CN105301130B - 一种检测麦冬中黄酮含量的高效液相色谱方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种检测麦冬中黄酮含量的高效液相色谱方法，包括以下步骤：a、取麦冬黄酮的对照品，制备对照品溶液，用高效液相色谱方法进行检测，得到标准曲线；b、取待检的麦冬样品，制备供试品溶液，用高效液相色谱方法进行检测；c、计算麦冬样品中的黄酮含量；步骤a和b所用高效液相色谱方法的色谱条件为：C18色谱柱；流动相为乙腈‑水溶液，乙腈与水的体积比为35：65～65：35。本发明高效液相色谱方法，采用等度洗脱，便于操作，检测方法简单，且具有良好的线性关系、精密度、稳定性和重复性，加样回收率高，检测结果准确、可靠。

Description

一种检测麦冬中黄酮含量的高效液相色谱方法

技术领域

本发明涉及一种检测麦冬中黄酮含量的高效液相色谱方法。

背景技术

中药材成分复杂，功效众多，其质量评价正向快速、高效、样品前处理简单、高重复性、低成本、容易操作的方向发展。HPLC同时测定多种成分的检测方法已成为当前分析研究中药材、中成药质量的最有效方法之一。特别是对于一些多基源、多产地品种，多种成分评价更能真实的反应不同来源药材质量的差异性，为临床用药提供更为可靠的参考依据。

麦冬，来源于百合科沿阶草属植物Ophiopogon japonicus(L.f)Ker-Gawl.的干燥块根，是常用中药材之一，主要用于治疗肺燥干咳，阴虚痨嗽，喉痹咽痛，津伤口渴，内热消渴等疾病，已收录在《中国药典2010年版》一部中，其产地主要分布在四川、浙江、湖北、山东、安徽等。

麦冬的有效成分中，包括甲基麦冬黄烷酮A、甲基麦冬黄烷酮B、6-醛基异麦冬黄烷酮A、麦冬甲基黄烷酮A、甲基麦冬二氢高异黄酮B等多种黄酮成分。为了有效的监控麦冬药材的产品质量，需要对麦冬中的多种黄酮成分一一进行含量测定。

中国专利CN 102445502 A、CN 102759582 A测定了甲基麦冬黄烷酮A、甲基麦冬黄烷酮B、6-醛基异麦冬黄烷酮A这3种黄酮成分的含量，其高效液相色谱检测方法需要采用特定的梯度洗脱条件，才能实现较好的检测效果，存在操作复杂、出峰时间长等缺陷。

为了解决现有检测方法中存在的问题，同时为了更有效的监控麦冬药材的产品质量，我们寻求建立一种检测麦冬药材的新方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种检测麦冬中黄酮含量的高效液相色谱方法。

本发明提供的一种检测麦冬中黄酮含量的高效液相色谱方法，包括以下步骤：

a、取麦冬黄酮的对照品，制备对照品溶液，用高效液相色谱方法进行检测，得到标准曲线；

b、取待检的麦冬样品，制备供试品溶液，用高效液相色谱方法进行检测；

c、计算麦冬样品中的黄酮含量；

步骤a和b所用高效液相色谱方法的色谱条件为：C18色谱柱；流动相为乙腈-水溶液，乙腈与水的体积比为35：65～65：35。

进一步的，步骤a中，麦冬黄酮的对照品选自甲基麦冬高黄酮A、麦冬甲基黄烷酮A、甲基麦冬二氢高异黄酮B中的任意一种或两种以上。

进一步的，步骤a中，制备对照品溶液的溶剂为甲醇。

进一步的，步骤a中，所述标准曲线是对照品色谱峰的峰面积与对照品浓度之间的线性关系方程。

进一步的，步骤b中，制备供试品溶液的方法为：取麦冬粉末，过筛，加入甲醇A，静置12h～48h后，超声提取30min～90min，过滤，滤渣加入甲醇B，超声提取15min～60min，过滤，合并滤液，过0.45μm滤膜，所得滤液即为供试品溶液；

