CN104820029A - 一种复方鱼腥草合剂的含量检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种复方鱼腥草合剂的含量检测方法，该方法主要用水饱和正丁醇提取，上柱后水、醇洗脱，以Phenyl键合硅胶为色谱柱，流动相为乙腈-0.5％乙酸溶液(体积比为18.5:81.5)；本发明提供的一种复方鱼腥草合剂的含量检测方法，不仅实现了解决了之前无法有效控制复方鱼腥草合剂特征成分槲皮苷的问题，而且同步检测复方鱼腥草合剂中槲皮苷、黄芩苷和连翘苷含量，保证了药品安全、有效、质量可控。

Description

一种复方鱼腥草合剂的含量检测方法

技术领域

本发明属于药学和分析化学技术领域，具体涉及一种复方鱼腥草合剂的含量检测方法。

背景技术

复方鱼腥草合剂具有清热解毒的功效。用于外感风热引起的咽喉疼痛；急性咽炎、扁桃腺炎有风热证候者。

制法：以上五味药材，加水煎煮两次，每次2小时，合并煎煮液，滤过，滤液浓缩至相对密度为1.18～1.20(60℃～80℃)的清膏，加乙醇醇沉至含醇量为70％，搅匀，静置24h，滤过，滤液减压回收乙醇并浓缩至适量。另取蔗糖60g，制成单糖浆，加入上述药液，加入处方量的蜂蜜、苯甲酸钠、羟苯乙酯，混匀，调整总量至规定量(即1000ml)，搅匀，滤过，灌装，灭菌，即得。

复方鱼腥草合剂的处方是由鱼腥草+板蓝根+“双黄连”组成，方中由金银花、黄芩、连翘组成的“双黄连”以其清热解毒的主要功效已成为经典名方，复方鱼腥草合剂是在“双黄连”的基础上增加了利咽的板蓝根和具有较强抗菌、抗病毒作用的鱼腥草。方中以鱼腥草为君药，黄芩为臣药，以连翘为佐药，板蓝根和金银花为使药，在清热解毒的同时增强了抗菌、抗病毒功效，对于中医辨证属风热的咽喉疼痛、急性咽炎、扁桃腺炎等上呼吸道感染效果明显。

鱼腥草为三白草科植物蕺菜(Houttuynia cordata Thunb).的新鲜全草或干燥地上部分；辛，微寒。归肺经。有清热解毒，消痛排脓，利尿通淋之功效；用于肺痈吐脓，痰热喘晐，热痢，热淋，痈肿疮毒。鱼腥草为该方中的君药，槲皮苷为复方鱼腥草合剂中鱼腥草的特异成分。槲皮苷及其代谢产物槲皮素均能够明显抑制单纯疱疹病毒HSV-1和HSV-2感染；另外，槲皮素能够抑制炎症因子的表达；对耐甲氧西林的葡萄球菌具有良好的抑制作用。

黄芩为唇形禾斗植物黄芩(Scutellaria baicalensis Georgi)的干燥根；味苦，性寒；归肺、胆、脾、大肠、小肠经。有清热燥湿，泻火解毒，止血，安胎之功效；用于湿温、暑湿，胸闷呕恶，湿热痞满，泻痢，黄疸，肺热咳嗽，高热烦渴，血热吐衄，痈肿疮毒，胎动不安。黄芩抗菌谱广，其煎剂对多种革兰阳性菌、革兰阴性菌及螺旋体等的生长均有抑制作用；黄芩也具有抗真菌活性，对白色念珠菌、许兰毛癣菌等多种致病性真菌的生长有一定抑制作用。黄芩为该方中的臣药，其特征成分为黄芩苷，黄芩苷及其代谢产物黄芩素对流感病毒所致的细胞病变均有明显的抑制作用，当黄芩苷超过一定质量浓度时，能明显降低病毒神经氨酸酶的活力，从而抑制病毒复制；黄芩素和黄芩苷具有一定的解热镇痛抗炎作用，黄芩素和黄芩苷可以通过干扰花生四烯酸的代谢通路、抑制核因子的活性以及细胞因子的分泌、释放而发挥解热镇痛抗炎的作用。

连翘为木犀科植物连翘(Forsythia suspensa(Thunb.)Vahl)的干燥果实；苦，微寒；归肺、心、小肠经。有清热解毒，消肿散结,疏散风热之功效；用于痈疽，瘰疬，乳痛，丹毒，风热感冒，温病初起，温热入营，高热烦渴，神昏发斑，热淋涩痛。连翘为该方中的佐药，连翘苷为连翘中特异性成分，对生物膜菌的代谢和生物膜形态均有显著影响。

