CN104833749A - 菊花破壁饮片的指纹图谱构建及其质量检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及菊花破壁饮片的指纹图谱共有模式构建及其质量检测方法。该方法以异绿原酸A为对照峰，在柱温为35℃，波长为348nm，流动相为乙腈-0.5％磷酸溶液，洗脱梯度0-8min-24min-50min-75min，乙腈变化为14％-18％-18％-25％-45％的色谱条件下，对10批以上样品进行HPLC分析，建立共有模式标准图谱和判断指标。将同一色谱条件下的待测样品图谱与之比较，检测待测样品的质量。本发明是首次针对菊花破壁饮片建立的HPLC指纹图谱及质量检测方法。该图谱较全面涵盖了菊花破壁饮片主要活性成分的图谱信息，专属性强，检测快速准确；并能有效控制药材、破壁粉体、破壁饮片的整体质量。

Description

菊花破壁饮片的指纹图谱构建及其质量检测方法

技术领域

本发明涉及中药饮片的质量检测方法，尤其是菊花破壁饮片的HPLC指纹标准图谱构建及其质量检测方法。

背景技术

菊花是菊科植物菊ChrysanthemummorifoliumRamat.的干燥头状花序。中药破壁饮片是利用现代超微粉碎技术将传统饮片进行破细胞壁粉碎成粒度分布D90小于45μm的微细颗粒，再制成30～100目的颗粒。相对于传统饮片具有色泽一致，质量均一，稳定性好的特点为创新型中药饮片。由于中药破壁饮片不具传统中药饮片的形态特征，破壁后会带来有效成分或指标成分等化学成分的溶出度变化，使传统饮片的鉴别、质量检测方法不能完全适用。因此，必须针对中药破壁饮片建立专属性强，全面反映中药破壁饮片质量状况的检测方法。而建立一项新的质量检测方法并非易事，例如检测条件、对照品的选择和供试品的制备方法等均需要研究考量并进行验证。虽然现有技术中有涉及中药指纹图谱的检测方法，但并无针对形态特殊的中药破壁饮片的方法，且存在专属性、稳定性、重现性和精密度差缺陷，不能完全反应饮片的质量情况的缺陷。

发明内容

为克服以上缺陷，本发明提供了一种适用于菊花破壁饮片的HPLC指纹标准图谱构建方法，并在此基础上进一步提供该饮片的质量检测方法。

所述的菊花破壁饮片的标准图谱构建方法包括以下步骤：

(1)供试品溶液的制备:精密称定菊花破壁饮片0.25g，加入70％甲醇25mL，超声提取40分钟，提取液用0.22um微孔滤膜滤过，取续滤液，即得；

(2)对照品溶液的制备:精密称取绿原酸、木樨草苷、异绿原酸A对照品适量，加70％甲醇溶解配制成浓度分别为0.173mg/ml、0.152mg/ml、0.249mg/ml的混合对照品溶液；

(3)色谱条件与系统适用性试验:以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱；以乙腈为流动相A，以0.5％磷酸溶液为流动相B，梯度洗脱；柱温为35℃；检测波长为348nm；流速：0.6mL/min；梯度洗脱的时间及流动相比例为：0～8min，流动相A：14→18％，流动相B：86→82％；8～24min，流动相A：18％，流动相B：82％；24～50min，流动相A：18→25％，流动相B：82→75％；50～75min，流动相A：25→45％，流动相B：75→55％；对照品进样5ul，样品进样20ul；

(4)按上述供试品溶液及对照品的制备方法及和色谱条件对11批菊花破壁饮片样品进行HPLC 分析，得到相应指纹图谱；以异绿原酸A峰为参照峰，计算各指纹图谱中主要色谱峰的相对保留时间及相对峰面积；输入指纹图谱分析软件，对各批次样品指纹图谱进行相似度比较，以平均谱图为共有模式，计算相似度，建立菊花破壁饮片指纹图谱共有模式标准图谱，包括15个共有特征峰。

所述质量检测方法，包括以下步骤：

(1)按标准图谱构建方法中步骤(1)和步骤(2)分别制备待测样品供试品溶液和对照品溶液，按步骤(3)的色谱条件，精密吸取待测样品供试品溶液20μl，对照品5ul，注入HPLC色谱仪，测定，记录色谱，即得。

(2)合格指标的建立及指定图谱、判断方法：供试品色谱中，呈现15个与权利要求1所述菊花破壁饮片指纹图谱共有模式标准图谱相对应的特征峰；按中药色谱指纹图谱相似度评价系统计算，供试品指纹图谱与对照品指纹图谱的相似度不得低于0.90。以异绿原酸A峰为对照峰，其余14个共有特征峰相对保留时间分别为：0.287、0.620、0.724、0.794、0.952、1.073、1.159、1.177、1.278、1.401、1.449、1.527、1.596、1.656，各峰相对保留时间RSD≤±5％，为合格品。