麦冬粉末与甲醇A的重量体积比为1：6～1.5：100g/ml；麦冬粉末与甲醇B的重量体积比为1：4～1.5：60g/ml。

进一步的，所述的色谱条件中，C18色谱柱为Comatex C18柱或Kromasil 100-5C18柱；长度为250mm，内径为4.6mm，填充剂粒径为3.5μm。

进一步的，所述的色谱条件中，乙腈与水的体积比为58：42。

进一步的，所述的色谱条件中，体积流量为0.8mL/min～1.5mL/min；优选的，体积流量为1.0mL/min。

进一步的，所述的色谱条件中，检测波长为200nm～400nm；优选的，检测波长为278nm～296nm。

进一步的，所述的色谱条件中，柱温为25℃～35℃；进样量为10μL～30μL。

本发明高效液相色谱方法，采用等度洗脱，便于操作，检测方法简单，且具有良好的线性关系、精密度、稳定性和重复性，加样回收率高，检测结果准确、可靠，为麦冬药材的质量评价提供了一种行之有效的检测方法，非常有利于麦冬药材的质量评价和质量控制标准建立。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1为本发明对混合对照品和供试品溶液的高效液相色谱检测结果：混合对照品(a)和供试品溶液(b)的HPLC色谱图：1是指甲基麦冬高黄酮A的色谱峰；2是指麦冬甲基黄烷酮A的色谱峰；3是指甲基麦冬二氢高异黄酮B的色谱峰。

具体实施方式

本发明具体实施方式中使用的原料、设备均为已知产品，通过购买市售产品获得。

Agilent1200高效液相色谱仪(美国安捷伦公司，包括二元泵，自动进样器，DAD检测器)，BP121S十万分之一电子天平(德国赛多利斯公司)，KQ-500DB数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)，Milli-Q Advantage A10超纯水仪(法国默克密理博)。

乙腈为色谱纯，水为超纯水，其余试剂均为分析纯；甲基麦冬高黄酮A(批号：MUST-14080709)和麦冬甲基黄烷酮A(批号：MUST-14052901)对照品由成都曼思特生物科技有限公司提供，甲基麦冬二氢高异黄酮B(批号:140525)对照品由四川维克奇生物科技有限公司提供，质量分数均≥98％；检测样品为2015年4月在三台地区收集麦冬药材，共10个批次，经成都中医药大学李敏教授鉴定为Ophiopogon japonicus(L.f)Ker-Gawl.的干燥块根。

实施例1、本发明高效液相色谱方法检测麦冬样品中黄酮含量

1、溶液制备

1.1制备混合对照品溶液

精密称定甲基麦冬高黄酮A、麦冬甲基黄烷酮A和甲基麦冬二氢高异黄酮B 3种对照品9.98、10.02、9.86mg，加甲醇超声溶解并定容至25mL，制成浓度分别为0.3992、0.4008、0.3955mg/mL的对照品供试溶液。

1.2制备供试品溶液

取待检的麦冬粉末(过4号筛)3.0g，精密称定，加甲醇50mL，静置24h，超声提取45min，过滤，滤渣加甲醇30mL，超声提取30min，过滤，合并滤液，回收溶剂至1～2ml，转入5ml容量瓶中，洗涤3～4次，洗涤液一并转入容量瓶中，定容至刻度，0.45μm滤膜滤过，得滤液即为供试品溶液。

2、色谱条件

色谱柱为Comatex C18柱(4.6mm×250mm，5μm)；流动相为乙腈:水(58:42)，体积流量1.0mL/min；柱温30℃，检测波长296nm，进样量20μL。

采用上述色谱条件的高效液相色谱方法分别检测对照品溶液、供试品溶液；按外标法以峰面积计算得到麦冬中甲基麦冬高黄酮A、麦冬甲基黄烷酮A、甲基麦冬二氢高异黄酮B的含量。