板蓝根为十字花科植物菘蓝(Isatis indigotica Fort.)的干燥根；味苦，性寒。归心、胃经；具清热解毒，凉血利咽之功效；用于瘟疫时毒，发热咽痛，温毒发斑，痄腮，烂喉丹痧，大头瘟疫，丹毒，痈肿，为该方中的使药。

金银花为忍冬科植物忍冬(Lonicera japonica Thunb.)的干燥花蕾或带初开的花；味甘，性寒。归肺、心、胃经；清热解毒，疏散风热；用于痈肿疔疮，喉痹，丹毒，热毒血痢，风热感冒，温病发热，为该方中的使药。

目前，复方鱼腥草合剂的质量标准收载于《国家中成药标准汇编内科肺系(一)分册》和《新药转正标准73册》，但这两个法定标准都仅采用薄层色谱法对鱼腥草和黄芩进行了鉴别，并采用高效液相色谱法对黄芩苷含量进行了控制，要求每1ml含黄芩苷不得少于0.45mg。上述两个法定质量标准的质量指标单一，缺乏对复方鱼腥草合剂中主要药效成分槲皮苷和连翘苷的含量控制，无法保证该品种的临床疗效。

已公开的复方鱼腥草合剂质量控制相关文献较少，多采用液相色谱方法测定黄芩苷的含量，也有部分文献增加了绿原酸的含量控制，尚未见相关文献报道复方鱼腥草合剂中同时测定槲皮苷、黄芩苷、连翘苷含量。复方鱼腥草片、复方鱼腥草胶囊、复方鱼腥草滴丸等其他制剂中有测定连翘苷、槲皮素及(R，S)-告依春含量的报道，如《RP-HPLC法同时测定复方鱼腥草片中绿原酸、连翘苷、黄芩苷的含量》(金永新,要林青等.中国药师,2004,7(7)；524-526)公开了液相色谱法测定复方鱼腥草片中绿原酸、连翘苷、黄芩苷的含量，步骤如下：采用70％乙醇超声提取主成分，Phenomenex ODS柱(250mm×4.6mm,5μm)，乙腈-0.002％磷酸溶液为流动相，梯度洗脱，流速为1.0ml/min，检测波长为280nm。但该技术方案未对鱼腥草药材的特征成分槲皮苷进行含量测定，且并不适用于对复方鱼腥草合剂中的槲皮苷等成分的含量测定。因为合剂与片剂物理形态差异大，前者在制备过程中加入大量的蜂蜜作为辅料，由于蜂蜜不仅具有很强的粘性，而且其含有大量的脂溶性物质，使得供试品的制备分离非常困难；另外，复方鱼腥草合剂中的羟苯乙酯、苯甲酸钠等的共轭结构在紫外下产生强吸收，且难以与槲皮苷、黄芩苷、连翘苷主成分分离，所以目前尚未见复方鱼腥草合剂中槲皮苷、黄芩苷和连翘苷等成分的含量测定方法报道。

《高效液相色谱法测定鱼腥草中金丝桃苷与槲皮苷的含量》(郑一敏,胥秀英,傅善权,杨艳红.现代中药研究与实践,2005,19(3)；27-28)公开了液相色谱法测定药材鱼腥草中槲皮苷和金丝桃苷的含量；《Quantitive Variation of Flavonoids in Houttuynia cordata from DifferentGeographic Origins in China》(WU Ling-Shang，SI Jin-Ping，YUAN Xiao-Qing，SHI Xue-Rong，Chinese Journal of Natural Medicines，2009,7(1))，公开了液相色谱法测定药材鱼腥草中金丝桃苷、槲皮苷、槲皮素的含量，方法均为：采用甲醇或甲醇-水提取主成份，提取液滤过，干燥，滤液蒸干得残渣，用甲醇-水溶液溶解残渣；十八烷基硅胶键合相色谱柱(150mm×4.6mm,5μm)，甲醇-0.2％磷酸溶液为流动相，等度洗脱，紫外检测器检测。鱼腥草干燥品及复方鱼腥草合剂能够完全溶解于甲醇或甲醇-水中，而复方鱼腥草合剂物理形态、成分种类差异大，甲醇或甲醇-水并不能有效去除复方鱼腥草合剂中的杂质成分，富集待测目标成分。故认为以上两种技术方案并不适用于对复方鱼腥草合剂中的槲皮苷等成分的含量测定。《中国药典》2010版第一部公开了连翘药材中连翘苷的含量测定方法，步骤如下：甲醇浸渍后超声提取，提取液蒸干，通过中性氧化铝柱富集，50％甲醇溶解、定容，液相色谱法进行含量测定。但该技术方案针对的是单味药材连翘中连翘苷含量测定，并不适用于同时测定复方鱼腥草合剂中的槲皮苷、黄芩苷等有效成分。这是因为复方鱼腥草合剂处方组成中不仅含有连翘苷，而且含有黄芩苷、槲皮苷等黄酮苷类成分，但中性氧化铝会与黄酮类成分中的邻二酚羟基、“3-羟基，4-酮基”、“5-羟基，4-酮基”络合产生死吸附，导致槲皮苷、黄芩苷严重损失，基本检测不到这两个成分。

