CN100445730C - 中药的柱分离洗脱液洗脱起始点或终点的快速监控方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及中药的柱分离洗脱液洗脱起始点或终点的监控方法。特别是中药的柱分离洗脱液洗脱起始点或终点的快速监控方法。快速监控方法主要通过折光率测量来完成。按每柱洗脱液体积的0.01-20倍的间隔，连续取待检测的洗脱液样品，测量洗脱液样品的折光率。本发明的折光法有简单、快速的监控洗脱液的起始点或终点的优点。折光法检测相对于常用的HPLC、UV等检测方法来说更为简便，可操作性更强。该方法可以实现在线实时检测，实验结果比较稳定精确，同时所需要的仪器设备简单，操作也非常方便易行，适用于实验室研究和工业生产，应用非常广泛。
Description
技术领域
本发明涉及中药的柱分离洗脱液洗脱起始点或终点的监控方法。特别是中药的柱分离洗脱液洗脱起始点或终点的快速监控方法。快速监控方法主要通过折光率测量来完成。本发明另一种表达方式是：折光率测量在中药的柱分离洗脱液洗脱起始点或终点的快速监控中的应用。
另外要特别申明的是柱分离与柱层析是同等概念，在学术界不同专家对其称谓有两种叫法，但表达的意思相同，本发明的柱分离与柱层析都是指用柱来分离不同成分的技术。
背景技术
柱分离过程是一种不同分子相互分离的过程，当一混合样品被导入一固定相的支持体中，而另一流体即移动相通过时，由于样品各组分与固定相和移动相相互作用的大小不同，使各组分通过固定相支持体的速率不同而得分离。
柱分离根据分离原理不同分为分配柱分离、吸附柱分离、离子交换柱分离、排阻柱分离等。根据混合样品组分类型的不同，柱分离用的固定相也不同，常用的固定相有大孔树脂、硅胶、聚酰胺、氧化铝、硅藻土等。
目前，柱分离在中药科研、生产应用越来越多，但是至今在应用中还是缺乏规范、成熟、成套、快捷的技术。尤其是对于柱分离洗脱液起点和终点的判断还是“盲法”操作，大多数操作者是根据洗脱液的颜色变化和柱子内色谱带的移动情况对洗脱液起点和终点进行判断，难以保障产品质量的稳定、均一。
“盲法”判断受主观因素的影响多，与中药现代化需要快速准确监控生产的目标不相符合。
通过UV法检测、HPLC法检测可以准确监控生产，但UV法检测、HPLC法检测的缺点是费时，不能完成快速监控生产的目标。每一种中药体系的UV法检测、HPLC法检测都需要根据不同中药体系配置相关溶液，调整测量参数。即使固定了生产和UV法、HPLC法检测操作规程，UV法、HPLC法的数据呈报最少需耗时十几至数十分钟，这种工作消耗的时间和人力足以抵消其准确监控生产的优点，反而让“盲法”的经验判断操作回归现实的生产控制。
在现实的中药生产中，因中药原料来自不同的地方，收购的时间也不同，导致中药原料的批次差异，所以当依靠柱分离或柱层析技术获得不同的中药有效成分时，即使针对同一中药，每一次洗脱液的起始点或终点都有差异。因中药原料的批次差异的影响，依靠固定的生产操作来分离中药成分是不够精确的，最好的方式是能够简单、准确、快速的监控洗脱液的起始点或终点，从而即时调整洗脱液的用量和更换洗脱液的种类，以利于中药现代化生产。
而目前依靠主观经验判断的“盲法”和UV法、HPLC法都无法同时解决简单、快速的监控洗脱液的起始点或终点的技术要求。
发明内容
本发明的目的是提供一种简单、快速的监控洗脱液的起始点或终点的方法，特别是中药的柱分离洗脱液洗脱起始点或终点的快速监控方法。
本发明的目的也可以是：折光率测量在中药的柱分离洗脱液洗脱起始点或终点的快速监控中的应用。
本发明的技术方案为：
中药的柱分离洗脱液洗脱起始点或终点的快速监控方法，其中：按每柱洗脱液体积的0.01-20倍的间隔，连续取待检测的洗脱液样品，测量洗脱液样品的折光率。
中药的柱分离洗脱液洗脱起始点或终点的快速监控方法，其中：按每柱洗脱液体积的0.1-2倍的间隔，连续取待检测的洗脱液样品，测量洗脱液样品的折光率。
中药的柱分离洗脱液洗脱起始点或终点的快速监控方法，其中：按每柱洗脱液体积的0.2-1倍的间隔，连续取待检测的洗脱液样品，测量洗脱液样品的折光率。
中药的柱分离洗脱液洗脱起始点或终点的快速监控方法，其中：将测量洗脱液样品的折光率数据建立或不建立数据库，对数据进行或不进行处理。
中药的柱分离洗脱液洗脱起始点或终点的快速监控方法，其中：所述中药是单味中药材、多味中药材、单味中药制剂、中药复方制剂、中西药复方制剂中的任意一类。
中药的柱分离洗脱液洗脱起始点或终点的快速监控方法，其中：中药的柱分离所用的固定相可以是树脂、硅胶、凝胶、聚酰胺、氧化铝、硅藻土中的任意一种，其中检测洗脱液所用仪器设备为利用折光原理设计的仪器设备。
中药的柱分离洗脱液洗脱起始点或终点的快速监控方法，其中：中药的柱分离所用的固定相树脂是大孔树脂。
中药的柱分离洗脱液洗脱起始点或终点的快速监控方法，其中：洗脱液可以是水、单一或混合的有机溶剂。
折光率测量在中药的柱分离洗脱液洗脱起始点或终点的快速监控中的应用。
折光率测量在中药的柱分离洗脱液洗脱起始点或终点的快速监控中的应用，其中：按每柱洗脱液体积的0.1-2倍的间隔，连续取待检测的洗脱液样品，测量洗脱液样品的折光率。
折光率测量在中药的柱分离洗脱液洗脱起始点或终点的快速监控中的应用，其中：按每柱洗脱液体积的0.2-1倍的间隔，连续取待检测的洗脱液样品，测量洗脱液样品的折光率。
快速监控方法主要通过折光率测量来完成。
本发明原理是根据不同溶液含不同成分时所显示折光率相异，并且在一定范围内溶液的浓度和折光率成比例的关系，采用折光率测定法对柱分离中药成分洗脱的起始点和终点进行检测判断。为了达到上述目的，本发明研究了不同中药材及复方制剂样品上样，洗脱，检测的过程。