混合对照品和供试品溶液的高效液相色谱检测结果，如图1所示。

结果表明，本发明方法可以使得麦冬中甲基麦冬高黄酮A、麦冬甲基黄烷酮A、甲基麦冬二氢高异黄酮B等组分的色谱峰之间完全分离开，从而实现对麦冬药材的定性和定量检测。

实施例2、本发明高效液相色谱方法检测麦冬样品中黄酮含量

色谱条件为：色谱柱为Comatex C18柱(4.6mm×250mm，5μm)；流动相为乙腈:水(35:65)，体积流量1.2mL/min；柱温35℃，检测波长278nm，进样量15μL。

其他条件参考实施例1。

实施例3、本发明高效液相色谱方法检测麦冬样品中黄酮含量

色谱条件为：色谱柱为Kromasil 100-5C18柱(4.6mm×250mm，5μm)；流动相为乙腈:水(65：35)，体积流量0.8mL/min；柱温25℃，检测波长296nm，进样量25μL。

其他条件参考实施例1。

为了说明本发明的有益效果，本发明提供以下试验例。

试验例1、条件筛选试验

本发明对不同的流动相(乙腈-水，乙腈-0.1％磷酸水，甲醇-水)进行了筛选试验，结果表明，流动相为乙腈-水溶液，乙腈与水的体积比为35：65～65：35时，能够使得3个麦冬黄酮成分的色谱峰分离开，且其方法简便，对色谱柱的损害小；特别是，乙腈与水的体积比为58:42，3个麦冬黄酮成分色谱峰之间的分离效果最好。

本发明还考察了水、甲醇和不同浓度乙醇多种提取溶媒，同时考察了不同时间的超声和回流提取，并对三种成分进行全波长扫描筛选检测波长，最终确定了本发明的色谱条件和样品制备方法。

试验例2、方法学考察实验

1、线性关系考察

精密量取混合对照品溶液0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0mL，分别置10mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，分别按照实施例1的色谱条件依次进样，记录色谱峰面积。以峰面积为纵坐标(Y)，对照品质量浓度为横坐标(X)，绘制标准曲线，进行线性回归。回归方程及线性范围见表1。

表1、线性关系考察结果

Table 1、Results of linear relationship

结果表明，本发明高效液相色谱方法，各对照品在各自质量浓度范围内线性关系良好。

2、精密度试验

精密吸取混合对照品溶液，分别在实施例1的色谱条件下重复进样6次，以对照品峰面积进行计算，甲基麦冬高黄酮A、麦冬甲基黄烷酮A和甲基麦冬二氢高异黄酮B峰面积的RSD分别为0.47％、0.55％、0.58％。

3、稳定性试验

取待测麦冬(批号M-01)供试品溶液，按照实施例1的色谱条件操作，分别在0、2、4、6、8、12、24h进样，测定甲基麦冬高黄酮A、麦冬甲基黄烷酮A和甲基麦冬二氢高异黄酮B的峰面积，按峰面积计算得RSD分别为0.88％、1.03％、0.97％。

结果表明，本发明麦冬供试品溶液在24h内稳定，检测结果稳定，准确性高。

4、重复性试验

取同一批次(批号M-01)麦冬粉末3.0g，平行称定6份，按实施例1所述方法操作，制备麦冬供试品溶液6份，每份精密吸取15μL按照实施例1的色谱条件测定，分别测得甲基麦冬高黄酮A、麦冬甲基黄烷酮A和甲基麦冬二氢高异黄酮B质量分数的RSD分别为1.75％、1.76％、1.87％。

5、加样回收率试验

取已测定黄酮含量的麦冬药材(批号M-01)粉末6份，每份1.5g，精密称定，每份加入相同量的甲基麦冬高黄酮A、麦冬甲基黄烷酮A和甲基麦冬二氢高异黄酮B对照品，按实施例1所述方法操作，制备麦冬供试品溶液，按照实施例1的色谱条件测定，计算回收率，结果见表2。

