CN101904952A

CN101904952A - 一种泽泻提取物的质量评价方法

Info

Publication number: CN101904952A
Application number: CN2009101119248A
Authority: CN
Inventors: 林文津; 徐榕青; 张亚敏
Original assignee: FUJIAN PROV INST OF MEDICAL SCIENCES
Current assignee: FUJIAN PROV INST OF MEDICAL SCIENCES
Priority date: 2009-06-08
Filing date: 2009-06-08
Publication date: 2010-12-08

Abstract

本发明公开了一种泽泻提取物指纹图谱建立的方法及其指纹图谱。参照《中药注射剂指纹图谱研究的技术要求(暂行)》，运用高效毛细管电泳法进行测定，最后运用中药指纹图谱相似度计算软件分析相似度。本发明的优点是方法简便、稳定、精密度、重现性好、易于掌握，能从色谱的整体特征面貌上把握泽泻提取物的真伪和质量情况，可将其作为泽泻提取物质量评价和真伪鉴别的方法之一。

Description

一种泽泻提取物的质量评价方法

技术领域

本发明涉及泽泻提取物的鉴别及质量评价方法，具体地说是用指纹图谱来鉴别和评价泽泻提取物质量的方法，尤其涉及用高效毛细管电泳指纹图谱鉴别泽泻提取物真伪和质量稳定的方法。

背景技术

中药标准提取物，指采用现代技术手段，对传统中药材进行提取加工而得到的一种具有相对明确药效物质基础及严格质量标准的一种中药产品，可作为中药制剂的原料药。

中药及其复方是一个复杂体系，起疗效作用的物质基础为多种化学成分，包括无机物、小分子有机化合物(如生物碱、皂苷等)及生物大分子(如蛋白、多糖等)等。中药标准提取物的化学成分是多种药理活性物质按特定比例组成的集合，继承了中药多成分的特点，体现着原中药材特定的中医功效，且有效活性物质富集程度高(如银杏标准提取物中有效成分含量是原药材原料中的50倍)，因此无论作为单味药还是组成复方，均可替代原生药作为中药制剂的科学化原料药。

中药标准提取物在质量控制方面也有着无可比拟的优越性。目前中药制剂的原料药主要为中药材及饮片。但现阶段由于中药材品种繁多，基原相近，以及地域、生态环境、栽培、饮片加工炮制及储备养护等因素的影响，导致其品种混乱，质量难以有效控制，差异很大，影响了原料药内在质量的稳定，从而导致中药制剂产品的质量不稳定。因此要建立稳定的、真正反映中药制剂产品内在质量的质量标准，原料药质量的稳定和可控是关键所在，而标准可控、质量稳定、物质基础相对明确的中药标准提取物正是解决此类问题的一种重要途径。

泽泻为泽泻科植物泽泻Alisma Orientale(Sam.)Juzep的干燥块茎，性味甘、淡、寒，归肾、膀胱经，是利水渗湿要药。《神农本草经》将其列为上品。我国各版药典中均有收载，但至今为止，均未见载有泽泻中药材的定性、定量指标，更没有针对泽泻提取物的质量评价方法。目前已有文献报道用HPLC法测定泽泻药材指纹图谱的研究(刘红昌，杨文钰，陈兴福.四川道地药材泽泻指纹图谱的建立及其质量研究.中国中药杂志.2007，32(18)：1844-1847)。但针对福建省地道药材泽泻提取物的色谱指纹图谱未见报道。

毛细管电泳是一种高效分离技术，具有高效、快速、进样体积小、溶剂消耗少和抗污染能力强等特点，在中药有效成分分析、指纹图谱研究方面显示出显著的优势(马欣，孙毓庆.银杏叶提取物的毛细管电泳指纹图谱研究.中草药，2004，35(8)：876-878)。目前，未见采用毛细管电泳指纹图谱鉴别及评价泽泻提取物药材质量的报道，本申请人对不同批次泽泻提取物进行了考察比较，为建立泽泻提取物质量的综合评价方法，特以国家食品药品监督管理局2000年颁发的关于中药注射剂指纹图谱技术要求，对福建10批以上泽泻提取物药材进行了测定，建立了福建地道药材泽泻提取物指纹图谱测定方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种用指纹图谱鉴别和评价泽泻提取物质量的方法，并可将其用于泽泻提取物质量控制及其真伪鉴别的指标之一。