本发明是首次针对菊花破壁饮片质量控制所构建的HPLC指纹图谱共有模式标准图谱及质量检测方法。该图谱较全面涵盖了菊花破壁饮片主要活性成分绿原酸、木犀草苷、异绿原酸A、木犀草素及芹菜素的图谱信息，专属性明显优于现有的同类指纹图谱方法。经试验验证该方法的稳定性、重现性和精密度均达到法定要求，且操作简单，检测快速准确；并能有效控制菊花药材、菊花破壁粉体、菊花破壁粉粒整体质量及鉴别伪品。

附图说明

图1是菊花破壁饮片预实验4所得图谱(351nm)

图2是菊花破壁饮片预实验3所得图谱(351nm)

图3是菊花破壁饮片预实验2所得图谱(351nm)

图4是菊花破壁饮片预实验1所得图谱(351nm)

图5是菊花破壁饮片专属性考察图谱。

图6是指纹图谱的共有模式的建立中11批次菊花破壁饮片谱图。

图7是菊花破壁饮片特征指纹图谱共有模式标准图谱。

图8是主成分色谱峰的指认中确定的5个对照品图谱。

具体实施方式

一、菊花破壁饮片指纹图谱共有模式标准图谱的构建。

1仪器与试药 

1.1仪器

安捷伦1200RRLC快速液相色谱仪(配有G1315C型号DAD检测器、G4218A的ELSD蒸发光检测器、G1312B二元泵、G1329B自动进样器、G1322A脱气机、G1316B柱温箱，Agilent Chemstation色谱工作站

1.2试药

试剂：甲醇，色谱纯(安徽时联特种溶剂有限公司)，乙腈，色谱纯(安徽时联特种溶剂公司色谱纯)，双蒸水(实验室自制)、磷酸(分析纯,天津福晨化学试剂厂)、甲醇(分析纯,广州化学试剂厂)。绿原酸、木犀草苷、异绿原酸A、木犀草素及芹菜素对照品。

供试品：菊花破壁饮片、菊花破壁粉体、菊花原料药材(均由中山中智药业集团提供)

2实验方法

2.1预试验

中智菊花破壁饮片主要原料药材来源为杭白菊的胎菊，于是主要参考对杭白菊化学成分及指纹图谱研究的相关文献。通过对文献分析，初步拟定以下4预实验方案：

预实验方案1样品制备：精密称取菊花破壁饮片0.5146g，加25ml75％的甲醇，称定重量，超声提取40min，取出，冷却至室温，用提取溶剂补重，粗滤，用0.22um微孔滤膜过滤，取续滤液，即得。色谱条件：Waters Symmetry C18色谱柱(250mmx4.6mm,5um)；流动相为乙腈-0.5％磷酸水溶液，梯度洗脱：0min-1min-18min-32min-55min-75min,乙腈变化5％-10％-18％-18％-25％-45％；流速1ml/min；柱温35℃；检测波长268、351、210nm；进样体积10ul。

预实验方案2样品制备：精密称取菊花破壁饮片0.5146g，入25ml75％的甲醇，称定重量，超声提取40min，取出，冷却至室温，用提取溶剂补重，粗滤，用0.22um微孔滤膜过滤，取续滤液，即得。色谱条件：Waters Symmetry C18色谱柱(4.6x250mm，5um)；流动相以乙腈-0.5％的磷酸水溶液，梯度洗脱：0min-50min-100min，乙腈变化：10％-25％-60％；检测波长268、351、210nm；流速1ml/min；柱温30℃；进样体积10ul。

预实验方案3样品制备：精密取破壁饮片0.5146g，加25ml75％的甲醇，称定重量，超声提取40min，取出，冷却至室温，用提取溶剂补重，粗滤，用0.22um微孔滤膜过滤，取续滤液，即得。色谱条件：Waters Symmetry C18色谱柱(250nmx4.6nm,5um)；流动相为乙腈-0.5％磷酸水溶液，梯度洗脱：0min-60min,乙腈变化5％—95％；流速1ml/min；柱温35℃；检测波长268、351、210nm；进样体积10ul。

预实验4样品制备：精密称取菊花破壁饮片约0.5146g，加入25ml75％的甲醇，称定重量，超 声提取40min，取出，冷却至室温，用提取溶剂补重，粗滤，用0.22um微孔滤膜过滤，取续滤液，即得。色谱条件：Waters Symmetry C18色谱柱(4.6x250mm，5um)；流动相以乙腈-0.1％的磷酸水溶液，梯度洗脱：0min-50min-100min，乙腈变化：10％-25％-60％；检测波长268、351、210nm；流速1ml/min；柱温30℃；进样体积10ul。

