CN102091118A - 大花红景天药材的质量检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种大花红景天药材的质量检测方法。通过红景天HPLC指纹图谱检测大花红景天的质量，该方法简便、易行、重复性好，且不以红景天苷为单一检测目标，而是通过HPLC指纹图谱，检测大花红景天的质量，更利于大花红景天质量的控制，有助于提高临床使用该药材的安全性和稳定性。

Description

大花红景天药材的质量检测方法

技术领域

本发明涉及一种大花红景天的质量检测方法。

背景技术

红景天(RhodioLarosea)系景天科(CrassuLaceae)景天属(RhodioLa)植物的根及根茎。我国是红景天的分布中心，全世界90余种红景天属植物中有70多种在我国有分布。而四川、西藏、云南等西南地区是大花红景天RhodioLacrenuata(Hook.f.et Thomx.)H.Ohba的主产区，西藏地区的产量最大。大花红景天又名宽瓣红景天、圆齿红景天，生于海拔2800～5600米的山坡草地、灌丛、石缝中。大花红景天植物资源丰富，分布于四川、云南、西藏、青海等广大西部地区，而且蕴藏量很大，熊先荣、贺俊生等仅对西藏红景天资源做了研究统计，结果都显示大花红景天的蕴藏量最大。

包文芳，吴维春，李葆华.抗疲劳药用植物红景天[M].人民军医出版社，2003：1～2，报道了大花红景天主要含有醇及其苷类、黄酮类、酚及其苷类、生氰苷类、内酯类以及挥发油。

大花红景天中存在多种具有药理活性的有效成分，但不同产地、不同药用部位的药材在质量上存在较大的差异，这些差异往往直接影响到红景天药材的临床疗效及其稳定性，因此，对红景天药材进行全面的质量检测显得尤为必要。

发明内容

本发明的技术方案是提供了一种大花红景天的质量检测方法。

本发明提供了一种大花红景天药材的质量检测方法，它是采用HPLC指纹图谱检测，具体检测步骤如下：

a、取大花红景天，精密称定，以乙醇或乙酸乙酯提取，回收溶剂，定容后，得供试品溶液；

b、取红景天苷，精密称定，溶解，定容后，得参照物溶液；

c、分别精密吸取参照物溶液与供试品溶液注入液相色谱仪，采用反相色谱柱，柱温为25～35℃，流动相为甲醇-水-乙酸系统、甲醇-乙腈-水系统或乙腈-水-磷酸系统，流速为0.6～1.2ml/min，利用蒸发光散射器，或在紫外波长273nm～278nm下检测，优选275nm；

其中，步骤a中定容所用的溶剂、步骤b中溶解和定容所用的溶剂为乙醇、甲醇或步骤c所述的流动相溶液。

进一步地，步骤a中定容所用的溶剂、步骤b中溶解和定容所用的溶剂为70％V/V乙醇溶液。

其中，a步骤的具体操作如下：

取大花红景天，精密称定，精密加入乙酸乙酯，其中，大花红景天与乙酸乙酯的重量体积比为1∶80，回流提取1.5h后，提取液回收乙酸乙酯后，加入70％V/V乙醇溶解并定容，作为供试品溶液，该溶液1ml含有0.1g原药材。

其中，步骤c中所述的反相色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂。

进一步地，步骤c中所述的流动相为乙腈-0.1％磷酸水溶液。

更进一步地，所述的乙腈与0.1％磷酸水溶液的体积比为：

进一步地，步骤c中，选用柱温30℃，流速0.8ml/min，紫外波长275nm进行检测。

其中，所述的指纹图谱如图1所示，其中，有26个特征峰，分别为：H₁峰5.3±0.265，H₂峰7.1±0.355，H₃峰10.7±0.535，H₄峰11.7±0.585，H₅峰17.3±0.865，H₆峰20.4±1.02，H₇峰24.8±1.24，H₈峰27.7±1.385，H₉峰29.4±1.47，H₁₀峰33.4±1.67，H₁₁峰35.0±1.75，H₁₂峰36.5±1.825，H₁₃峰39.6±1.98，H₁₄峰51.8±2.59，H₁₅峰53.2±2.66，H₁₆峰54.1±2.705，H₁₇峰55.4±2.77，H₁₈峰57.9±2.895，H₁₉峰64.2±3.21，H₂₀峰71.0±3.55，H₂₁峰73.6±3.68，H₂₂峰83.0±4.15，H₂₃峰84.2±4.21，H₂₄峰92.0±4.6，H₂₅峰98.1±4.905，H₂₆峰100.3±5.015。