综上所述，目前复方鱼腥草合剂的质量测定方法仍然比较简单，质量控制指标单一，缺乏对主要药效成分的含量控制，无法保证临床疗效；尤其是对复方鱼腥草合剂中所含的槲皮苷、黄芩苷、连翘苷的成分(属于中药有效成分)难以同步检测，难以质量监控，因此，如何提供一种可满足同时检测上述三种中药有效成分的检测方法，确保质量可控、安全有效，是本领域人员急需解决的技术难题。

发明内容

本发明的目的是提供一种复方鱼腥草合剂的含量检测方法，具体为采用水饱和正丁醇提取目标成分，经过大孔树脂富集、蒸干后，用有机溶剂溶解待测目标成分，液相色谱法检测目标成分，该技术方案解决了复方鱼腥草合剂的含量检测难题，提供了一次性同时精确测定复方鱼腥草合剂中多种药效成分含量的技术方案，尤其是解决了鱼腥草特征成分槲皮苷含量测定的技术难题。

为此，本发明采用以下技术方案：

一种复方鱼腥草合剂的含量检测方法，包括如下步骤：

A、对照品溶液的制备：

分别取槲皮苷、连翘苷、黄芩苷对照品，加有机溶剂，稀释配制成混合标准溶液；有机溶剂为甲醇、乙醇中的一种；

B、供试品溶液的制备

(1)提取：取复方鱼腥草合剂，用提取溶剂振摇提取，提取次数为2～4次，蒸干提取液得残渣；提取溶剂为石油醚、乙酸乙酯、水饱和正丁醇中的一种；

(2)大孔树脂富集：取步骤(1)的残渣加水5～15ml溶解，过大孔树脂柱，先用水50～200ml洗脱，弃去水洗液，再用30％乙醇30～100ml洗脱，弃去洗脱液，继续用60％～80％乙醇50～200ml洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加50％甲醇，溶解，定容至10～50ml；

C、检测

采用高效液相色谱法(参照《中国药典》2010版附录VID)，色谱条件为：以Phenyl键合固定相为填料；柱温为30～45℃；检测波长为250～300nm；理论塔板数按槲皮苷峰计算应不低于4000；流动相为乙腈-0.5％乙酸溶液；流速为1.0～1.5ml/min，分别取对照品溶液和供试品溶液10μL注入液相色谱仪，测定，即得。

优选的，步骤A中的有机溶剂为甲醇。

优选的，步骤A中的混合标准溶液，由0.016mg/ml槲皮苷、0.45mg/ml的黄芩苷和0.020mg/ml连翘苷组成。

优选的，步骤B中提取溶剂为水饱和正丁醇。

优选的，步骤B中提取条件为：取复方鱼腥草合剂25ml，用水饱和正丁醇25ml振摇提取，提取次数为3次，蒸干提取液得残渣。

优选的，步骤B中大孔树脂富集条件为：取步骤(1)的残渣加水10ml溶解，过大孔树脂柱，先用水100ml洗脱，弃去水洗液，再用30％乙醇50ml洗脱，弃去洗脱液，继续用70％乙醇100ml洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加50％甲醇溶解，定容至25ml。

更优选的，步骤B中大孔树脂选用D101型，其内径为1.5cm，柱高为6cm。

优选的，步骤C的色谱条件为：选用Agilent Zorbax SB-phenyl为色谱柱，色谱柱的柱长为250mm，内径为4.6mm，填料粒径为5μm；柱温为40℃；检测波长为277nm；流动相为乙腈-0.5％乙酸溶液；流速为1.5ml/min；分别取对照品溶液及供试品溶液各10μL，注入液相色谱仪，测定，即得。