预实验结果：通过4次预实验，发现：268nm和351nm两个波长信息量差不多，但是351nm相对比较平稳。在351nm下，各预实验方案所得样品出峰数目差不多，说明预试验对样品的洗脱基本完全，见图1-图4。预实验方案1各峰的分离度高，峰形比较好。

采用预实验方案1分析了绿原酸、木犀草苷、异绿原酸A、木犀草素及芹菜素共5个对照品，通过紫外吸收光谱图及色谱峰保留时间对应性，初步指认了上述5个对照品峰。由此确定预实验方案1对菊花破壁饮片具有一定的评价意义。

2.2样品制备方法考察

2.2.1提取溶剂的考察

由于菊花中的主要活性成分为黄酮、苯丙酸类化合物，黄酮在醇性溶剂中溶解性较好，我国学者对菊花药材指纹图研究几乎都以甲醇或乙醇作为提取溶剂，所以本项目只考察乙醇和甲醇2种溶剂对菊花破壁饮片的提取效率影响。

样品处理：精密称取菊花破壁饮片4份各约0.500g，置具塞锥形瓶中，其中两份加入75％乙醇，另外两份加入75％甲醇50mL，称定重量，浸润30min，超声提取40min，取出放冷，粗滤，0.22um微孔滤膜过滤即得供试品。

色谱条件：Waters Symmetry C18色谱柱(250mmx4.6mm,5um)；流动相为乙腈-0.2％磷酸水溶液，梯度洗脱：0min-1min-18min-32min-55min-75min,乙腈变化5％-10％-18％-18％-25％-45％；流速1ml/min；柱温35℃；检测波长268、351、348nm；样品进样量20ul，对照品进样量5ul。

分析上述4份样品，比较不同溶剂提取差异，以样品谱图出峰数目多、峰分布均匀且绿原酸、木樨草苷，异绿原酸A等含量高为选择标准，筛选出最佳提取溶剂。结果见表1。

表1 菊花指纹图谱348nm下主要色谱峰面积

由上述表格统计得出75％甲醇提取所得绿原酸平均含量0.475％，木樨草苷0.445％，异绿原酸A为1.030％；75％乙醇提取物绿原酸平均为0.431％，木樨草苷0.445％，异绿原酸A为1.046％。分析所得的两谱图相似度达0.998以上，结合表1得出：两种提取溶剂提取效率没有明显区别，中国药典含测也是使用70％甲醇作为提取溶剂，于是采用甲醇为提取溶剂。

2.2.2甲醇提取浓度的考察

分别考察50％甲醇、70％甲醇、80％甲醇、甲醇4种不同浓度甲醇溶液对菊花破壁饮片样品化学成分提取的影响。

样品处理：精密称取8份菊花破壁饮片1：0.5014g 2:0.5018g 3：0.5013g，4：0.5012g,5：0.5011g，6：0.5015g，7：0.5018g，8：0.5015g置具塞锥形瓶中，1和2号加入50ml50％甲醇、3和4号加入50ml75％甲醇、5和6号加入50ml80％甲醇、7和8号加入50ml甲醇，称定重量，浸润30min，超声(频率4200KHz,320w)提取40min，取出，冷却至室温，用提取溶剂补足失重，摇匀，0.22μm微孔滤膜滤过，取续滤液作为供试品。

色谱条件：Waters Symmetry C18色谱柱(250mmx4.6mm,5um)；流动相为乙腈-0.2％磷酸水溶液，梯度洗脱：0min-1min-18min-32min-55min-75min,乙腈变化5％-10％-18％-18％-25％-45％；流速1ml/min；柱温35℃；检测波长268、348、351nm；样品进样量20ul，对照品进样量5ul。分析上述8份样品，比较不同浓度甲醇提取效率，以样品谱图出峰数目多、峰分布均匀且绿原酸、木犀草苷，异绿原酸A含量高为选择标准，筛选出提取溶剂最佳浓度，结果表2所示。

表2 甲醇提取浓度的考察

备注：1为对照品(均)，2为对照药材1，3为对照药材2，4为50％甲醇1，5为50％甲醇2,6为70％甲醇1,7为70％甲醇2,8为80％甲醇1,9为80％甲醇2,10为100％甲醇1,11为100％甲醇2。

由表2得出50％、70％、80％甲醇提取效率远远高于甲醇，且随甲醇提取浓度升高，绿原酸提取效率逐渐下降，木犀草苷则随浓度升高而升高，异绿原酸A影响则不明显，结合《中国药典》对上述三种化合物含量测定的方法规定，最终选择70％甲醇作为提取溶剂。