进一步优选地，所述的指纹图谱中，26个特征峰的具体信息如下：

本发明质量检测方法该方法简便、易行、重复性好，且不以红景天苷为单一检测目标，而是通过HPLC指纹图谱，检测大花红景天的质量，更利于大花红景天质量的控制，有助于提高临床使用该药材的安全性和稳定性。

本发明说明书中实施例的内容，不应理解为是对本发明保护范围的限制，凡基于上述技术思想，利用本领域普通技术知识和惯用手段所做的修改、替换、变更均属于本发明的范围。

附图说明

图1大花红景天药材标准指纹图谱

图2甲醇-水-乙酸系统筛选实验图谱

图3甲醇-乙腈-水系统筛选实验图谱

图4乙腈-0.1％磷酸系统筛选实验图谱

图5柱温35℃时色谱图

图6柱温30℃色谱图

图7柱温25℃时色谱图

图8稳定性实验

图9重复性实验

图10精密度实验

图11大花红景天对照药材

图12 10批药材指纹图谱

具体实施方式

实施例1本发明大花红景天药材质量检测方法

色谱仪  岛津LC-10ATVP；

色谱柱HypersiL BDS C18(250mm×4.6mm，5μm)

流动相A0.1％磷酸溶液；B乙腈

梯度洗脱：

梯度洗脱表

柱温30℃

流速0.8ml/min

波长275nm

测定法：吸取供试品溶液10μl，注入高效液相色谱仪，测定各色谱图。

供试品的制备：取大花红景天药材约2.5g，精密称定，精密加入乙酸乙酯200ml，回流提取1.5h后，回收乙酸乙酯，70％乙醇溶解并定容到25ml量瓶中，作为供试品溶液。

参照物采用指纹图谱中红景天苷(保留时间约11min)作为指纹图谱的参照物。取适量红景天苷，加70％V/V乙醇溶解，定容后，得参照物溶液。

其中，大花红景天HPLC指纹图谱见图1。

实施例2本发明检测方法的筛选

1实验仪器与材料

1.1实验仪器

高效液相色谱仪岛津LC10-ATVP，CLASS-VP工作站；色谱柱为HypersiLBDS C18(250mm×4.6mm，5μm，大连依利特分析仪器有限公司)；UV1100紫外-可见分光光度计(上海天美科学仪器有限公司)；DZG-6050型真空干燥箱(上海森信实验仪器有限公司)；电子分析天平BP211D(十万分之一)，BP121S(万分之一)(德国Sartouris股份有限公司)；SHB-III循环水式多用真空泵(郑州长城科工贸有限公司)BUG25-12超声波清洗机(上海必能信公司)，W201B恒温水浴锅(北京国华医疗器械厂)；调温电热套(北京中兴伟业仪器有限公司)；WAY阿贝折射仪(上海精密科学仪器有限公司)，马弗炉(沈阳节能电炉厂)。

1.2材料及试剂

硅胶G(薄层层析用，青岛海洋化工有限公司)；D₁₆₀、HPD₈₂₆、D₁₀₁、HPD₇₂₂、HPD₆₀₀、DM₁₃₀、D₁₀₁大孔吸附树脂(天津农药股份有限公司树脂分公司)；HP₈₂₆、D₁₃₀、HPD₇₂₂、HPD₆₀₀(沧州宝恩化工有限公司)；D₁₆₀大孔吸附树脂(晨光化工研究院)；红景天苷对照品(中国药品生物制品检定所，批号：200705，含量测定用)；甲醇(色谱纯，美国Fisher公司)；乙腈(色谱纯，美国Fisher公司)；所用试剂均为分析纯(成都化学试剂厂)。