表2、3种成分回收率(n＝6)

Table 2、Recoveries of the 3 components(n＝6)

结果表明，本发明方法的回收率高，甲基麦冬高黄酮A、麦冬甲基黄烷酮A和甲基麦冬二氢高异黄酮B的含量检测结果准确。

试验例3、本发明方法对麦冬药材进行质量分析

取待检的10份麦冬药材样品，分别称取粉末约3.0g，精密称定，按实施例1所述方法操作，制备麦冬供试品溶液，每个批号3份，按照实施例1的色谱条件进行测定，并计算样品中3种成分的质量分数，以均值作为最终测定值，结果见表3。

表3、麦冬药材中3种成分测定结果(n＝3)

Table 3、The measured result of 3 constituents in Ophiopogonis Radix

注：“——”表示未检出。

在针对麦冬质量分析的系统研究过程中，本发明研究人员还对不同基源、不同道地产区麦冬的代表黄酮成分和代表皂苷成分含量进行了检测分析，结果发现差异不同来源麦冬药材中代表成分的种类和各成分含量存在显著差异。在川麦冬中主要黄酮成分为麦冬甲基黄烷酮A和甲基麦冬高异黄酮B，麦冬甲基高黄酮A的含量很低，部分样品未能检出，因此在建立麦冬质量标准中可选择麦冬甲基黄酮A和甲基麦冬二氢高异黄酮B(麦冬甲基黄烷酮B)的总量作为考察指标。

综上所述，本发明高效液相色谱方法，采用等度洗脱，便于操作，检测方法简单，且具有良好的线性关系、精密度、稳定性和重复性，加样回收率高，检测结果准确、可靠，为麦冬药材的质量评价提供了一种行之有效的检测方法，非常有利于麦冬药材的质量评价和质量控制标准建立。

Claims (6)

1.一种检测麦冬中黄酮含量的高效液相色谱方法，其特征在于：包括以下步骤：

a、取麦冬黄酮的对照品，制备对照品溶液，用高效液相色谱方法进行检测，得到标准曲线；

b、取待检的麦冬样品，制备供试品溶液，用高效液相色谱方法进行检测；

制备供试品溶液的方法为：取麦冬粉末，过筛，加入甲醇A，静置12h～48h后，超声提取30min～90min，过滤，滤渣加入甲醇B，超声提取15min～60min，过滤，合并滤液，过0.45μm滤膜，所得滤液即为供试品溶液；

麦冬粉末与甲醇A的重量体积比为1：6～1.5：100g/ml；麦冬粉末与甲醇B的重量体积比为1：4～1.5：60g/ml；

c、计算麦冬样品中的黄酮含量；

步骤a和b所用高效液相色谱方法的色谱条件为：C18色谱柱；流动相为乙腈-水溶液，乙腈与水的体积比为58：42；检测波长为278nm～296nm；柱温为25℃～35℃；体积流量为0.8mL/min～1.5mL/min；

步骤a中，麦冬黄酮的对照品选自甲基麦冬高黄酮A、麦冬甲基黄烷酮A和甲基麦冬二氢高异黄酮B。

2.根据权利要求1所述的高效液相色谱方法，其特征在于：步骤a中，制备对照品溶液的溶剂为甲醇。

3.根据权利要求1所述的高效液相色谱方法，其特征在于：步骤a中，所述标准曲线是对照品色谱峰的峰面积与对照品浓度之间的线性关系方程。

4.根据权利要求1所述的高效液相色谱方法，其特征在于：所述的色谱条件中，C18色谱柱为Comatex C18柱或Kromasil 100-5C18柱；长度为250mm，内径为4.6mm，填充剂粒径为3.5μm。

5.根据权利要求1所述的高效液相色谱方法，其特征在于：所述的色谱条件中，体积流量为1.0mL/min。

6.根据权利要求1所述的高效液相色谱方法，其特征在于：所述的色谱条件中，进样量为10μL～30μL。