2.2.3提取方式的考察

精密称定6份菊花破壁饮片1：0.5014g 2:0.5013g 3：0.5014g，4：0.5040g,5：0.5047g，6：0.5034g，置具塞锥形瓶中，分别加入70％甲醇50mL，称定重量，分别采用以下3种方法提取样品：①索氏提取：样品1和2号放入索氏提取器中，加入约80ml70％甲醇，浸润30min，回流提取至提取液近无色，取出，冷却至室温，转移至100ml的量瓶中，加70％就甲醇稀释至刻度，摇匀，0.22um微孔滤膜过滤备用；②超声提取：样品3和4号放置具塞锥形瓶中，加入50ml70％甲醇，称定重量，浸润30min,超声提取60min(功率500W，频率4200Hz)，取出，冷却至室温，用提取溶剂不足失的重量，摇匀，过滤备用。③水浴加热回流提取：样品5和6号放置具塞锥形瓶中，加入70％甲醇50ml,称量重量，浸润30min,80℃水浴加热回流2h，取出,冷却后补足失重，摇匀，0.22μm微孔滤膜滤过，取续滤液作为供试品。

采用色谱条件：Waters Symmetry C18色谱柱(250mmx4.6mm,5um)；流动相为乙腈-0.2％磷酸水溶液，梯度洗脱：0min-1min-18min-32min-55min-75min,乙腈变化5％-10％-18％-18％-25％-45％；流速1ml/min；柱温35℃；检测波长348nm；样品进样量20ul，对照品进样量5ul，分析上述6份样品，比较不同提取方法的提取效果。

以样品谱图出峰数目多、峰分布均匀且绿原酸、木犀草苷，异绿原酸A含量高为选择标准，筛选出样品相对最佳提取方法。结果如表3所示：总体来说，索氏提取的效率远远低于超声提取和回流提取，但是超声及回流提取两者没有明显的差异，且两谱图全谱相似度也达到0.99，超声提取操作相对简单易行，于是选择超声提取作为最终提取方式。

表3 考察超声提取所得绿原酸、木犀草苷、异绿原酸A含量

2.2.4考察提取时间 

考察超声时间分别为30min、40min、60min、90min对菊花破壁饮片提取效率的影响。样品制备：精密称取8份菊花破壁饮片样品，1号0.5028g、2号0.5030g、3号0.5024g、4号0.5025g、5号0.5032g、6号0.5029g、7号0.5040g、8号0.5048g，分别加入50ml70％甲醇，称定重量，浸润30min,1和2号超声提取30min,3和4号超声40min,5和6号超声60min，7和8号超声提取90min，取出，冷却至室温，用70％甲醇补足减失重量，摇匀，0.22um微孔滤膜过滤备用。

色谱条件：Waters Symmetry C18色谱柱(250nmx4.6nm,5um)；流动相为乙腈-0.2％磷酸水溶液，梯度洗脱：0min-1min-18min-32min-55min-75min,乙腈变化5％-10％-18％-18％-25％-45％；流速1ml/min；柱温35℃；检测波长348nm；样品进样量20ul，对照品进样量5ul，分析上述8份样品，比较提取时间对菊花破壁饮片的提取效率的差异，以样品谱图出峰数目多、峰分布均匀且绿原酸、木樨草苷，异绿原酸A含量高为选择标准，筛选出样品提取时间。

结果见表4，通过图和表我们可以得出超声时间差异影响不明显，随着超声时间的延长，提取效率略有提高，但是提高幅度较小，于是选择提取相对充分的40min，作为提取时间，且提取条件与药典含测相近，对今后一测多评具有一定的意义。

表4 菊花破壁饮片提取时间考察

2.2.5考察样品提取液料比的影响

分别考察以下3种不同液料比影响：0.25g：25ml、0.25g：50ml、0.5：50ml。

样品制备：精密称取6份菊花破壁饮片，1号0.2521g、2号0.2519g、3号0.5003g、4号0.5012g、5号0.2550g、6号0.2559g。1和2号加入70％甲醇25ml，3和4号加入70％甲醇50ml、5和6号加 入70％甲醇50ml，称定重量，浸润30min，超声提取40min，取出，冷却至室温，用70％甲醇补足减失重量，摇匀，0.22um微孔滤膜过滤备用。

色谱条件：Waters Symmetry C18色谱柱(250nmx4.6nm,5um)；流动相为乙腈-0.2％磷酸水溶液，梯度洗脱：0min-1min-18min-32min-55min-75min,乙腈变化5％-10％-18％-18％-25％-45％；流速1ml/min；柱温35℃；检测波长348nm。分析上述6份样品，比较液料比对菊花破壁饮片提的提取效率的差异，以样品谱图出峰数目多、峰分布均匀且绿原酸、木樨草苷，异绿原酸A含量高为选择标准，筛选出样品液料比。

结果见表5，由表结合记录的图谱，可以得出三组液料比提取效率差异不明显，证明0.25g：25ml提取已经相对充分，且从节约角度出发，结合中国药典菊花含量测定方法及一测多评理念综合考虑，最终选择提取料液比为0.25g:25ml。