1.3药材

大花红景天提取物以大花红景天投料，药材经成都四川大学王曙教授鉴定为景天科科植物大花红景天(RhodioLa crenuata(Hook.f.et Thomx.)H.Ohba)的根及根茎，见表1。

表1 10批药材的采收情况

2红景天药材指纹图谱

2.1药材来源

大花红景天：共10批，分别购自成都市五块石药材市场、西藏、云南三地。见药材表。

2.2药材指纹图谱获取方法研究

(1)样品溶液制备方法的选择

①称取大花红景天药材2.5g(3号筛)，精密称定，用70％乙醇回流提取，减压回收乙醇，用乙酸乙酯萃取3次，合并萃取液，减压回收乙酸乙酯，用70％乙醇溶解并定容到25ml量瓶中。

②同①法取样，加入200ml乙酸乙酯回流1.5h，回收乙酸乙酯，70％乙醇溶解并定容到25ml量瓶中。

③同①法取样，加入200ml乙酸乙酯超声1h，回收乙酸乙酯，70％乙醇溶解并定容到25ml量瓶中。

结果以方法②制备供试品，可以使图谱基线较平稳，并可以使各峰得到较好的分离。

(2)参照物

用外标法对照可知，图1中保留时间为11min左右的色谱峰为红景天苷的峰，考虑到红景天苷是大花红景天的主要药效成分，其色谱峰与其它峰分离良好，在各批样品中含量教高，保留时间适中，故采用指纹图谱中红景天苷作为指纹图谱的参照物，取适量参照物，加入70％乙醇溶解并定容，制备得到参照物溶液。

(3)测定波长的选择

红景天苷是大花红景天的主要功效成分，且红景天苷在275nm处有最大吸收，同时实验结果表明：以乙腈-0.1％磷酸为流动相，梯度洗脱，在275nm波长下出现的色谱峰较理想，各色谱峰相互之间分离度和稳定性较好。故选择275nm作为检测波长。

(4)色谱流动相的选择

固定色谱柱、流速(0.8ml/min)、检测波长(275nm)、柱温(30℃)、进样10μl)量和HPLC等其他条件，分别以同样水相-有机相比值的甲醇-水-乙酸系统、甲醇-乙腈-水系统、乙腈-水-磷酸系统为流动相，对供试品进行HPLC分析，对所获取的供试品色谱图中所呈现色谱峰的个数、红景天苷保留时间、分离度、峰对称性等进行比较，以确定最适流动相。

试验结果以甲醇-水-乙酸系统为流动相时，出峰密集，色谱峰分离不佳，分析时间长，基线漂移，见图2。以甲醇-乙腈-水系统为流动相时，出峰密集，基线在一段区域内隆起，出峰数量少，分离度差，见图3。而以乙腈-0.1％磷酸为流动相时，出峰数量多，各峰分离较好，基线平稳，分析时间适中。因此确定以乙腈-0.1％磷酸为流动相，见图4。

(5)柱温的选择

在上述确定的条件下，考察了柱温为35℃、30℃、25℃时，以优化色谱条件，见图5，图6，图7。

试验结果：在柱温为30℃时，各色谱峰的分离效果最好，各峰在色谱图中的分布最适中，故选择最佳柱温为30℃。

(6)分析时间的确定

从图谱可知，保留时间在110分钟以后已无其他色谱峰出现。因此将红景天药材指纹图谱的检测时间定为110分钟，即可使供试液中所有相关成分得到完全分离和洗脱，能够满足指纹图谱的分析要求。

(7)稳定性试验

取同一份供试品溶液，分别在0h、3h、6h、9h、12h等5个小时点进行检测，直观观察指纹图谱的全貌无明显变化，用相似度计算，在同一台仪器测得的色谱指纹图谱与其所得共有模式图谱的相关系数分别为0.998、0.997、0.998、0.997、0.999，RSD％为0.15％，表明在此时间内供试品溶液的成分是稳定的，见图8。

