图13，正常处方提取液样品色谱图见图14，检测波长均为289nm。图14中，峰c为靛玉红。图13中，在靛玉红色谱峰保留时间处无其它色谱峰出现。

将实施例1中清热灵颗粒中甘草去除作为待测样品，即只有黄芩、连翘、大青叶这三味药，按照实施例1的方法获得待测样品A的高效液相色谱图，缺甘草处方提取液样品色谱图见图15，正常处方提取液样品色谱图见图16，检测波长均为252nm。图16中，峰d为甘草酸。图15中，在甘草酸色谱峰保留时间处无其它色谱峰出现。

结果表明本方法的方法学验证中专属性考察符合规定（即空白对照无干扰）。

清热灵颗粒的处方组成为黄芩250g、连翘250g、大青叶250g、甘草50g。其制法以上四味药加水煎煮二次，每次1.5小时，合并滤液，滤过，滤液浓缩至相对密度1.20～1.25（80℃）的清膏，放冷，加入乙醇使含醇量达58%～60%，静置12小时以上，取上清液滤过，滤液回收乙醇并浓缩至相对密度1.29～1.31（80℃）的稠膏，加蔗糖粉740g及适量糊精，制成颗粒，干燥，制成1000g。

在进行去除黄芩、连翘、大青叶或甘草、只有三味药的对比实验时，将处方中相应药原料去除，其余制法同上，制得对比用的清热灵颗粒，并按照实施例1的方法提取制备待测样品A。

实施例6

取同一批次的清热灵颗粒，进行方法学验证，实验操作同实施例1，分别获得待测样品溶液A用于测定连翘苷、靛玉红、甘草酸含量，待测样品溶液B用于测定黄芩苷含量，进行了精密度考察（重复性实验、中间精密度实验），结果见表4、5所示。结果表明，含量测定的RSD均在2%以内，符合RSD在3%以内的要求。

表4本发明方法重复性实验含量测定

表5本发明方法中间精密度实验含量测定

本方法的方法学验证中准确度考察（回收率实验）符合95%～105%的范围要求，RSD符合5%以内的要求。

实验操作同实施例1，结果见表6所示。

表6本发明方法准确度测定

本方法的方法学验证中24小时稳定性考察符合要求（RSD在2%以内），实验操作同实施例1，结果见表7所示。

表7本发明方法稳定性测定

Claims

1.一种检测清热灵颗粒中黄芩苷、连翘苷、靛玉红和甘草酸含量的方法，其特征在于所述方法包括以下步骤：

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤（1）中，所述乙醇水溶液a为体积浓度50%乙醇水溶液或70%乙醇水溶液，乙醇水溶液b为体积浓度50%乙醇水溶液或70%乙醇水溶液，乙醇水溶液b与乙醇水溶液a的体积浓度相同。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤（1），超声处理时间为20～30分钟。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤（1）中，混合液a或混合液b的质量以清热灵颗粒的质量计为5～15mL/g。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤（2）中，填充剂的粒径为5μm。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤（2）中，洗脱剂的流速为1.0ml/min。

7.一种检测清热灵颗粒中黄芩苷、连翘苷、靛玉红和甘草酸含量的方法，其特征在于所述方法按以下步骤操作：

（a）制备待测样品：将清热灵颗粒研细混匀后加入体积浓度0～100%乙醇水溶液a中，制成混合液a，将混合液a在超声频率25KHz、超声功率80～100W的条件下超声处理10～30分钟，冷却后取超声处理后的混合液a加入体积浓度0～100%乙醇水溶液b补足重量，制成混合液b，使混合液b与混合液a的质量相同，将混合液b摇匀、过滤，取滤液，获得用于检测连翘苷、靛玉红和甘草酸的待测样品A；取部分待测样品A，用体积浓度0～100%的乙醇水溶液c稀释30～100倍，获得用于检测黄芩苷的待测样品B；所述乙醇水溶液a、b、c的体积浓度相同；

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于所述步骤（a）中，部分待测样品A，用体积浓度0～100%的乙醇水溶液c稀释50倍，获得用于检测黄芩苷的待测样品B。

9.如权利要求7所述的方法，其特征在于所述步骤（a）中，所述乙醇水溶液a为体积浓度50%乙醇水溶液或70%乙醇水溶液，乙醇水溶液b为体积浓度50%乙醇水溶液或70%乙醇水溶液，所述乙醇水溶液c为体积浓度50%乙醇水溶液或70%乙醇水溶液，乙醇水溶液a、b、c的体积浓度相同。

10.如权利要求7所述的方法，其特征在于所述步骤（a）中，混合液a或混合液b的质量以清热灵颗粒的质量计为5～15mL/g。