表5 菊花破壁饮片考察料比中主要色谱峰

2.3色谱条件考察 

2.3.1检测波长的选择

对样品进行全波长扫描，从其3D图中选择最佳检测波长。评价指标为：该波长下分析信号响应值大，出峰数量多，峰分布均匀且基线平稳，各峰分离度较好。

通过调用3D谱图分析得出，在348nm处，菊花样品出峰个数较多，且响应值较大，基线相对稳定，于是选择348nm作为分析波长。

2.3.2流动相的选择 

参考文献，在上述色谱条件下，考察下列流动相系统：(1)乙腈-0.5％的磷酸系统；(2)乙腈-0.3％的磷酸；(3)乙腈-0.2％的磷酸、(4)乙腈-0.1％的磷酸。最终筛选出菊花破壁饮片样品最佳洗脱系统。

样品制备：精密称取0.2510g的菊花破壁饮片(20131002)于具塞锥形瓶中，加入70％甲醇25ml， 称定重量，浸润30min，超声提取40min，取出，冷却至室温，用提取溶剂补足减失的重量，摇匀，过滤，备用。

色谱条件：Waters Symmetry C18色谱柱(250mmx4.6mm,5um)；流动相分别为乙腈-0.5％磷酸、乙腈-0.3％磷酸溶液、乙腈-0.2％磷酸溶液、乙腈-0.1％磷酸水溶液，梯度洗脱：0min-1min-18min-32min-55min-75min,乙腈变化5％-10％-18％-18％-25％-45％；流速1ml/min；柱温35℃；检测波长348nm。分析上述4种不同洗脱系统对菊花破壁饮片分离效果的差异，以样品谱图出峰数目多、峰分布均匀且绿原酸、木樨草苷，异绿原酸a基本分开为选择标准。

结果通过记录的图谱可见：磷酸浓度为0.1％～0.3％对菊花分离影响差异不明显，只有浓度达到0.5％才能将中间两个峰稍微分开，但是0.5％磷酸溶液PH介于2-3，出于对色谱柱保护考虑不宜继续增加酸度，于是最终选择乙腈-0.5％磷酸水洗脱系统。

2.3.6流速的选择 

在流动相组成基本确定而分离度未达要求前提下，分别考察0.6ml/min、0.8ml/min、1ml/min、1.2ml/min流速时的样品分析效果，以达到进一步的分离效果，选择出最合适的流速。

样品制备：精确称取0.2510g菊花破壁饮片于锥形瓶中，加入25ml70％的甲醇，称定重量，浸润30min,超声提取40min,取出，冷却至室温，用提取溶剂补足减失的重量，摇匀，0.22um微孔滤膜滤过备用。

色谱条件：Waters Symmetry C18色谱柱(250nmx4.6nm,5um)；流动相乙腈-0.2％磷酸溶液，梯度洗脱：0min-1min-18min-32min-55min-75min,乙腈变化5％-10％-18％-18％-25％-45％；柱温35℃；检测波长348nm；流速分别为0.6ml/min、0.8ml/min、1ml/min、1.2ml/min。分析上述样品，考察流速对菊花破壁饮片分离效果的影响，以样品谱图出峰时间适中，峰分离度高、分布均匀且绿原酸、木樨草苷，异绿原酸A基本分开为选择标准。

通过记录谱图分析，得出：流速提高，峰形瘦高；流速降低，分离度逐渐提高，但是峰矮胖，0.6ml/min流速所得谱图分离度明显优于其他试验组，洗脱比较完全，峰面积比较大，误差减少，于是选择0.6ml/min作为最终洗脱流速。

2.3.7色谱柱柱温的比较

在流速已经确定情况下，菊花破壁饮片图谱峰分离度基本达要求，于是考察25℃、30℃、35℃、40℃柱温对样品分析效果，微调，进一步提高分离度，选择最合适的柱温。

样品制备：精密称取0.2505g菊花破壁饮片于50ml具塞锥形瓶中，加入70％甲醇25ml,称定重量，浸润30min,超声提取40min,取出，冷却至室温，用提取溶剂补足减失重量，摇匀，0.22um微 孔滤膜过滤，备用。

色谱条件：Waters Symmetry C18色谱柱(250mmx4.6mm,5um)；流动相乙腈-0.5％磷酸溶液，梯度洗脱：0min-1min-18min-32min-55min-75min,乙腈变化5％-10％-18％-18％-25％-45％；流速0.6ml/min；检测波长348nm；柱温20℃、25℃、30℃、35℃、40℃。分析上述样品，考察柱温对菊花破壁饮片分离效果的影响，以样品谱图出峰时间适中，峰分离度高、分布均匀且绿原酸、木樨草苷，异绿原酸A基本分开为选择标准。对记录图谱进行比较，柱温35℃谱图中各峰的分离度相对比较高，5个梯度温度出峰个数几近相等，于是选择柱温35℃做为最终温度。