(8)重复性试验

取同一批号的供试品5份，按照供试品溶液的制备和检测方法进行检测，5份供试品溶液测得的色谱指纹图谱直观观察，表明指纹图谱的全貌无明显变化，用相似度计算，在同一台仪器测得的色谱指纹图谱与其所得共有模式图谱的相似度(相关系数法)分别为0.999、0.999、0.994、0.997、0.995，RSD％为0.32％，表明重现性良好，见图9。

(9)仪器精密度试验

取同一份供试品溶液，连续进样5次，所得图谱用相似度计算，在同一台仪器测得的色谱指纹图谱与其所得共有模式图谱的相似度(相关系数法)分别为0.998、0.999、0.988、0.999、0.999，RSD％为0.10％，表明精密度良好，见图10。

(10)大花红景天药材供试液检测方法的确定

通过上述对检测波长、流动相等检测条件的筛选和对方法稳定性、仪器精密度和重现性考察，最终确定大花红景天药材供试品指纹图谱的试验条件为：

供试品的制备：取大花红景天药材约2.5g，精密称定，精密加入乙酸乙酯200ml，回流提取1.5h后，回收乙酸乙酯，70％乙醇溶解并定容到25ml量瓶中，作为供试品溶液。

参照物采用指纹图谱中红景天苷(保留时间约11min)作为指纹图谱的参照物。

色谱仪  岛津LC-10ATVP；

色谱柱HypersiL BDS C18(250mm×4.6mm，5μm)

流动相A0.1％磷酸溶液；B乙腈

梯度洗脱：

梯度洗脱表

柱温30℃

流速0.8ml/min

波长275nm

测定法：吸取供试品溶液10μl，注入高效液相色谱仪，测定各色谱图。

2.3大花红景天对照药材指纹图谱的建立

取大花红景天对照药材(批号120942-200706)约2.5g，按拟定的方法制备供试品溶液，吸取供试品溶液10μl，注入高效液相色谱仪，测定见图11。

2.4大花红景天药材相似度评价

取所收集的10批大花红景天药材，按拟定的方法制备供试品。分别吸取各供试品各10μl，注入高效液相色谱仪，记录110min色谱图。用国家药典委员会发布的“中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2004A版)”对数据进行分析，以大花红景天对照药材指纹图谱为参照物，分别与10批药材进行相似度评价(相关系数法)，结果见表2。

表210批药材指纹图谱与对照药材指纹图谱相似度评价依据

批号	P-01	P-02	P-03	P-04	P-05	P-06	P-07	P-08	P-09	P-10
											相似度	0.996	0.999	0.992	0.997	0.995	0.998	0.999	0.993	0.995	0.998

由上表可知，10批药材与对照药材指纹图谱间的相似度在0.9以上，表明10批药材来源于大花红景天RhodioLa crenuata(Hook.f.et Thomx.)H.Ohba的干燥根茎，见图12。

2.5大花红景天药材标准指纹图谱建立及相似度考察

(1)标准指纹图谱的建立

运用国家药典委员会发布的“中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2004A)”对上述10批药材指纹图谱进行分析，提取共有峰生成标准图谱，见图1，根据数据分析最终标定26个共有峰，图谱特征数据见表3。

表3大花红景天标准指纹图谱特征数据

(2)大花红景天药材的相似度评价

以大花红景天药材标准指纹图谱为参照，运用国家药典委员会发布的“中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2004A)”，分别与三批药材进行相似度评价，结果见表4。

表4 13批药材指纹图谱与标准指纹图谱的相似度

由上表可知，10批大花红景天药材指纹图谱与标准指纹图谱的相似度＞0.9。其中，HPLC指纹图谱中所得的3个特征峰(红景天苷峰、“五指峰”、双峰)可作为红景天药材质量控制的依据。同时运用国家药典委员会发布的中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2004A版)分析10批药材HPLC指纹图谱与大花红景天对照药材指纹图谱的相似度，并以红景天苷为参照，建立了大花红景天药材标准指纹图谱，标定了26个共有峰，其共有指纹峰面积、保留时间比值均符合指纹图谱技术要求。