本发明通过下列步骤实施：

第一步，先建立泽泻提取物的标准指纹图谱，主要步骤包括：

(a)制备10批次以上具代表性的泽泻提取物。

(b)泽泻提取物标准品溶液的制备：将泽泻提取物干燥至恒重，精密称取泽泻提取物粉末适量，用醇性溶剂(C数小于5，优选为甲醇或乙醇)超声提取2～3次，合并提取液。滤过，滤液浓缩后，加醇性溶剂(C数小于5，优选为甲醇或乙醇)或者缓冲液稀释至一定浓度，摇匀，即得。进样前用微孔滤膜滤过。

采用高效毛细管电泳色谱法测定的指纹图谱，其泽泻提取物标准品溶液的具体制备优选的步骤为：分别取10批本品粉末约100mg，精密称定，置具塞锥形瓶中，加入甲醇30mL，超声提取30min，滤过，加甲醇20mL，超声提取30min，滤过，合并两次提取液，并定容至50mL量瓶中，摇匀，用0.45μm微孔滤膜滤过，即得。

(c)参照物溶液的制备：参照物为泽泻提取物中的有效成分，优选为泽泻醇类化合物，更优选为泽泻醇B。其供试液具体制备方法为：精密称取23-乙酰泽泻醇B对照品10.0mg，至10mL量瓶中，甲醇溶解定容，即得1.0mg/mL23-乙酰泽泻醇B对照品液。

(d)测定方法的选择：测定方法高效毛细管电泳法(HPCE)。

(f)测定：精密吸取泽泻提取物药材标准品溶液及参照物溶液，分别注入高效毛细管电泳仪，测定泽泻提取物标准指纹图谱。优选的分离条件为：采用胶束电动毛细管色谱(MEKC)电泳模式，压力进样：0.5Psi*10sec，分离电压30kV，柱温25℃，DAD检测波长为202nm，带宽8nm，参比波长400nm，带宽20nm。运行缓冲液由0.1mol/L硼砂∶0.1mol/LSDS∶甲醇(4∶6∶2)构成。

第二步，以上述相同的方法测定待测泽泻提取物样品指纹图谱；

第三步，将待测泽泻提取物样品指纹图谱与泽泻提取物标准指纹图谱对比，鉴别和评价该泽泻提取物样品是否为符合泽泻提取物标准指纹图谱的泽泻标准提取物。

泽泻提取物高效毛细管电泳色谱指纹图谱，以最大峰2号峰作内参峰，其11个共有峰的相对保留时间的相对标准偏差RSD均小于3％，其中1号峰的平均相对保留时间RT为0.24，相对标准偏差RSD为2.66％；2号峰的平均RT为1，RSD为0.00％；3号峰的平均RT为1.17，RSD为2.60％；4号峰的平均RT为1.25，RSD为1.43％；5号峰的平均RT为1.29，RSD为1.21％；6号峰的平均RT为1.30，RSD为1.45％；7号峰的平均RT为1.56，RSD为2.14％；8号峰为熊果酸，即参照物，其平均RT为1.59，RSD为2.18％；9号峰的平均RT为1.64，RSD为2.21％；10号峰的平均RT为1.68，RSD为1.92％；11号峰的平均RT为1.76，RSD为2.37％。

本发明的优点如下：

(1)所建立的泽泻提取物指纹图谱，能有效地表征泽泻提取物的质量，对泽泻提取物中的全部化学成分进行检测，既不现实也没必要。大量的药理和临床研究结果表明泽泻提取物中的泽泻醇类成分为其重要的有效成分之一，故选用其中的泽泻醇B作为参考品就很有代表性。

(2)以泽泻提取物整个指纹图谱作为一个整体看待，注重各个构成指纹特征峰的前后顺序和相互关系，注重整体面貌特征，既避免了因只测定一两个化学成分而判定泽泻提取物整体质量的片面性，又减少了为质量达标而人为处理的可能性，本发明为完整、准确评价泽泻提取物的质量提供了新的对照标准，将为提高泽泻提取物及其中成药制剂的质量及疗效做出贡献。

(3)本发明具有方法简便、稳定、精密度高、重现性好、易于掌握的特点。本方法采用毛细管电泳法检测，样品处理大为简便、节约了检验的成本和时间。

附图说明

图1泽泻提取物毛细管电泳色谱图共有峰；

图2泽泻提取物高效毛细管电泳色谱叠加图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步说明，但本发明的内容并不局限于此。