2.3.4梯度优化

以预实验1方法为菊花破壁饮片方法1考察流动相系统、柱温、流速后确定为菊花破壁饮片方法2，在方法2的基础上对洗脱梯度进行微调，将洗脱梯度简单化，为提高重复性做好准备。

样品制备：精密称取0.2505g菊花破壁饮片于50ml具塞锥形瓶中，加入70％甲醇25ml,称定重量，浸润30min,超声提取40min,取出，冷却至室温，用提取溶剂补足减失重量，摇匀，0.22um微孔滤膜过滤，备用。

色谱条件：Waters Symmetry C18色谱柱(250nmx4.6nm,5um)；流动相乙腈-0.5％磷酸溶液，原始梯度洗脱：0min-1min-18min-32min-55min-75min,乙腈变化5％-10％-18％-18％-25％-45％；流速0.6ml/min；检测波长348nm；柱温35℃。进行洗脱梯度微调，以样品谱图出峰时间适中，峰分离度高、分布均匀且绿原酸、木樨草苷，异绿原酸A基本分开为选择标准。

菊花破壁饮片洗脱梯度3：0min-8min-24min-50min-75min,乙腈变化14％-18％-18％-25％-45％。

菊花破壁饮片洗脱梯度4：0min-8min-20min-50min-75min,乙腈变化12％-18％-18％-25％-45％。

菊花破壁饮片洗脱梯度5：0min-5min-15min-45min-70min,乙腈变化14％-18％-18％-25％-45％。

在方法1的基础上提高乙腈的起始浓度，样品出峰提前，分离度基本符合要求；但拟通过延长中间分析时间来降低变化速率时，分离效果未见改善，于是最终选择洗脱梯度3做为最终的洗脱梯度。

2.3.5最终色谱条件的确定

Waters Symmetry C18色谱柱(250mmx4.6mm,5um)；流动相为乙腈-0.5％磷酸溶液，梯度洗脱：0min-8min-24min-50min-75min,乙腈变化14％-18％-18％-25％-45％；流速0.6ml/min；柱温35℃；检测波长348nm；对照品进样5ul,样品20ul。

2.4方法学考察 

按照2.2项下确定的样品制备方法，2.3项下确定的色谱条件，对其进行方法学考察。考察方法参照《中药注射剂指纹图谱研究的技术指南(试行)》。

2.4.1专属性

考察此方法建立的菊花破壁饮片指纹图谱是否能够表达该品种的特征，即唯一性。考察空白溶剂图谱(阴性样品图谱)在相应保留时间处有无色谱峰，有无干扰，是否符合要求。

结果如图5所示：阴性样品图谱在相应保留时间无色谱峰，无干扰，符合指纹图谱质量控制技术的要求。

2.4.2仪器精密度实验

取菊花破壁饮片(20131002)样品，按供试品制备方法进行制备，连续进样6次，记录指纹图谱，计算6次进样所得指纹图谱的各主要色谱峰的峰面积、含量RSD及所得指纹图谱的相似度。结果如表6所示：6谱图的相似度达0.999以上，主要色谱峰含量RSD均小于3％，符合指纹图谱技术要求。

表6 菊花破壁饮片精密度考察中主要色谱峰积分表

2.4.3重复性实验 

取同一批次菊花破壁饮片(20131002)样品，按供试品溶液的制备方法平行制备6份供试品， 记录指纹图谱，计算6次样品各主要色谱峰的峰面积和含量及所得指纹图谱的相似度，结果如表7所示：

表7 菊花破壁饮片稳定性考察主要色谱峰的积分数据

可见绿原酸、木犀草苷、异绿原酸A三主要色谱峰峰面积及含量RSD均小于3％，且6谱图的相似度高达0.9999以上，由此可以判断该方法重复性符合中国药典中药注射剂指纹图谱控制技术的要求。

2.4.4稳定性实验 

取菊花破壁饮片(20131002)样品按供试品制备方法，制备样品溶液，分别于0h，3h，6h，9h，12h，14h，16h，24h内测定，计算24h内各主要色谱峰的峰面积及含量的RSD,及所得指纹图谱的相似度。结果见表8，稳定性测得的7张谱图的相似度0.999以上，主要色谱峰峰面积RSD小于3％，相对峰面积RSD小于5％，说明该样品在24小时候内性质是稳定的。

表8 菊花破壁饮片稳定性考察主要色谱峰的积分数据

2.5柱子适应性考察

采用上述确定的最佳提取条件及色谱条件比较Agilent ZORBAX SB-C18(250mm×4.6mm，5um)、Waters Symmetry C18(250mm×4.6mm，5um)、菲罗门Phenomenex Synergi 4u Fusion-RP80A(250mm×4.6mm，5um)、Thermo Acclaim^TM120C18(250mm×4.6mm，5um)、Thermo ODS HPERSILC18(250mm×4.6mm，5um)5根不同色谱柱的分离效果，判断该方法对柱子的适用性。