本发明采用的折光仪器--手持式折射计、阿贝折射仪等是一种通过折射率来测量溶液中成分浓度的仪器。所有溶液均能使光的方向发生偏折。光的偏折可以随溶液成分浓度的增加而增大。其操作过程是将样品滴2-3滴至折光仪镜面上，调节目镜，使阴暗面清晰，阴暗交界线对应的刻度值为所测折光值。
本发明的优点在于：
本发明的折光法有简单、快速的监控洗脱液的起始点或终点的优点。折光法检测相对于常用的HPLC、UV等检测方法来说更为简便，可操作性更强。该方法可以实现在线实时检测，实验结果比较稳定精确，同时所需要的仪器设备简单，操作也非常方便易行，适用于实验室研究和工业生产，应用非常广泛。
折光法和UV法、HPLC法的洗脱液中有效成分变化规律基本相似。但三者方法放映的方式不同，折光法放映整体成分对折光的影响；UV法放映某类成分对紫外吸收的影响；HPLC法只放映单个成分的变化规律；折光法较后两者有简便、快捷、成本低等优点，缺点是灵敏度不及后两者。但在监控生产过程中折光法比UV法、HPLC法更快速，有很好的实用性。适应实际生产监控的需要。
由于本发明强调实用性，强调快速的适应实际生产监控，对准确度的要求稍微放低，在普通的情况下，直接通过折光率的变化，来了解和监控洗脱液的起始点或终点就可以起到比盲法更好的效果。在普通的情况下，并不需要像慢速的UV法、HPLC法那样的精确度。
但为了更好的保证快速监控的精确度，可以对折光率的变化进行数据处理，以便将折光率的变化放大后，可以更直观的判断监控洗脱液的起始点或终点。
在部分试验例中，例如试验例4、5，不对折光率进行数据处理，也可以帮助判断洗脱液的起始点或终点。但对折光率进行数据处理，例如试验例1、2、3，能更准确的监控洗脱液的起始点或终点。当然如果不对试验例1、2、3的折光率进行数据处理，同样也可以判断监控洗脱液的起始点或终点。
附图说明：
说明书附图1-18为所测试验数据的图谱。详细内容见各试验例。
具体实施例
实施例1
中药的柱分离洗脱液洗脱起始点或终点的快速监控方法，其中：按每柱洗脱液体积的0.01倍的间隔，连续取待检测的洗脱液样品，测量洗脱液样品的折光率。
实施例2
中药的柱分离洗脱液洗脱起始点或终点的快速监控方法，其中：按每柱洗脱液体积的0.05倍的间隔，连续取待检测的洗脱液样品，测量洗脱液样品的折光率。
实施例3
中药的柱分离洗脱液洗脱起始点或终点的快速监控方法，其中：按每柱洗脱液体积的0.1倍的间隔，连续取待检测的洗脱液样品，测量洗脱液样品的折光率。
实施例4
中药的柱分离洗脱液洗脱起始点或终点的快速监控方法，其中：按每柱洗脱液体积的0.15倍的间隔，连续取待检测的洗脱液样品，测量洗脱液样品的折光率。
实施例5
中药的柱分离洗脱液洗脱起始点或终点的快速监控方法，其中：按每柱洗脱液体积的0.2倍的间隔，连续取待检测的洗脱液样品，测量洗脱液样品的折光率。
实施例6
中药的柱分离洗脱液洗脱起始点或终点的快速监控方法，其中：按每柱洗脱液体积的0.8倍的间隔，连续取待检测的洗脱液样品，测量洗脱液样品的折光率。
实施例7
中药的柱分离洗脱液洗脱起始点或终点的快速监控方法，其中：按每柱洗脱液体积的1倍的间隔，连续取待检测的洗脱液样品，测量洗脱液样品的折光率。
实施例8
中药的柱分离洗脱液洗脱起始点或终点的快速监控方法，其中：按每柱洗脱液体积的1.5倍的间隔，连续取待检测的洗脱液样品，测量洗脱液样品的折光率。
实施例9
中药的柱分离洗脱液洗脱起始点或终点的快速监控方法，其中：按每柱洗脱液体积的2倍的间隔，连续取待检测的洗脱液样品，测量洗脱液样品的折光率。
实施例10
中药的柱分离洗脱液洗脱起始点或终点的快速监控方法，其中：按每柱洗脱液体积的3倍的间隔，连续取待检测的洗脱液样品，测量洗脱液样品的折光率。
实施例11
中药的柱分离洗脱液洗脱起始点或终点的快速监控方法，其中：按每柱洗脱液体积的5倍的间隔，连续取待检测的洗脱液样品，测量洗脱液样品的折光率。
实施例12
中药的柱分离洗脱液洗脱起始点或终点的快速监控方法，其中：按每柱洗脱液体积的8倍的间隔，连续取待检测的洗脱液样品，测量洗脱液样品的折光率。
实施例13
中药的柱分离洗脱液洗脱起始点或终点的快速监控方法，其中：按每柱洗脱液体积的10倍的间隔，连续取待检测的洗脱液样品，测量洗脱液样品的折光率。
实施例14
中药的柱分离洗脱液洗脱起始点或终点的快速监控方法，其中：按每柱洗脱液体积的15倍的间隔，连续取待检测的洗脱液样品，测量洗脱液样品的折光率。
实施例15
中药的柱分离洗脱液洗脱起始点或终点的快速监控方法，其中：按每柱洗脱液体积的20倍的间隔，连续取待检测的洗脱液样品，测量洗脱液样品的折光率。
实施例16
中药的柱分离洗脱液洗脱起始点或终点的快速监控方法，其中：按每柱洗脱液体积的2.0倍的间隔连续取5个点，再按每柱洗脱液体积的1.0倍的间隔连续取5个点，再按每柱洗脱液体积的0.3倍的间隔连续取10个点，连续取待检测的洗脱液样品，测量洗脱液样品的折光率。
实施例17
中药的柱分离洗脱液洗脱起始点或终点的快速监控方法，其中：按每柱洗脱液体积的4.0倍的间隔连续取3个点，再按每柱洗脱液体积的1.0倍的间隔连续取10个点，再按每柱洗脱液体积的0.1倍的间隔连续取20个点，连续取待检测的洗脱液样品，测量洗脱液样品的折光率。
实施例18
中药的柱分离洗脱液洗脱起始点或终点的快速监控方法，其中：将测量洗脱液样品的折光率数据建立或不建立数据库，对数据进行或不进行处理。
实施例19
中药的柱分离洗脱液洗脱起始点或终点的快速监控方法，其中：所述中药是单味中药材，分别重复上述所有实施例。