实施例一泽泻提取物HPCE指纹图谱研究

1溶液的配置

1.1对照品溶液的制备

精密称取23-乙酰泽泻醇B对照品5.0mg，至5mL量瓶中，甲醇溶解定容，即得1.0mg/mL23-乙酰泽泻醇B对照品液。

1.2供试品溶液的制备

分别取10批本品粉末约100mg，精密称定，置具塞锥形瓶中，加入甲醇30mL，超声提取30min，滤过，加甲醇20mL，超声提取30min，滤过，合并两次提取液，并定容至50mL量瓶中，摇匀，用0.45μm微孔滤膜滤过，即得。

2HPCE色谱条件

按要求配置实验用操作缓冲液，运行前超声脱气10min。每次进样分析开始前，均依次用1mol/LNaOH，水和缓冲液冲洗3min，以后每次进样依次用水、0.1mol/LNaOH溶液、水及缓冲液冲洗1min，进样前在运行电压下平衡5min。

分析过程采用胶束电动毛细管色谱(MEKC)电泳模式，优化的条件为，压力进样：0.5Psi*10sec，分离电压30kV，柱温25℃，DAD检测波长为202nm，带宽8nm，参比波长400nm，带宽20nm。运行缓冲液由0.1mol/L硼砂∶0.1mol/LSDS∶甲醇(4∶6∶2)构成。试验曾采用其他运行缓冲液，如：0.1mol/L硼酸∶0.1mol/L KOH(4∶2或5∶1)，单独采用0.1mol/L硼砂溶液，0.1mol/L硼砂溶液∶0.1mol/L KOH等，但因分离效果不太理想，未采用。

3方法学考察

3.1精密度试验

取S2号样品连续进样5次，计算峰面积大于总峰面积5％的色谱峰(P1，P2，P3，P4，P5，P7，P8，P9)的相对保留时间和相对峰面积，RSD分别在0.84和1.9以内。

3.2稳定性试验

取S2号样品分别在0，2，4，8，12h时进样测定，计算上述8个色谱峰的相对保留时间和相对峰面积，RSD分别在2.12％和4.3％以内。

3.3重现性试验

取S2号样品5份，进样测定，计算上述8个色谱峰的相对保留时间和相对峰面积，RSD分别小于0.57％和3.2％。

4样品的分离效果

采用优化后的HPCE色谱条件，测定对照品和供试品溶液，通过23-乙酰泽泻醇B对照品溶液与供试品溶液图谱的比较，发现色谱峰分离度与峰形较好，能测定其保留时间、峰面积及峰高并能进行定性分析。

5指纹图谱的建立

按上述1.2方法制备10批泽泻提取物供试品溶液，在在上述2选定的同一色谱条件下依次进样，测得10批泽泻提取物的HPCE色谱图。经比较分析10批样品所有的峰数、峰值(积分峰)和峰位(相对保留时间)等参数和色谱图后，从中选定11个共有峰作为构成泽泻提取物指纹图谱稳定的特征峰，见图1，其中8号峰为23-乙酰泽泻醇B，11个共有峰的峰面积总和占总峰面积的95％以上。10批泽泻提取物指纹图谱的叠加图见图2。

6指纹图谱分析与评价

6.1参照峰的选择

经比较所有测定和记录的样品色图谱，选取其中的11个共有峰作为特征峰，从样品色谱图中选择一个出峰时间较居中、在各样品中均稳定的组分作为参照峰，通过色谱图比较，选取2号峰为参照峰，将其作为内参比峰。

6.2指纹图谱技术参数

将各指纹图谱保留时间与内参比峰(2号峰)的保留时间比较，其比值为各指纹图谱的相对保留时间，10批泽泻提取物指纹图谱中各共有指纹峰的相对保留时间见表1；以内参比峰(2号峰)的峰面积作为1，其它各共有指纹峰的相对峰面积见表2，10批泽泻提取物HPCE指纹图谱相似度分析结果见表3。

表1 10批泽泻提取物HPCE指纹图谱共有峰的相对保留时间

表2 10批泽泻提取物HPCE指纹图谱共有峰的相对峰面积

6.3相似度评价

将测试数据导入《国家药典》委员会“中药指纹图谱相似度评价系统(2004A)”软件，经校正，将谱图自动匹配，然后生成对照图谱(平均数)，进行谱峰差异性评价和整体相似性评价。通过中药指纹图谱相似度计算软件得出泽泻提取物HPCE指纹谱共有图谱；与共有图谱比较，10批泽泻提取物的相似度分析结果见表，