更优选的，流动相中乙腈与0.5％乙酸的体积比为18.5：81.5。

本发明提供的一种复方鱼腥草合剂的含量检测方法，具有如下有益效果：

(1)鱼腥草为复方鱼腥草合剂的君药，薄层色谱法制备目标成分，LC-MS及LC-DAD证明槲皮苷为复方鱼腥草合剂中鱼腥草的特征成分。本专利申请首次建立一种可以同时检测复方鱼腥草合剂中槲皮苷、黄芩苷、连翘苷含量方法，为复方鱼腥草制剂提供更加可靠的质量控制方法，保证药物临床疗效。

(2)水饱和正丁醇能够将槲皮苷、黄芩苷和连翘苷充分提取，尤其是槲皮苷的转移率极高，而采用石油醚、乙酸乙酯等方式提取槲皮苷的转移率非常低；

(3)采用水洗、30％乙醇洗脱大孔树脂，用70％乙醇洗脱待测目标成分，不但可以有效排除供试品中蜂蜜等糖类干扰，而且能够去除香豆素、木脂素、甾醇类，以及鞣质、蛋白质等非目标成分，减少这些非目标成分对待测成分的影响。

(4)槲皮苷、黄芩苷、连翘苷等目标成分均含有苯环，有机杂质中普遍存在含苯环成分，这些杂质的紫外吸收强度是待测目标成分的数倍，且使用普通十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱不能实现有效分离；本专利申请的发明人意外发现，苯基键合相色谱柱能够显著提高槲皮苷、黄芩苷、连翘苷与含苯环杂质成分的分离度，尤其是使用乙腈-0.5％冰醋酸液作为流动相，更明显的分离效果使待测目标成分在此色谱条件下达到基线分离。

本专利申请不仅通过水饱和正丁醇萃取，解决了复方鱼腥草合剂中鱼腥草特征成分的提取、测定，而且采用苯基键合相色谱柱，解决了目标成分检测问题；此外，采用本专利申请提供的检测方法，可以同步检测槲皮苷、黄芩苷和连翘苷三种目标成分，方法专属性强，操作简便，具有良好的应用价值。

附图说明

图1：为复方鱼腥草合剂使用Agilent ZORBAX SB-C18色谱柱检测的高效液相色谱图，无法检测到待测目标产物；

图2：为复方鱼腥草合剂使用Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18色谱柱检测的高效液相色谱图，无法检测到待测目标产物；

图3：为复方鱼腥草合剂使用Agilent ZORBAX SB-Phenyl色谱柱检测的高效液相色谱图，1为槲皮苷，2为黄芩苷，3为连翘苷。

图4：为复方鱼腥草合剂采用色谱条件1检测的高效液相色谱图，2为黄芩苷，3为连翘苷。

图5：为复方鱼腥草合剂采用色谱条件2检测的高效液相色谱图，可以有效检测待测目标产物，1为槲皮苷，2为黄芩苷，3为连翘苷；

图6：为复方鱼腥草合剂采用色谱条件3检测的高效液相色谱图，1为槲皮苷，2为黄芩苷，3为连翘苷，但槲皮苷与某未知成分的分离度不好。

图7：为复方鱼腥草合剂上过中性氧化铝柱，70％乙醇洗脱收集待测目标产物的高效液相色谱图，3为连翘苷；

图8：为复方鱼腥草合剂上D101大孔树脂柱，水洗，30％乙醇洗后，70％乙醇洗脱收集待测目标产物的高效液相色谱图，1为槲皮苷，2为黄芩苷，3为连翘苷。

图9：为对照品检测的高效液相色谱图，1为槲皮苷，2为黄芩苷，3为连翘苷；

图10：为槲皮苷阴性供试品检测的高效液相色谱图，2为黄芩苷，3为连翘苷；

图11：为黄芩苷阴性供试品检测的高效液相色谱图，1为槲皮苷，3为连翘苷；

图12：为连翘苷阴性供试品检测的高效液相色谱图，1为槲皮苷，2为黄芩苷。

图13：为槲皮苷线性图，其线性回归方程为Y＝2824.2x-3.785(R2＝0.999)，在0.036ug～0.90ug范围内线性关系良好；

图14：为黄芩苷线性图，其线性回归方程为Y＝385.7x-4.875(R2＝1.000)，在0.8ug～20ug范围内线性关系良好；

图15：为连翘苷线性图，其线性回归方程为Y＝1294.5x+10.62(R2＝0.999)，在0.048ug～1.2ug范围内线性关系良好。

具体实施方式

下面的实施例，用于进一步说明和描述本发明，但并不意味着本发明仅限于此。

以下是本发明具体实施例所涉及的仪器、材料的来源介绍：

仪器：Agilent 1260液相色谱仪、Agilent ZORBAX SB-C18、Agilent Eclipse XDB-C18、Agilent SB-Phenyl色谱柱、DK-S26水浴锅。