实施例20
中药的柱分离洗脱液洗脱起始点或终点的快速监控方法，其中：所述中药是多味中药材，分别重复上述所有实施例。
实施例21
中药的柱分离洗脱液洗脱起始点或终点的快速监控方法，其中：所述中药是中药复方制剂，分别重复上述所有实施例。
实施例22
中药的柱分离洗脱液洗脱起始点或终点的快速监控方法，其中：所述中药是中西药复方制剂，分别重复上述所有实施例。
实施例23
中药的柱分离洗脱液洗脱起始点或终点的快速监控方法，其中；中药的柱分离所用的固定相可以是树脂，其中检测洗脱液所用仪器设备为利用折光原理设计的仪器设备。分别重复上述所有实施例。
实施例24
中药的柱分离洗脱液洗脱起始点或终点的快速监控方法，其中：中药的柱分离所用的固定相可以是硅胶，其中检测洗脱液所用仪器设备为利用折光原理设计的仪器设备。分别重复上述所有实施例。
实施例25
中药的柱分离洗脱液洗脱起始点或终点的快速监控方法，其中：中药的柱分离所用的固定相可以是凝胶，其中检测洗脱液所用仪器设备为利用折光原理设计的仪器设备。分别重复上述所有实施例。
实施例26
中药的柱分离洗脱液洗脱起始点或终点的快速监控方法，其中：中药的柱分离所用的固定相可以是聚酰胺，其中检测洗脱液所用仪器设备为利用折光原理设计的仪器设备。分别重复上述所有实施例。
实施例27
中药的柱分离洗脱液洗脱起始点或终点的快速监控方法，其中：中药的柱分离所用的固定相可以是氧化铝，其中检测洗脱液所用仪器设备为利用折光原理设计的仪器设备。分别重复上述所有实施例。
实施例28
中药的柱分离洗脱液洗脱起始点或终点的快速监控方法，其中：中药的柱分离所用的固定相可以是硅藻土，其中检测洗脱液所用仪器设备为利用折光原理设计的仪器设备。分别重复上述所有实施例。
实施例29
中药的柱分离洗脱液洗脱起始点或终点的快速监控方法，其中：中药的柱分离所用的固定相树脂是大孔树脂。分别重复上述所有实施例。
实施例30
中药的柱分离洗脱液洗脱起始点或终点的快速监控方法，其中：洗脱液可以是水。分别重复上述所有实施例。
实施例31
中药的柱分离洗脱液洗脱起始点或终点的快速监控方法，其中：洗脱液可以是单一的有机溶剂。分别重复上述所有实施例。
实施例32
中药的柱分离洗脱液洗脱起始点或终点的快速监控方法，其中：洗脱液可以是混合的有机溶剂。分别重复上述所有实施例。
实施例33
折光率测量在中药的柱分离洗脱液洗脱起始点或终点的快速监控中的应用。
实施例34
折光率测量在中药的柱分离洗脱液洗脱起始点或终点的快速监控中的应用，其中：按每柱洗脱液体积的0.1-2倍的间隔，连续取待检测的洗脱液样品，测量洗脱液样品的折光率。
实施例35
折光率测量在中药的柱分离洗脱液洗脱起始点或终点的快速监控中的应用，其中：按每柱洗脱液体积的0.2-1倍的间隔，连续取待检测的洗脱液样品，测量洗脱液样品的折光率。
另附部分试验例：
以下试验例中即时更换洗脱液或最终停止使用某洗脱液都是依靠适时监控折光率来做决定的。
试验例1
中药材或复方制剂经过处理得到中药材提取液及复方制剂提取液，提取液上样，置已经处理好的层析柱中，流动相洗脱，洗脱液进行检测。
大孔吸附树脂(Macfofeticulaf Resin)是六十年代末发展起来的一类有机高聚物吸附剂，具有多孔网状结构和较好的吸附性能，可以通过物理吸附从水溶液中有选择地吸附有机物。它的吸附作用是通过表面吸附、表面电性或形成氢键来完成。目前大孔吸附树脂已广泛应用于废水处理、医药工业、临床鉴定和食品等领域。而大孔树脂吸附分离技术是上世纪70年代末才逐步应用至中草药有效成分提取分离的一种分离纯化技术，它主要是采用特殊的吸附剂，从中药复方煎液中有选择的吸附其中的有效成分、去除无效成分的一种提取精制新工艺。该工艺可使药效成分高度富集，杂质减少，还可减少产品的吸潮性，有效去除重金属，解决中药重金属超标的难题。
中药丹参的柱层析分离纯化工艺流程示意如下：
丹参药材提取液过AB-8大孔树脂并检测
1、丹参药材的提取：取丹参药材200g，加入蒸馏水10倍量，提取2次，每次1小时，合并提取液，离心，减压浓缩(70℃)后，加蒸馏水使溶解至500ml。
2、上样洗脱并检测：取提取液50ml，上样(2cm×80cm树脂柱，AB-8树脂40ml)，动态吸附后，蒸馏水洗脱、接着30％乙醇洗脱后80％乙醇洗脱，10ml/份收集，并用手持糖量计(WYT-32型)检测临界液滴的折光率，每0.5柱床体积检测紫外吸收，醇洗脱部分合并每1个柱床体积HPLC法检测丹酚酸B，比较三者检测结果。
其中洗脱体积的数值是指每柱柱床体积的倍数。在下表中是指按每柱柱床体积洗脱液体积的0.25倍的间隔，连续取待检测的洗脱液样品，测量洗脱液样品的折光率。
| 洗脱溶媒 | 蒸馏水 | 蒸馏水 | 蒸馏水 | 蒸馏水 | 蒸馏水 | 蒸馏水 | 蒸馏水 | 蒸馏水 | 蒸馏水 | 蒸馏水 | 蒸馏水 |
| 洗脱体积 | 0 | 0.25 | 0.50 | 0.75 | 1.00 | 1.25 | 1.50 | 1.75 | 2.00 | 2.25 | 2.50 |
| 折光率值 | 15.5 | 15.8 | 15.8 | 9.6 | 5.0 | 2.6 | 1.4 | 0.8 | 0.6 | 0.2 | 0.1 |
| 放大值 | 25.7 | 25.8 | 25.8 | 23.3 | 20.1 | 16.8 | 13.7 | 10.9 | 9.5 | 4.0 | 0.5 |
| 洗脱溶媒 | 蒸馏水 | 蒸馏水 | 蒸馏水 | 蒸馏水 | 蒸馏水 | 30％乙醇 | 30％乙醇 | 30％乙醇 | 30％乙醇 | 30％乙醇 | 30％乙醇 |