表3 10批泽泻提取物HPCE指纹图谱相似性分析结果

结果表明，10批泽泻相似度均在0.9以上，说明福建地道药材泽泻提取物品质基本一致。

6.4指纹图谱特征分析

为易于辨认和分析，泽泻提取物HPCE指纹图谱可分为3个区：保留时间1.8～8.0min(I区)，出现1号和2号两个特征峰，最强峰为2号，其单峰面积占总峰面积8.92～13.41％；保留时间9.0～11.8min(II区)，出现3～6号四个特征峰，最强峰为3号，其单峰面积占总峰面积8.84～12.87％；保留时间12～14min(III区)，出现7～11号五个特征峰，最强峰为9号，其单峰面积占总峰面积8.55～11.28％。

指纹图谱中2、3、9三个强峰的峰面积约占总峰面积的30％，和其他峰相比，表观丰度相差较大，这是蔓荆子药材HPCE指纹图谱的一个主要特点。总体看来，三个区段中表观丰度最强的是第II区，其次是第I区、第III区。表观丰度最强的第II区和色谱峰较集中排列、丰度相对较低的第I区是辨认泽泻提取物HPCE指纹图谱的另一主要特点。

Claims

1.一种泽泻提取物的质量评价方法，包括如下步骤：

(a)收集10批次以上的泽泻提取物，并鉴定质量；

(b)泽泻提取物标准品溶液的制备；

(c)参照物溶液的制备；

(d)测定方法的选择；

(f)测定：精密吸取泽泻提取物标准品溶液及参照物溶液，分别注入检测仪器，测定泽泻提取物标准指纹图谱。

第三步，将待测泽泻提取物样品指纹图谱与泽泻提取物标准指纹图谱对比，筛选符合泽泻提取物标准指纹图谱的泽泻提取物。

2.如权利要求1所述的泽泻提取物质量评价方法，其特征在于，所述泽泻提取物标准品溶液的制备过程为：将泽泻提取物干燥至恒重，精密称取泽泻提取物粉末适量，用醇性溶剂(C数小于5，优选为甲醇或乙醇)超声提取2～3次，合并提取液。滤过，滤液浓缩后，加醇性溶剂(C数小于5，优选为甲醇或乙醇)或者流动相稀释至一定浓度，摇匀，即得。进样前用微孔滤膜滤过。优选的步骤为：分别取10批本品粉末约20mg，精密称定，置具塞锥形瓶中，加入甲醇30mL，超声提取30min，滤过，加甲醇20mL，超声提取30min，滤过，合并两次提取液，并定容至50mL量瓶中，摇匀，用0.45μm微孔滤膜滤过，即得。

3.如权利要求1所述的泽泻提取物质量评价方法，其特征在于所述泽泻提取物的指纹图谱为福建省地道药材泽泻的提取物指纹图谱。

4.如权利要求1所述的泽泻提取物质量评价方法，其特征在于：高效毛细管电泳色谱法测定的指纹图谱，以最大峰2号峰作内参峰，其11个共有峰的相对保留时间的相对标准偏差RSD均小于3％，其中1号峰的平均相对保留时间RT为0.24，相对标准偏差RSD为2.66％；2号峰的平均RT为1，RSD为0.00％；3号峰的平均RT为1.17，RSD为2.60％；4号峰的平均RT为1.25，RSD为1.43％；5号峰的平均RT为1.29，RSD为1.21％；6号峰的平均RT为1.30，RSD为1.45％；7号峰的平均RT为1.56，RSD为2.14％；8号峰为熊果酸，即参照物，其平均RT为1.59，RSD为2.18％；9号峰的平均RT为1.64，RSD为2.21％；10号峰的平均RT为1.68，RSD为1.92％；11号峰的平均RT为1.76，RSD为2.37％。

5.如权利要求1至4中任一权利要求所述的泽泻提取物质量评价方法，其特征在于，所述采用高效毛细管电泳色谱法测定的指纹图谱，其优选的条件为：采用胶束电动毛细管色谱(MEKC)电泳模式，压力进样：0.5Psi*10sec，分离电压30KV，柱温25℃，DAD检测波长为202nm，带宽8nm，参比波长400nm，带宽20nm。运行缓冲液由0.1mol/L硼砂∶0.1mol/LSDS∶甲醇(4∶6∶2)构成。