材料：去离子水、石油醚(AR，国药集团化学试剂有限公司)、乙酸乙酯(AR，国药集团化学试剂有限公司)、正丁醇(AR，国药集团化学试剂有限公司)、甲醇(AR，国药集团化学试剂有限公司)、乙醇(AR，国药集团化学试剂有限公司)、D101大孔树脂(北京鹏林生物技术有限公司)、复方鱼腥草合剂(批号130708、140305、140306、140307)；槲皮苷(批号为111538-200504，中国药品生物制品检定所)；黄芩苷(批号110715-201117，中国食品药品检定研究院)；连翘苷(批号110821-201213，中国食品药品检定研究院)

实施例1、色谱柱考察

色谱柱类型：

1#：Agilent ZORBAX SB-C18，其柱长为250mm，内径为4.6mm，填料粒径为5μm；

2#：Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18，其柱长为250mm，内径为4.6mm，填料粒径为5μm；

3#：Agilent ZORBAX SB-Phenyl，其柱长为250mm，内径为4.6mm，填料粒径为5μm；

A、对照品溶液的制备：

分别取槲皮苷、黄芩苷、连翘苷对照品，用甲醇作溶剂，稀释配制成混合标准溶液，配制成浓度为0.016mg/ml槲皮苷、0.45mg/ml的黄芩苷、0.020mg/ml连翘苷对照品溶液；

B、供试品溶液的制备：

精密吸取供试品25.0ml，用水饱和正丁醇分3次振摇提取，每次25ml，合并提取液，蒸干，残渣加水10ml使溶解，过D101大孔树脂柱(内径1.5cm，柱高12cm)，先用水100ml洗脱，弃去水洗液，再用30％乙醇50ml洗脱，弃去洗脱液，继续用70％乙醇100ml洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加50％甲醇转移，定容至25ml。

C、检测：

照高效液相色谱法(《中国药典》2010版附录VI D)，分别用上述色谱柱检测；柱温为40℃；检测波长为277nm；以乙腈-0.5％乙酸溶液为流动相；流速为1.5ml/min，分别取对照品溶液和供试品溶液10μL注入液相色谱仪，测定，即得。

结果表明，Agilent ZORBAX SB-C18和Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18的分离度较差，无法用于检测槲皮苷、黄芩苷、连翘苷；而Agilent ZORBAX SB-Phenyl对上述三成分的分离效果较好，见附图1、附图2、附图3。

实施例2、色谱条件考察

对照品溶液和供试品溶液的制备方法同实施例1，检测条件如下：

色谱条件1：参考《RP-HPLC法同时测定复方鱼腥草片中绿原酸、连翘苷、黄芩苷的含量》，以十八烷基硅烷键合硅胶为填料，以乙腈为流动相A，0.002％磷酸溶液为流动相B，按表1洗脱条件进行梯度洗脱；流速为1.0ml/min检测波长为280nm；分别取对照品溶液和供试品溶液10μL注入液相色谱仪，测定，即得。结果见附图4。

表1 洗脱条件

时间(min)	流动相A(％)	流动相B(％)
			0	10	90
6	30	70
			21.6	47.4	52.6
23.6	47.4	52.6
			25	50.7	49.3

色谱条件2：照高效液相色谱法(《中国药典》2010版附录VID)，以Agilent ZORBAXSB-Phenyl(柱长为250mm，内径为4.6mm，填料粒径为5μm)为色谱柱；柱温为40℃；检测波长为277nm；流动相为乙腈-0.5％乙酸溶液(体积比为18.5:81.5)；流速为1.5ml/min，分别取对照品溶液和供试品溶液10μL注入液相色谱仪，测定，即得。结果见附图5。

色谱条件3：照高效液相色谱法(《中国药典》2010版附录VID)，以Agilent ZORBAXSB-Phenyl(柱长为250mm，内径为4.6mm，填料粒径为5μm)为色谱柱；柱温为40℃；检测波长为277nm；流动相为乙腈-0.5％磷酸溶液(笔记比为18.5:81.5)；流速为1.5ml/min，分别取对照品溶液和供试品溶液10μL注入液相色谱仪，测定，即得。结果见附图6。

结果表明，附图4仅检测到2黄芩苷、3连翘苷峰，未见1槲皮苷峰；附图5中1槲皮苷、2黄芩苷和3连翘苷峰分离度良好；附图6中2黄芩苷、3连翘苷分离度良好，但1槲皮苷的分离度较差。因此，流动相为乙腈-0.5％乙酸溶液(体积比为18.5:81.5)，以AgilentZORBAX SB-Phenyl(柱长为250mm，内径为4.6mm，填料粒径为5μm)为色谱柱对于待测目标产物具有较好的分离度。