| 洗脱体积 | 2.75 | 3.00 | 3.25 | 3.50 | 3.75 | 4.00 | 4.25 | 4.50 | 4.75 | 5.00 | 5.25 |
| 折光率值 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0.2 | 4.0 | 9.8 | 11.4 | 11.2 |
| 放大值 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 4.0 | 19.0 | 23.4 | 11.5 | 10.2 |
| 洗脱溶媒 | 30％乙醇 | 30％乙醇 | 30％乙醇 | 30％乙醇 | 30％乙醇 | 30％乙醇 | 30％乙醇 | 30％乙醇 | 30％乙醇 | 30％乙醇 | 30％乙醇 |
| 洗脱体积 | 5.50 | 5.75 | 6.00 | 6.25 | 6.50 | 6.75 | 7.00 | 7.25 | 7.50 | 7.75 | 8.00 |
| 折光率值 | 11.0 | 11.0 | 10.8 | 10.6 | 10.6 | 10.6 | 10.6 | 10.5 | 10.5 | 10.5 | 10.5 |
| 放大值 | 8.5 | 8.5 | 6.0 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 洗脱溶媒 | 80％乙醇 | 80％乙醇 | 80％乙醇 | 80％乙醇 | 80％乙醇 | 80％乙醇 | 80％乙醇 | 80％乙醇 | 80％乙醇 | 80％乙醇 | 80％乙醇 |
| 洗脱体积 | 8.25 | 8.50 | 8.75 | 9.00 | 9.25 | 9.50 | 9.75 | 10.00 | 10.25 | 10.50 | 10.75 |
| 折光率值 | 10.5 | 10.6 | 10.8 | 11.4 | 17.2 | 19.2 | 19.5 | 19.6 | 19.6 | 19.5 | 19.5 |
| 放大值 | 0 | 0.5 | 6 | 11.5 | 21.5 | 22.8 | 23.0 | 0.5 | 0.5 | 0 | 0 |
丹参药材提取液过AB-8大孔树脂洗脱液紫外法检测结果
丹参药材提取液过AB-8大孔树脂洗脱液HPLC检测丹酚酸B结果
| 30％乙醇洗脱体积 | 30％乙醇洗脱量 |
| 1BV | 69.15mg |
| 2BV | 182.23mg |
| 3BV | 48.94mg |
| 4BV | 33.84mg |
| 5BV | 8.34mg |
| 6BV | 0mg |
其中：树脂体积40ml，上样量466mg，流出液含量13mg，水洗脱液含量47.5mg，吸附量405.5mg，解吸附量342.5mg，解吸附率84.46％。
结果分析：由折光法与UV法和HPLC法判断洗脱液始点和终点的结果有一致性，结果是水洗脱3.5BV是30％乙醇洗脱的始点，30％乙醇洗脱至7BV有效成分洗脱完全，此时到达终点。三者结果比较，折光法明显较UV法、HPLC法简便，快捷，易于操作，且折光法针对中药成分的整体性，UV、HPLC法针对局部或单一。
试验例2：赤勺药材过AB-8树脂
一：应用方法
1.1、样品处理：
称取赤勺药材200g，8倍药材量蒸馏水回流提取两次，1h/次，合并提取液，浓缩样品液至药材量4倍，加入无水乙醇调至乙醇浓度为60％，静置隔夜后滤过，减压回收至无醇味，加蒸馏水使成800ml。精密吸取200ml两份，分别动态上AB-8大孔吸附树脂(湿树脂40ml，相当于28g)，水-40％的乙醇洗脱，每10ml收集，折光法在线检测，一份HPLC法检测芍药苷，一份UV法检测芍药苷。
1.2、醇浓度检测：
于10ml收集的洗脱液中精密吸取5ml，置25ml容量瓶中，加入蒸馏水至刻度，醇度计检测乙醇浓度。
乙醇折光线性关系图见说明书附图1
二：检测数据：
2.1、折光法检测数
1号检测折光数据
| 洗脱体积(BV) | 折光率 | 放大值 | 醇浓度(％) | |
| 蒸馏水 | 0 | 6.4 | 21.28 | |
| 蒸馏水 | 0.25 | 6 | 20.96 | |
| 蒸馏水 | 0.50 | 6 | 20.96 | |
| 蒸馏水 | 0.75 | 5 | 20.05 | |
| 蒸馏水 | 1.00 | 3 | 17.49 | |
| 蒸馏水 | 1.25 | 1.5 | 14.03 | |
| 蒸馏水 | 1.50 | 1 | 12.00 | |
| 蒸馏水 | 1.75 | 0.9 | 11.47 | |
| 蒸馏水 | 2.00 | 0.6 | 9.45 | |
| 蒸馏水 | 2.25 | 0.6 | 9.45 | |
| 蒸馏水 | 2.50 | 0.4 | 7.42 | |
| 蒸馏水 | 2.75 | 0.4 | 7.42 | |
| 蒸馏水 | 3.00 | 0.4 | 7.42 | |
| 蒸馏水 | 3.25 | 0.3 | 5.98 | |
| 蒸馏水 | 3.50 | 0 | 0.00 | |
| 蒸馏水 | 3.75 | 0 | 0.00 | |
| 40％乙醇 | 4.00 | 0 | 0.00 | |
| 40％乙醇 | 4.25 | 3 | 17.49 | 5％ |
| 40％乙醇 | 4.50 | 13 | 24.82 | 11％ |
| 40％乙醇 | 4.75 | 16.5 | 18.26 | 28％ |
| 40％乙醇 | 5.00 | 16 | 17.49 | 34％ |