通过分析得出：除菲罗门柱子外，其他的4款分离效果比较一致，相似度0.95以上，说明该方法对柱子的选择性不强。

2.6仪器适用性的考察

按照上述确定的样品制备方法及色谱条件分别考察Agilent 1200RRLC、Agilent 1200LC、岛津LC-20A三不同型号的液相色谱仪器对菊花破壁饮片分析效果，结果通过所得图谱比较及中智指纹图谱分析软件得出：三谱图的相似度达0.998以上，因此该方法的仪器适用性比较广。

2.7菊花破壁饮片原药材-中间成品-成品之间的相关性分析

收集0212092701、0213011501、20131201三批次的菊花原料药材，在中试车间分别将其制备 成相对应的破壁粉体、破壁粉粒，使用上述最终确定的提取条件和色谱条件对3批次药材粗粉、破壁粉体、破壁饮片9个样品进行测定，记录图谱，分析图谱结果如表9和表10所示。

表9 三批次药材-破壁粉体-破壁粉粒各自之间的相似度

表10 两批次破壁饮片相对峰面积比较

备注：1为批次0212092701，2为批次021311501

由上表得出三批次样品原料药材、破壁粉体、破壁饮片三者之间相似度0.995以上，说明破壁 饮片在制备过程中只是样品形态发生改变，而化学成份基本上没有发生变化，产品在整个生产过程中相对稳定。

2.8菊花破壁饮片指纹图谱共有模式的建立

按照上述确定的样品制备方法及色谱条件对已经收集到的11批菊花破壁饮片样品进行HPLC分析，得到相应指纹图谱。以图谱中峰面积较大，峰形较好，其保留时间适中的3，5-O-二咖啡酰基奎宁酸(异绿原酸A)峰为参照峰，计算各指纹图谱中主要色谱峰的相对保留时间及相对峰面积。利用中智药业集团中药指纹图谱数据库的指纹图谱分析软件，对各批次样品指纹图谱进行相似度比较(以平均谱图为共有模式)，计算相似度，并建立菊花破壁饮片指纹图谱共有模式(见图7)。其中，1号峰为绿原酸峰，3号为木犀草苷，6号为异绿原酸A。

样品制备：精密称取20120701、20120901、20120902、20130801、20130803、20130901、20130902、20130903、20131002共9个批次的菊花破壁饮片各约0.25g，置于具塞锥形瓶中，精密加入70％甲醇25ml，称定重量，浸润30min,超声提取40min,取出，冷却至室温，用提取溶剂补足减失的重量，摇匀，0.22um微孔滤膜过滤备用。

色谱条件：Thermo Acclaim^TM120C18色谱柱(250mm×4.6mm，5um)，柱温35℃，流速0.6ml/min,检测波长348nm,流动相:乙腈-0.5％的磷酸水溶液，梯度洗脱：0min-8min-24min-50min-75min,乙腈变化14％-18％-18％-25％-45％。对照品进样5ul，样品进样20ul。

将所得9批菊花破壁饮片指纹图谱图及2.7项下制备的2批次样品指纹图谱输入中智指纹图谱分析软件进行分析，结果如图6，表11-13所示：11批次样品谱图相似度均大于0.96，且除了三批次中试样品外其他的八批大生产收集样品，相似度均大于0.99，说明菊花破壁饮片样品的稳定性及均一性好。根据注射剂指纹图谱控制技术要求，从共有模式中选择峰面积较大，分离度较好的峰作为共有峰，最终提取了15个指纹峰做为菊花破壁饮片共有指纹峰,非共有峰总峰面积小于10％。15个共有峰的相对保留时间RSD均小于2％，符合注射剂指纹图谱控制技术要求。

表11 11批次菊花破壁饮片指纹图谱相似度

指纹图谱名称	相关系数	相合系数
			20120901	0.9947	0.9950
20120902	0.9937	0.9941
			20130801	0.9986	0.9987
20130803	0.9930	0.9935
			20130901	0.9980	0.9981
20130902	0.9976	0.9978
			20130903	0.9976	0.9978
20131002	0.9952	0.9955

[0143] 

0212092701	0.9618	0.9642
			2013011501	0.9722	0.9738
20120701	0.9847	0.9856

表12 11批菊花破壁饮片建立模型提取的共有指纹(以39.28min异绿原酸A为参照峰)

表13 11批次菊花破壁饮片15个共有指纹峰相对峰面积相对峰面积

2.9主成分色谱峰的指认

按照菊花破壁饮片样品HPLC指纹图谱分析方法分别分析绿原酸、芹菜素、异绿原酸A、木樨草苷、木樨草素5对照品，并与菊花破壁饮片样品指纹图谱比对(增加空白试剂对照)，结合光谱及色谱保留时间确定各对照品峰在共有指纹图谱中的对应位置，对相应对照品峰进行指认，结果如图8所示：5个对照品均能找到相对应的色谱峰，且各峰的紫外吸收光谱也能一一对应。