实施例3、供试品溶液制备方法-提取溶剂、用量、次数考察

A、对照品溶液的制备：

分别取槲皮苷、黄芩苷、连翘苷对照品，用甲醇作溶剂，稀释配制成混合标准溶液，配制成浓度为0.016mg/ml槲皮苷、0.45mg/ml的黄芩苷、0.020mg/ml连翘苷对照品溶液；

B、供试品溶液的制备：

精密吸取复方鱼腥草合剂(批号：130708)25.0ml，九份，进行试验：按L9(34)正交表设计提取溶剂、溶剂用量及提取次数，并按表2正交，正交结果见表3～表6。合并提取液，蒸干，残渣加水10ml使溶解，过D101大孔树脂柱(内径1.5cm，柱高12cm)，先用水100ml洗脱，弃去水洗液，再用30％乙醇50ml洗脱，弃去洗脱液，继续用70％乙醇100ml洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加50％甲醇转移，定容至25ml。

C、检测：

照高效液相色谱法(《中国药典》2010版附录VID)，以Agilent ZORBAX SB-Phenyl(柱长为250mm，内径为4.6mm，填料粒径为5μm)为色谱柱；柱温为40℃；检测波长为277nm；以体积比为18.5％的乙腈和81.5％的0.5％乙酸溶液为流动相；流速为1.5ml/min，分别取对照品溶液和供试品溶液10μL注入液相色谱仪，测定，即得。

结果表明，A3B3C2为最优条件，即每次25ml水饱和正丁醇振摇提取3次，能最大限度同时提取槲皮苷、黄芩苷、连翘苷三种待测目标成分。

表2 因素水平表

表3 正交试验结果及直观分析表

表4 槲皮苷方差分析表

表5 黄芩苷方差分析表

表6 连翘苷方差分析表

实施例4、供试品溶液制备方法-洗脱溶剂考察

对照品溶液制备方法和检测条件同实施例3。

供试品溶液的制备：精密吸取复方鱼腥草合剂(批号：130708)25.0ml，三份，用水饱和正丁醇分3次振摇提取，每次25ml，合并提取液，蒸干，残渣加水10ml使溶解，过D101大孔树脂柱(内径1.5cm，柱高12cm)，先用水100ml洗脱，弃去水洗液，再用30％乙醇50ml洗脱，弃去洗脱液，三份样品继续分别用60％乙醇、70％乙醇、80％乙醇100ml洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加50％甲醇转移，定容至25ml。

结果表明，70％乙醇为最佳洗脱溶剂，能最大限度同时洗脱槲皮苷、黄芩苷、连翘苷三种待测目标成分，见表7。

表7 不同洗脱溶剂考察结果

洗脱溶剂	槲皮苷(ug/ml)	黄芩苷(mg/ml)	连翘苷(ug/ml)
				60％乙醇	10.34	0.70	12.73
70％乙醇	11.56	0.93	15.45
				80％乙醇	11.53	0.92	15.37

实施例5、供试品溶液制备方法-不同填料考察

对照品溶液制备方法和检测条件同实施例3。

供试品溶液的制备：精密吸取复方鱼腥草合剂(批号：130708)25.0ml，二份，用水饱和正丁醇分3次振摇提取，每次25ml，合并提取液，蒸干，得残渣。

填料1、残渣加水10ml使溶解，过D101大孔树脂柱(内径1.5cm，柱高12cm)，先用水100ml洗脱，弃去水洗液，再用30％乙醇50ml洗脱，弃去洗脱液，继续用70％乙醇100ml洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加50％甲醇转移，定容至25ml。

填料2、残渣加中性氧化铝0.5g，少量甲醇拌匀，挥干，加在中性氧化铝柱(100～120目，1g，内径为1～1.5cm)上，用70％乙醇80ml洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加50％甲醇转移，定容至25ml。

结果表明，中性氧化铝会与黄芩苷、槲皮苷络合产生死吸附，基本检测不到黄芩苷、槲皮苷含量，而D101大孔树脂具有很好的吸附和洗脱效果，故选择D101大孔树脂作为富集目标成分的填料，见附图7、附图8。