| 40％乙醇 | 5.25 | 15 | 15.47 | 40％ |
| 40％乙醇 | 5.50 | 14.4 | 13.68 | |
| 40％乙醇 | 5.75 | 13.8 | 10.88 | |
| 40％乙醇 | 6.00 | 13.5 | 8.53 | |
| 40％乙醇 | 6.25 | 13.4 | 7.42 |
| 40％乙醇 | 6.50 | 13.3 | 5.98 | |
| 40％乙醇 | 6.75 | 13.2 | 3.95 | |
| 40％乙醇 | 7.00 | 13.1 | 0.49 | |
| 40％乙醇 | 7.25 | 13 | 0.00 | |
| 40％乙醇 | 7.50 | 13 | 0.00 | |
| 40％乙醇 | 7.75 | 13 | 0.00 | |
| 40％乙醇 | 8.00 | 13 | 0.00 |
1号洗脱液醇梯度变化检测数据
| 洗脱体积(BV) | 洗脱液折光值 | 乙醇浓度(％) | 乙醇折光值 | 扣除乙醇后成分折光值 |
| 4.25 | 3.0 | 5％ | 1.9 | 1.1 |
| 4.50 | 13.0 | 11％ | 3.8 | 9.2 |
| 4.75 | 16.5 | 28％ | 9.3 | 7.2 |
| 5.00 | 16.0 | 34％ | 11.3 | 4.7 |
| 5.25 | 15.0 | 40％ | 13.0 | 2 |
2号检测折光数据
| 洗脱体积(BV) | 折光率 | 放大值 | |
| 0 | 6.6 | 21.44 | |
| 蒸馏水 | 0.25 | 6.7 | 21.51 |
| 蒸馏水 | 0.50 | 6.6 | 21.44 |
| 蒸馏水 | 0.75 | 5 | 20.05 |
| 蒸馏水 | 1.00 | 2.8 | 17.15 |
| 蒸馏水 | 1.25 | 1.5 | 14.03 |
| 蒸馏水 | 1.50 | 1 | 12.00 |
| 蒸馏水 | 1.75 | 0.8 | 10.88 |
| 蒸馏水 | 2.00 | 0.7 | 10.22 |
| 蒸馏水 | 2.25 | 0.6 | 9.45 |
| 蒸馏水 | 2.50 | 0.6 | 9.45 |
| 蒸馏水 | 2.75 | 0.4 | 7.42 |
| 蒸馏水 | 3.00 | 0.4 | 7.42 |
| 蒸馏水 | 3.25 | 0.3 | 5.98 |
| 蒸馏水 | 3.50 | 0 | 0.00 |
| 蒸馏水 | 3.75 | 0 | 0.00 |
| 蒸馏水 | 4.00 | 0 | 0.00 |
| 40％乙醇 | 4.25 | 0.7 | 10.22 |
| 40％乙醇 | 4.50 | 12.8 | 24.75 |
| 40％乙醇 | 4.75 | 17.2 | 19.18 |
| 40％乙醇 | 5.00 | 16.2 | 17.82 |
| 40％乙醇 | 5.25 | 15.4 | 16.38 |
| 40％乙醇 | 5.50 | 14.4 | 13.68 |
| 40％乙醇 | 5.75 | 14 | 12.00 |
| 40％乙醇 | 6.00 | 13.7 | 10.22 |
| 40％乙醇 | 6.25 | 13.4 | 7.42 |
| 40％乙醇 | 6.50 | 13.3 | 5.98 |
| 40％乙醇 | 6.75 | 13.2 | 3.95 |
| 40％乙醇 | 7.00 | 13.1 | 0.49 |
| 40％乙醇 | 7.25 | 13 | 0.00 |
| 40％乙醇 | 7.50 | 13 | 0.00 |
| 40％乙醇 | 7.75 | 13 | 0.00 |
| 40％乙醇 | 8.00 | 13 | 0.00 |
2号洗脱液醇梯度变化检测数据
| 洗脱体积(BV) | 洗脱液折光值 | 乙醇浓度(％) | 乙醇折光值 | 扣除乙醇后成分折光值 |
| 4.25 | 0.7 | 低于检测限 | - | - |
| 4.50 | 12.8 | 10％ | 3.3 | 9.5 |
| 4.75 | 17.2 | 30％ | 7.3 | 9.9 |
| 5.00 | 16.2 | 35％ | 10.3 | 5.9 |
| 5.25 | 15.4 | 40％ | 13.0 | 2.4 |
1号检测折光变化图见说明书附图2
扣除乙醇背景折光变化图见说明书附图3
2号检测折光变化图见说明书附图4
2.2、UV法检测数据
检测条件：波长230nm
检测方法：以芍药苷(浓度：0.0192mg/ml)为对照，在230nm下检测吸收，2号样品的吸收值以外标一点法计算芍药苷含量。芍药苷的吸收值为1.514Abs。
2号UV检测芍药苷数据
| 洗脱溶媒 | 洗脱体积 | 紫外吸收值 | 稀释倍数 | 芍药苷含量(mg) |
| - | 0 | 3.067 | 5000 | 1944.73 |
| 蒸馏水 | 0.25 | 1.053 | 1000 | 133.54 |
| 蒸馏水 | 0.75 | 0.965 | 1000 | 122.38 |
| 蒸馏水 | 1.25 | 0.747 | 1000 | 94.73 |
| 蒸馏水 | 1.75 | 0.761 | 500 | 48.25 |
| 蒸馏水 | 2.25 | 0.882 | 100 | 11.19 |
| 蒸馏水 | 2.75 | 0.766 | 50 | 4.86 |
| 蒸馏水 | 3.25 | 0.662 | 50 | 4.20 |