本发明质量检测方法中，通过对不同流动相条件下色谱峰的分离度、分离时间、基线、分离得到的峰数量以及峰形的考察，最终得出了本发明最佳的流动相系统以及梯度洗脱条件，在该条件下，能够分离出26个共有峰，并且基线平稳，分离度、峰形良好，利用色谱指纹图谱相似度评价系统评价，10批药材的相似度均大于0.9，表明了本发明建立的大花红景天药材标准指纹图谱符合国家对指纹图谱技术的要求。

本发明质量检测方法该方法简便、易行、重复性好，且不以红景天苷为单一检测目标，而是通过HPLC指纹图谱，检测大花红景天的质量，更利于大花红景天质量的控制，有助于提高临床使用该药材的安全性和稳定性。

Claims (9)

1.一种大花红景天药材的质量检测方法，其特征在于：它是采用HPLC指纹图谱检测，具体检测步骤如下：

a、取大花红景天，精密称定，以乙醇或乙酸乙酯提取，回收溶剂，定容后，得供试品溶液；

b、取红景天苷，精密称定，溶解，定容后，得参照物溶液；

c、分别精密吸取参照物溶液与供试品溶液注入液相色谱仪，采用反相色谱柱，柱温为25～35℃，流动相为甲醇-水-乙酸系统、甲醇-乙腈-水系统或乙腈-水-磷酸系统，流速为0.6～1.2ml/min，利用蒸发光散射器，或在紫外波长273nm～278nm下检测；

其中，步骤a中定容所用的溶剂、步骤b中溶解和定容所用的溶剂为乙醇、甲醇或步骤c所述的流动相溶液。

2.根据权利要求1所述的质量检测方法，其特征在于：步骤a中定容所用的溶剂、步骤b中溶解和定容所用的溶剂为70％V/V乙醇溶液。

3.根据权利要求1所述的质量检测方法，其特征在于：a步骤的具体操作如下：

取大花红景天，精密称定，精密加入乙酸乙酯，其中，大花红景天与乙酸乙酯的重量体积比为1∶80，回流提取1.5h后，提取液回收乙酸乙酯后，加入70％V/V乙醇溶解并定容，作为供试品溶液，该溶液1ml含有0.1g原药材。

4.根据权利要求1所述的质量检测方法，其特征在于：步骤c中所述的反相色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂。

5.根据权利要求1所述的质量检测方法，其特征在于：步骤c中所述的流动相为乙腈-0.1％磷酸水溶液。

6.根据权利要求5所述的质量检测方法，其特征在于：所述的乙腈与0.1％磷酸水溶液的体积比为：

7.根据权利要求1所述的质量检测方法，其特征在于：步骤c中，选用柱温30℃，流速0.8ml/min，紫外波长275nm进行检测。

8.根据权利1-7任意一项所述的质量检测方法，其特征在于：所述的指纹图谱如图1所示，其中，有26个特征峰，分别为：H₁峰5.3±0.265，H₂峰7.1±0.355，H₃峰10.7±0.535，H₄峰11.7±0.585，H₅峰17.3±0.865，H₆峰20.4±1.02，H₇峰24.8±1.24，H₈峰27.7±1.385，H₉峰29.4±1.47，H₁₀峰33.4±1.67，H₁₁峰35.0±1.75，H₁₂峰36.5±1.825，H₁₃峰39.6±1.98，H₁₄峰51.8±2.59，H₁₅峰53.2±2.66，H₁₆峰54.1±2.705，H₁₇峰55.4±2.77，H₁₈峰57.9±2.895，H₁₉峰64.2±3.21，H₂₀峰71.0±3.55，H₂₁峰73.6±3.68，H₂₂峰83.0±4.15，H₂₃峰84.2±4.21，H₂₄峰92.0±4.6，H₂₅峰98.1±4.905，H₂₆峰100.3±5.015。

9.根据权利要求8所述的质量检测方法，其特征在于：所述的指纹图谱中，26个特征峰的具体信息如下：

Images