3限度的制订 

所测的11批样品，相似度值均在0.96以上，考虑目前仅收集到11批次菊花破壁饮片样品，代表性有所欠缺，初拟定限度为0.9，按照中药色谱指纹图谱相似度评价系统，供试品指纹图谱与对照指纹图谱经相似度计算，相似度不得低于0.9。建议今后根据生产情况考察更多批次的样品，考察限度的合理性。

二、菊花破壁饮片的质量检测

供试品：抽取中智药业菊花破壁粉体和破壁粉粒共10批次进行质量检测。市场外购5批次其他厂家菊花破壁粉粒进行质量检测。检测方法如下：

1、供试品溶液的制备：取菊花破壁饮片约0.25g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70％甲醇25mL，称定重量，超声提取40分钟(功率320W，频率4200Hz)，放冷，再称定重量，用70％甲醇补足减失的重量，摇匀，0.22um微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

2、对照品配制：精密称取绿原酸、木樨草苷、异绿原酸A对照品适量，加70％甲醇溶解配制成浓度分别为0.173mg/m、0.152mg/ml、0.249mg/ml的混合对照品溶液。

3、色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱(4.6mm×250mm，5μm)；以乙腈-0.5％磷酸溶液为流动相，按下表中的规定进行梯度洗脱；柱温为35℃；检测波长为248nm；流速：0.6mL/min。

5、测定：精密吸取供试品溶液20μl，对照品5ul注入色谱仪，测定，记录图谱，即得。

6、合格指标的建立及指定图谱、判断方法：供试品色谱中，应呈现15个与图7-菊花破壁饮片HPLC指纹图谱共有模式相对应的特征峰。按中药色谱指纹图谱相似度评价系统计算，供试品指纹图谱与对照指纹图谱的相似度不得低于0.90。以异绿原酸A峰为对照峰，其余14个共有特征峰相对保留时间分别为：0.287、0.620、0.724、0.794、0.952、1.073、1.159、1.177、1.278、1.401、1.449、1.527、1.596、1.656，各峰相对保留时间RSD≤±5％为合格品。

结果：中智药业10批次样品均符合质量要求，外购样品其中4批次符合质量要求，1批次为不合格品。

Claims (2)

1.菊花破壁饮片的HPLC指纹图谱共有模式标准图谱的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)供试品溶液的制备:精密称定菊花破壁饮片约0.25g，加入50％～80％甲醇25mL，超声提取40分钟，提取液用0.22um微孔滤膜滤过，取续滤液，即得；

(2)对照品溶液的制备:精密称取绿原酸、木樨草苷、异绿原酸A对照品适量，加70％甲醇溶解配制成浓度分别为0.173mg/ml、0.152mg/ml、0.249mg/ml的混合对照品溶液；(3)色谱条件与系统适用性试验:以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱；以乙腈为流动相A，以0.5％磷酸溶液为流动相B，梯度洗脱；柱温为35℃；检测波长为348nm；流速：0.6mL/min；梯度洗脱的时间及流动相比例为：0～8min，流动相A：14→18％，流动相B：86→82％；8～24min，流动相A：18％，流动相B：82％；24～50min，流动相A：18→25％，流动相B：82→75％；50～75min，流动相A：25→45％，流动相B：75→55％；对照品进样5ul，样品进样20ul；

(4)按上述供试品溶液及对照品的制备方法及色谱条件对10批以上的菊花破壁饮片样品进行HPLC分析，得到相应指纹图谱；以异绿原酸A峰为参照峰，计算各指纹图谱中主要色谱峰的相对保留时间及相对峰面积；输入指纹图谱分析软件，对各批次样品指纹图谱进行相似度比较，以平均谱图为共有模式，计算相似度，建立菊花破壁饮片指纹图谱共有模式标准图谱，包括15个特征峰。

2.一种菊花破壁饮片的质量检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)按权利要求1所述的构建方法中步骤(1)和步骤(2)分别制备待测样品供试品溶液和对照品溶液，按步骤(3)的色谱条件，精密吸取待测样品供试品溶液20μl，对照品5ul，注入HPLC色谱仪，测定，记录色谱，即得。

(2)合格指标的建立及指定图谱、判断方法：供试品色谱中，呈现15个与权利要求1所述菊花破壁饮片指纹图谱共有模式标准图谱相对应的特征峰；按中药色谱指纹图谱相似度评价系统计算，供试品指纹图谱与对照品指纹图谱的相似度不得低于0.90。以异绿原酸A峰为对照峰，其余14个共有特征峰相对保留时间分别为：0.287、0.620、0.724、0.794、0.952、1.073、1.159、1.177、1.278、1.401、1.449、1.527、1.596、1.656，各峰相对保留时间RSD≤±5％，为合格品。