| 蒸馏水 | 3.75 | 0.616 | 50 | 3.91 |
| 40％乙醇 | 4.25 | 2.331 | 1000 | 295.61 |
| 40％乙醇 | 4.75 | 3.510 | 1000 | 445.13 |
| 40％乙醇 | 5.25 | 3.714 | 1000 | 471.00 |
| 40％乙醇 | 5.75 | 1.615 | 500 | 102.40 |
| 40％乙醇 | 6.25 | 0.995 | 100 | 12.62 |
| 40％乙醇 | 6.75 | 0.764 | 50 | 4.84 |
| 40％乙醇 | 7.25 | 0.653 | 50 | 4.14 |
| 40％乙醇 | 7.75 | 0.600 | 50 | 3.80 |
| 40％乙醇 | 8 | 0.581 | 50 | 3.68 |
| - | 流出液 | 0.115 | 100/250 | 36.46 |
2号UV检测芍药苷含量变化趋势图见说明书附图5
2.3、HPLC法检测芍药苷数据
检测条件：迪马C18柱(柱号8032165)，甲醇-水-冰醋酸(34.5-65-0.5)，波长：2230nm，流速1.0ml/min
检测方法：
精密吸取样品液4ml，加水至50ml，作为提取液检测。
将1号40％乙醇洗脱液按1个柱床体积混合，加40％乙醇定容至50ml，过滤膜，检测。
芍药苷浓度0.03mg/ml，峰面积：216.5(5ul)
HPLC法检芍药苷含量数据
赤勺过AB-8树脂HPLC检测芍药苷含量变化图见说明书附图6
试验例3葛根、甘草、精致冠心片处方结果部分图谱
一、葛根过AB-8树脂检测结果
葛根药材过AB-8树脂洗脱液折光检测值见说明书附图7。
葛根药材过AB-8树脂洗脱液UV检测黄酮类化合物含量图(249nm)见说明书附图8。
葛根药材过AB-8树脂洗脱液HPLC法检测葛根素含量图见说明书附图9。
甘草过D-101树脂检测结果
甘草药材过D-101树脂洗脱液折光检测值见说明书附图10。
甘草药材过D-101树脂洗脱液UV检测图(500nm)见说明书附图11。
甘草药材过D-101树脂洗脱液HPLC检测甘草酸含量图见说明书附图12。
精制冠心片(复方降香)过D-101树脂
精制冠心片(复方降香)过D-101树脂洗脱液折光法检测结果见说明书附图13。
精制冠心片(复方降香)过D-101树脂洗脱液UV检测结果(波长276nm，以丹参酮IIA计算276nm吸收初洗脱液所含物质含量)见说明书附图14。
精制冠心片(复方降香)过D-101树脂洗脱液HPLC法检测丹酚酸B含量结果见说明书附图15。
试验例4
本发明在复方制剂柱分离纯化中的应用：精致冠心片处方提取液过D-101树脂并检测
| 洗脱溶媒 | 蒸馏水 | 蒸馏水 | 蒸馏水 | 蒸馏水 | 蒸馏水 | 蒸馏水 | 蒸馏水 | 蒸馏水 | 蒸馏水 | 蒸馏水 | 蒸馏水 |
| 洗脱体积 | 0.25 | 0.50 | 0.75 | 1.00 | 1.25 | 1.50 | 1.75 | 2.00 | 2.25 | 2.50 | 2.75 |
| 折光率值 | 9.9 | 9.8 | 5.2 | 1.8 | 1.0 | 0.8 | 0.4 | 0.3 | 0.3 | 0.3 | 0.3 |
| 洗脱溶媒 | 蒸馏水 | 蒸馏水 | 蒸馏水 | 蒸馏水 | 蒸馏水 | 蒸馏水 | 蒸馏水 | 蒸馏水 | 蒸馏水 | 蒸馏水 | 蒸馏水 |
| 洗脱体积 | 3.00 | 3.25 | 3.50 | 3.75 | 4.00 | 4.25 | 4.50 | 4.75 | 5.00 | 5.25 | 5.50 |
| 折光率值 | 0.2 | 0.2 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0.5 |
| 洗脱溶媒 | 20％乙醇 | 20％乙醇 | 20％乙醇 | 20％乙醇 | 20％乙醇 | 20％乙醇 | 20％乙醇 | 20％乙醇 | 20％乙醇 | 20％乙醇 | 20％乙醇 |
| 洗脱体积 | 5.75 | 6.00 | 6.25 | 6.50 | 6.75 | 7.00 | 7.25 | 7.50 | 7.75 | 8.00 | 8.25 |
| 折光率值 | 1.1 | 1.3 | 1.4 | 1.9 | 2.7 | 3.5 | 4.2 | 4.5 | 6.4 | 8.9 | 9.3 |
| 洗脱溶媒 | 20％乙醇 | 20％乙醇 | 20％乙醇 | 20％乙醇 | 20％乙醇 | 20％乙醇 | 20％乙醇 | 20％乙醇 | 20％乙醇 | 20％乙醇 | |
| 洗脱体积 | 8.50 | 8.75 | 9.00 | 9.25 | 9.50 | 9.75 | 10.00 | 10.25 | 10.50 | ||
| 折光率值 | 9.3 | 8.6 | 8.1 | 7.5 | 7.0 | 6.3 | 6.2 | 5.2 | 4.6 | ||
| 洗脱溶媒 | 20％乙醇 | 20％乙醇 | 20％乙醇 | 20％乙醇 | 20％乙醇 | 20％乙醇 | 20％乙醇 | 20％乙醇 | 20％乙醇 | ||
| 洗脱体积 | 10.75 | 11.00 | 11.25 | 11.50 | 11.75 | 12.00 | 12.25 | 12.50 | 12.75 | ||
| 折光率值 | 3.8 | 3.5 | 3.5 | 3.5 | 3.5 | 3.5 | 3.7 | 4.8 | 6.9 | ||