实施例6、专属性考察

对照品溶液制备方法和检测条件同实施例3。

槲皮苷阴性供试品溶液的制备：精密量取鱼腥草阴性25ml，用水饱和正丁醇分3次振摇提取，每次25ml，合并提取液，蒸干，残渣加水10ml使溶解，过D101大孔树脂柱(内径1.5cm，柱高12cm)，先用水100ml洗脱，弃去水洗液，再用30％乙醇50ml洗脱，弃去洗脱液，继续用70％乙醇100ml洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加50％甲醇转移，定容至25ml。

黄芩苷阴性供试品溶液：精密量取黄芩阴性25ml，照槲皮苷阴性供试品溶液制备方法制备，即得。

连翘苷阴性供试品溶液：精密量取连翘阴性25ml，照槲皮苷阴性供试品溶液制备方法制备，即得。

结果表明，阴性供试品溶液对供试品测定无干扰作用，专属性好，见附图9、附图10、附图11、附图12。

实施例7：线性考察

精密称取槲皮苷、黄芩苷、连翘苷对照品适量，配制成浓度分别为90ug/ml、2.0mg/ml、120ug/ml的混合对照品溶液，作为混合对照品储备液，精密吸取储备液1ml、2ml、5ml、10ml、20ml、25ml分别置25ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，注入液相色谱仪，测定(检测条件同实施例3)，即得。

结果表明，槲皮苷线性回归方程为Y＝2824.2x-3.785(R2＝0.999)，在0.036ug～0.90ug范围内线性关系良好，见附图13。

黄芩苷线性回归方程为Y＝385.7x-4.875(R2＝1.000)，在0.8ug～20ug范围内线性关系良好，见附图14。

连翘苷线性回归方程为Y＝1294.5x+10.62(R2＝0.999)，在0.048ug～1.2ug范围内线性关系良好，见附图15。

实施例8、仪器精密度考察

依照实施例1中供试品溶液的制备方法制备供试品溶液(批号130708)，连续进样测定6次(检测条件同实施例3)，记录供试品色谱中槲皮苷、黄芩苷、连翘苷峰面积值。

结果表明，槲皮苷、黄芩苷、连翘苷RSD分别为0.21％，0.43％，0.16％，仪器精密度良好。

实施例9、溶液稳定性考察

依照实施例1中供试品溶液的制品方法制备供试品溶液(批号130708)，分别于配制后0、1、2、4、8、24、48h，精密吸取同一供试品溶液依法测定(检测条件同实施例3)，记录供试品色谱中槲皮苷、黄芩苷、连翘苷各成分峰面积值。

结果表明，槲皮苷、黄芩苷、连翘苷RSD分别为1.20％，0.20％，2.14％，溶液在48h内稳定性好。

实施例10、重复性考察

取同一批样品(批号130708)，6份，依照实施例1中供试品溶液的制品方法制备供试品溶液，依法测定(检测条件同实施例3)，记录供试品色谱中槲皮苷、黄芩苷、连翘苷各成分峰面积值，计算含量。

结果表明，槲皮苷、黄芩苷、连翘苷RSD分别为1.12％，0.10％，2.14％，重复性良好，见表8。

表8 重复性考察

实施例11、中间精密度考察

不同的人员，不同的时间分别精密称取同一批样品(批号：130708)6份，依照实施例1中供试品溶液的制品方法制备供试品溶液，依法测定(检测条件同实施例3)，记录供试品色谱中槲皮苷、黄芩苷、连翘苷各成分峰面积值，计算含量。

结果表明，槲皮苷、黄芩苷、连翘苷RSD分别为2.20％，0.27％，1.73％，中间精密度良好，见表9。

表9 中间精密度考察

实施例12、准确度考察

精密量取已知含量的同一批样品(批号：130708)12.5ml，水12.5ml，6份，摇匀，然后分别精密加入对照品溶液适量，依照实施例1中供试品溶液的制品方法制备供试品溶液，依法测定(检测条件同实施例3)，记录供试品色谱中槲皮苷、黄芩苷、连翘苷各成分峰面积值，计算回收率。

结果表明，槲皮苷、黄芩苷和连翘苷的平均回收率分别为100.85％、99.50％、97.14％，RSD分别为1.55％，0.15％，0.97％，加样回收率良好，见表10。

表10 准确度考察

实施例13、不同批次复方鱼腥草合剂中槲皮苷、黄芩苷、连翘苷的含量测定

对照品溶液的制备 分别取槲皮苷、连翘苷、黄芩苷对照品，用甲醇稀释配制成混合标准溶液，配制成浓度为0.016mg/ml槲皮苷、0.45mg/ml的黄芩苷、0.020mg/ml连翘苷对照品溶液；