| 洗脱溶媒 | 20％乙醇 | 50％乙醇 | 50％乙醇 | 50％乙醇 | 50％乙醇 | 50％乙醇 | 50％乙醇 | 50％乙醇 | 50％乙醇 | ||
| 洗脱体积 | 13.00 | 13.25 | 13.50 | 13.75 | 14.00 | 14.25 | 14.50 | 14.75 | 15.00 | ||
| 折光 | 7.0 | 7.0 | 7.9 | 8.6 | 12.0 | 14.3 | 15.0 | 15.7 | 15.6 |
| 率值 | |||||||||||
| 洗脱溶媒 | 50％乙醇 | 50％乙醇 | 50％乙醇 | 50％乙醇 | 50％乙醇 | 50％乙醇 | 50％乙醇 | 50％乙醇 | 50％乙醇 | ||
| 洗脱体积 | 15.25 | 15.50 | 15.75 | 16.00 | 16.25 | 16.50 | 16.75 | 17.00 | 17.25 | ||
| 折光率值 | 15.6 | 15.3 | 15 | 14.1 | 12.0 | 9.9 | 8.6 | 8.6 | 8.0 | ||
| 洗脱溶媒 | 50％乙醇 | 50％乙醇 | 50％乙醇 | 50％乙醇 | 50％乙醇 | 50％乙醇 | 50％乙醇 | 50％乙醇 | 50％乙醇 | ||
| 洗脱体积 | 17.50 | 17.75 | 18.00 | 18.25 | 18.50 | 18.75 | 19.00 | 19.25 | 19.50 | ||
| 折光率值 | 7 | 6.1 | 5.8 | 5.6 | 5.6 | 5.5 | 5.5 | 5.5 | 5.5 | ||
| 洗脱溶媒 | 50％乙醇 | 50％乙醇 | 50％乙醇 | 50％乙醇 | 50％乙醇 | ||||||
| 洗脱体积 | 19.75 | 20.25 | 20.50 | 20.75 | 21.00 | ||||||
| 折光率值 | 5.5 | 5.5 | 5.5 | 5.5 | 5.5 |
HPLC法测定芍药苷含量结果见说明书附图16
| 峰面积 | 含量(mg) | ||
| 水洗液 | 271 | 16.04943 | |
| 流出液 | 172.7 | 10.22781 | |
| 提取液 | 581.2 | 172.102 | |
| 6 | 21~24 | 197.4 | 2.338124 |
| 7 | 25~28 | 479 | 5.673563 |
| 8 | 29~32 | 365.4 | 4.328016 |
| 9 | 33~36 | 290.8 | 3.444409 |
| 10 | 37~40 | 213.6 | 2.530006 |
| 11 | 41~44 | 161.5 | 1.912903 |
| 12 | 45~48 | 654.6 | 7.753474 |
| 13 | 49~52 | 966.1 | 28.60767 |
| 14 | 53~56 | 806.7 | 23.88759 |
| 15 | 57~60 | 722.1 | 21.38246 |
| 16.5 | 63~66 | 312.4 | 9.250632 |
| 20 | 67~80 | 300.4 | 8.895294 |
| 21 | 81~84 | 47 | 1.39174 |
| 解吸附率 | 633.2 | 83.25％ |
HPLC法检测芍药苷含量趋势图见说明书附图17
试验例5
本发明在复方制剂柱分离纯化中的应用：精红花提取物过HPD-700树脂并检测
| 洗脱溶媒 | 蒸馏水 | 蒸馏水 | 蒸馏水 | 蒸馏水 | 蒸馏水 | 蒸馏水 | 蒸馏水 | 蒸馏水 | 蒸馏水 | 蒸馏水 | 蒸馏水 |
| 洗脱体积 | 0.25 | 0.50 | 0.75 | 1.00 | 1.25 | 1.50 | 1.75 | 2.00 | 2.25 | 2.50 | 2.75 |
| 折光率值 | 17 | 16.8 | 15.2 | 11.8 | 8.0 | 6.8 | 6.4 | 5.3 | 4.7 | 4.3 | 3.3 |
| 洗脱溶媒 | 蒸馏水 | 蒸馏水 | 蒸馏水 | 蒸馏水 | 蒸馏水 | 蒸馏水 | 蒸馏水 | 蒸馏水 | 蒸馏水 | 蒸馏水 | 蒸馏水 |
| 洗脱体积 | 3.00 | 3.25 | 3.50 | 3.75 | 4.00 | 4.25 | 4.50 | 4.75 | 5.00 | 5.25 | 5.50 |
| 折光率值 | 2.9 | 2.2 | 1.5 | 1 | 0.6 | 0.3 | 0.2 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 洗脱溶媒 | 50％乙醇 | 50％乙醇 | 50％乙醇 | 50％乙醇 | 50％乙醇 | 50％乙醇 | 50％乙醇 | 50％乙醇 | 50％乙醇 | 50％乙醇 | |
| 洗脱体积 | 5.75 | 6.00 | 6.25 | 6.50 | 6.75 | 7.00 | 7.25 | 7.50 | 7.75 | 8.00 | |
| 折光率值 | 0 | 0.3 | 1.4 | 2.9 | 4.7 | 7.5 | 9.2 | 10.5 | 11.4 | 11.9 | |
| 洗脱溶媒 | 50％乙醇 | 50％乙醇 | 50％乙醇 | 50％乙醇 | 50％乙醇 | 50％乙醇 | 50％乙醇 | 50％乙醇 | 50％乙醇 | 50％乙醇 | |
| 洗脱体积 | 8.25 | 8.50 | 8.75 | 9.00 | 9.25 | 9.50 | 9.75 | 10.00 | 10.25 | 10.50 | |
| 折光率值 | 11.9 | 12.0 | 12.1 | 12.3 | 12.5 | 13.0 | 13.3 | 15.2 | 16.2 | 17.6 | |
| 洗脱溶媒 | 50％乙醇 | 50％乙醇 | 50％乙醇 | 50％乙醇 | 50％乙醇 | 50％乙醇 | 50％乙醇 | 50％乙醇 | 50％乙醇 | 50％乙醇 | |
| 洗脱体积 | 10.75 | 11.00 | 11.25 | 11.50 | 11.75 | 12.00 | 12.25 | 12.50 | 12.75 | 13.00 | |
| 折光率值 | 17.0 | 16.5 | 15.8 | 15.5 | 15.5 | 15.5 | 14.9 | 14.8 | 14.9 | 15.0 | |
| 洗脱溶媒 | 50％乙醇 | 50％乙醇 | 50％乙醇 | 50％乙醇 | 50％乙醇 | 50％乙醇 | 50％乙醇 | 50％乙醇 | 50％乙醇 | 50％乙醇 | |
| 洗脱体积 | 13.25 | 13.50 | 13.75 | 14.00 | 14.25 | 14.50 | 14.75 | 15.00 | 15.25 | ||
| 折光率值 | 14.0 | 13.9 | 12.6 | 10.0 | 9.3 | 8.1 | 7.7 | 6.4 | 5.6 | ||
| 洗脱溶媒 | 50％乙醇 | 50％乙醇 | 50％乙醇 | 50％乙醇 | 50％乙醇 | 50％乙醇 | 50％乙醇 | ||||
| 洗脱体积 | 15.50 | 15.75 | 16.00 | 16.25 | 16.50 | 16.75 | 17.00 | ||||
| 折光率值 | 5.3 | 5.3 | 5.3 | 5.3 | 5.3 | 5.3 | 5.3 |
HPLC法测定红花黄色素含量结果见下表和说明书附图18
| 含量(mg) | |
| 水洗液 | 130.05 |
| 流出液 | 120.23 |
| 提取液 | 1172.11 |
| 6 | 20.34 |
| 7 | 50.11 |
| 8 | 113.16 |
| 9 | 130.68 |
| 10 | 207.54 |
| 11 | 181.92 |
| 12 | 127.79 |
| 13 | 109.57 |
| 14 | 78.89 |
| 15 | 41.38 |
在上述试验例5中，蒸馏水洗脱液的洗脱终点是每柱洗脱液体积的5.75倍处；同时每柱洗脱液体积的5.75倍处也是50％乙醇溶液的洗脱起始点；每柱洗脱液体积的17.00倍处是50％乙醇溶液的洗脱终点。
在上述试验例1中，蒸馏水洗脱液的洗脱终点是每柱洗脱液体积的4.00倍处；同时每柱洗脱液体积的4.00倍处也是30％乙醇溶液的洗脱起始点；蒸馏水洗脱液的洗脱终点是每柱洗脱液体积的8.25倍处；同时每柱洗脱液体积的8.25倍处也是80％乙醇溶液的洗脱起始点；每柱洗脱液体积的10.75倍处是80％乙醇溶液的洗脱终点。
其他试验例中的洗脱起始点或洗脱终点的划分与此类似。
在上述试验例1中，如果在每柱洗脱液体积的8.25倍处之前就提前更换80％乙醇，意味本来应该溶解在30％乙醇溶液中的部分成分可能混入下一步骤中，既损失了前一步骤中的成分，又使得下一步骤中的物质纯度不够。而如果在每柱洗脱液体积的8.25倍处之后才更换80％乙醇，意味浪费了30％乙醇溶液。
如果能即时判断监控洗脱起始点或洗脱终点显然可以减少上述分离不纯或浪费洗脱液的情况发生。
Claims (9)
1、中药的柱分离洗脱液洗脱起始点或终点的快速监控方法，其特征在于：按每柱洗脱液体积的0.01-20倍的间隔，连续取待检测的洗脱液样品，测量洗脱液样品的折光率。
2、如权利要求1所述的中药的柱分离洗脱液洗脱起始点或终点的快速监控方法，其特征在于：按每柱洗脱液体积的0.1-2倍的间隔，连续取待检测的洗脱液样品，测量洗脱液样品的折光率。
3、如权利要求1所述的中药的柱分离洗脱液洗脱起始点或终点的快速监控方法，其特征在于：按每柱洗脱液体积的0.2-1倍的间隔，连续取待检测的洗脱液样品，测量洗脱液样品的折光率。
4、如权利要求1或2或3所述的中药的柱分离洗脱液洗脱起始点或终点的快速监控方法，其特征在于：将测量洗脱液样品的折光率数据建立或不建立数据库，对数据进行或不进行处理。
5、如权利要求1或2或3所述的中药的柱分离洗脱液洗脱起始点或终点的快速监控方法，其特征在于：所述中药是单味中药材、多味中药材、单味中药制剂、中药复方制剂、中西药复方制剂中的任意一类。
6、如权利要求1或2或3所述的中药的柱分离洗脱液洗脱起始点或终点的快速监控方法，其特征在于：中药的柱分离所用的固定相可以是树脂、硅胶、凝胶、聚酰胺、氧化铝、硅藻土中的任意一种，其中检测洗脱液所用仪器设备为利用折光原理设计的手持式折射仪、阿贝折射仪。
7、如权利要求6所述的中药的柱分离洗脱液洗脱起始点或终点的快速监控方法，其特征在于：中药的柱分离所用的固定相树脂是大孔树脂。
8、如权利要求1或2或3所述的中药的柱分离洗脱液洗脱起始点或终点的快速监控方法，其特征在于：洗脱液可以是水、单一或混合的有机溶剂。
9、折光率测量在中药的柱分离洗脱液洗脱起始点或终点的快速监控中的应用，其特征在于：按每柱洗脱液体积的0.01-20倍的间隔，连续取待检测的洗脱液样品，测量洗脱液样品的折光率。
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