供试品溶液制备 精密吸取供试品25.0ml，用水饱和正丁醇分3次振摇提取，每次25ml，合并提取液，蒸干，残渣加水10ml使溶解，过D101大孔树脂柱(内径1.5cm，柱高12cm)，先用水100ml洗脱，弃去水洗液，再用30％乙醇50ml洗脱，弃去洗脱液，继续用70％乙醇100ml洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加50％甲醇转移，定容至25ml。

检测条件 照高效液相色谱法(《中国药典》2010版附录VID)，以Agilent ZORBAXSB-Phenyl(柱长为250mm，内径为4.6mm，填料粒径为5μm)为色谱柱；柱温为40℃；检测波长为277nm；以体积比为18.5％的乙腈和81.5％的0.5％乙酸溶液为流动相；流速为1.5ml/min，分别取对照品溶液和供试品溶液10μL注入液相色谱仪，测定，即得。

结果见表11。

表11 不同批次复方鱼腥草合剂检测结果

批号	槲皮苷ug/ml	黄芩苷mg/ml	连翘苷ug/ml
				140305	22.0	0.93	14.4
140306	21.2	0.82	15.6
				140307	19.6	0.96	16.3

Claims (9)

1.一种复方鱼腥草合剂的含量检测方法，包括如下步骤：

A、对照品溶液的制备：

分别取槲皮苷、连翘苷、黄芩苷对照品，加有机溶剂，稀释配制成混合标准溶液；所述有机溶剂为甲醇、乙醇中的一种；

B、供试品溶液的制备

(1)提取：取复方鱼腥草合剂，用提取溶剂振摇提取，提取次数为2～4次，蒸干提取液得残渣；所述提取溶剂为石油醚、乙酸乙酯、水饱和正丁醇中的一种；

(2)大孔树脂富集：取步骤(1)的残渣加水5～15ml溶解，过大孔树脂柱，先用水50～200ml洗脱，弃去水洗液，再用30％乙醇30～100ml洗脱，弃去洗脱液，继续用60％～80％乙醇50～200ml洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加50％甲醇，溶解，定容至10～50ml；

C、检测

采用高效液相色谱法，色谱条件为：以Phenyl键合固定相为填料；柱温为30～45℃；检测波长为250～300nm；理论塔板数按槲皮苷峰计算应不低于4000；流动相为乙腈-0.5％乙酸溶液；流速为1.0～1.5ml/min，分别取对照品溶液和供试品溶液10μL注入液相色谱仪，测定，即得。

2.如权利要求1所述的一种复方鱼腥草合剂的含量检测方法，其特征在于，所述步骤A中的有机溶剂为甲醇。

3.如权利要求1所述的一种复方鱼腥草合剂的含量检测方法，其特征在于，所述步骤A中的混合标准溶液由0.016mg/ml槲皮苷、0.45mg/ml的黄芩苷和0.020mg/ml连翘苷组成。

4.如权利要求1所述的一种复方鱼腥草合剂的含量检测方法，其特征在于，所述步骤B中提取溶剂为水饱和正丁醇。

5.如权利要求1所述的一种复方鱼腥草合剂的含量检测方法，其特征在于，所述步骤B中提取条件为：取复方鱼腥草合剂25ml，用水饱和正丁醇25ml振摇提取，提取次数为3次，蒸干提取液得残渣。

6.如权利要求1所述的一种复方鱼腥草合剂的含量检测方法，其特征在于，所述步骤B中大孔树脂富集条件为：取步骤(1)的残渣加水10ml溶解，过大孔树脂柱，先用水100ml洗脱，弃去水洗液，再用30％乙醇50ml洗脱，弃去洗脱液，继续用70％乙醇100ml洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加50％甲醇溶解，定容至25ml。

7.如权利要求1或6所述的一种复方鱼腥草合剂的含量检测方法，其特征在于，所述步骤B中大孔树脂选用D101型，其内径为1.5cm，柱高为6cm。

8.如权利要求1所述的一种复方鱼腥草合剂的含量检测方法，其特征在于，所述步骤C的色谱条件为：选用Agilent Zorbax SB-phenyl为色谱柱，色谱柱的柱长为250mm，内径为4.6mm，填料粒径为5μm；柱温为40℃；检测波长为277nm；流动相为乙腈-0.5％乙酸溶液；流速为1.5ml/min；分别取对照品溶液及供试品溶液各10μL，注入液相色谱仪，测定，即得。

9.如权利要求1或8所述的一种复方鱼腥草合剂的含量检测方法，其特征在于，所述流动相中乙腈与0.5％乙酸的体积比为18.5：81.5。