CN113960213A - 基于泽泻汤的泽泻成份的选定方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种基于泽泻汤的泽泻成份的选定方法，包括步骤a、泽泻样品的收；步骤b、选择仪器与试剂；步骤c、建立泽泻样品的指纹图谱；步骤d、泽泻的含量测定。本发明所建立的泽泻指纹图谱，能有效的表征泽泻成分的质量，可为泽泻汤质量的监控提供依据。能够更全面的对泽泻汤的质量进行评价，本发明所建立选定方法具有快速、稳定、重现性好、精密度高等优点，能够快速，准确的用于泽泻汤中的泽泻成分选定。

Description

基于泽泻汤的泽泻成份的选定方法
技术领域
本发明涉及药物领域，具体涉及一种基于泽泻汤的泽泻成份的选定方法。
背景技术
最早在《黄帝内经》的素问篇中就有泽泻与白术加以麋衔合用治疗″酒风″的记载。在东汉张仲景的《金匮要略·痰饮咳嗽病脉证并治第十二》中首次记载泽泻汤：″心下有支饮，其人苦冒眩，泽泻汤主之″。具有健脾利水的功效，为历代医家治疗痰饮眩晕的效方。现代学者通过实验研究发现，泽泻汤具有减轻内淋巴积水、降血脂，提高脑流量，利胆等药理作用。该方最早应用于眩晕证，后经过长期的临床验证，该方也有较好的降血脂作用。
泽泻为泽泻科植物泽泻的干燥块茎，具有利水渗湿，泄热，化浊降脂的功效，用于治疗小便不利，水肿胀满，泄泻尿少，痰饮眩晕，热淋涩痛，高脂血症。泽泻科泽泻属植物现共有11种，主要分布于北半球温带和亚热带地区，我国产6种，分别为泽泻、东方泽泻、草泽泻、膜果泽泻、窄叶泽泻和小泽泻。
当前我国泽泻主要产地为四川与福建，分别被称为川泽泻与建泽泻，且由于药理作用相同，目前均作为泽泻商品药材。建泽泻与川泽泻二者植物生长发育、植株形态及化学成分有明显区别。目前建泽泻虽然品质较高，但由于沿海地区的劳动成本高，种植面积萎缩，减产严重，而四川地区不断创新育种和规范加工，品质在逐步提高。因此市场上流通的基本为四川泽泻。
泽泻的成分主要包括三萜类成分、倍半萜类成分、二萜类成分以及其他成分。
目前，研究者已经从泽泻中分离出97个三萜类化合物，是泽泻中研究最多同时也是已知最多的化合物种类，它们的化学骨架基本为原萜烷型(Protostane)四环三萜，是泽泻的特征性成分。泽泻三萜类成分主要代表有泽泻醇A、B、C、D、E、F、G、H、I、J、K、L、M、N、O及其相应的衍生物及NeoaLisoL、NeoaLisoL 11，24-diacetate、ALismakectoneA 23-acetat等，按生物途径归纳，它们均由23-乙酰泽泻醇B(ALisoL B 23-acetate)衍生而来。有研究表明，泽泻具有利尿、抗结石及肾脏保护、降血脂及保肝、降血糖、抗癌、抗氧化损伤、抗炎等药理作用，而这些作用均与泽泻的三萜类成分有关，并且部分药理作用已发现其作用机制。
从泽泻中首次分离得到两个的倍半萜，到目前已分离得到51个倍半萜，在目前得到的三萜类成分，以aLismoxide，orientaLoL AG及其衍生物为代表的愈创木型为主，除此之外还有刺参烷型、吉马烷型、苍耳烷型、桉叶烷型和其他。泽泻的倍半萜类成分虽然已经分离得到了51个，但是对于泽泻的药理研究主要集中在三萜类成分，针对倍半萜类成分的研究较少。
目前泽泻中分离出的二萜类成分较少，泽泻除了萜类成分外，泽泻还有含氮化合物、苯丙素、糖类、甾体、黄酮酚酸、脂肪烃及其衍生物等类型化合物，约占泽泻全部已知化合物的三分之一。含氮化合物主要为碱基、核苷及吲哚类成分；苯丙素类化合物目前已分离得到18个化合物；糖类包括3个多糖，6个低聚糖以及5个单糖；其余还有β-谷甾醇、胡萝卜苷及其衍生物等甾体，双黄酮、查尔酮、黄酮和异黄酮等黄酮。此外还有部分脂肪烃衍生物及其他类型化合物。目前市场上泽泻汤中的泽泻成分选定依赖于传统方式，准确度和效率较差，因此需要一种能够准确、高效测定泽泻汤中泽泻成分的选定方法。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种基于泽泻汤的泽泻成份的选定方法。
为了实现上述目的，本发明通过如下技术方案实现：
一种基于泽泻汤的泽泻成份的选定方法包括如下步骤：
步骤a、泽泻样品的收集：在泽泻主产区进行样品收集，并进行编号；
步骤b、选择仪器与试剂：仪器包括高效液相色谱仪、质谱仪、超声清洗器、万分之一电子分析天平、十万分之一电子分析天平、高速离心机，试剂包括泽泻醇A、24-乙酰泽泻醇A、泽泻醇B、23-乙酰泽泻醇C、23-乙酰泽泻醇B、乙腈、甲酸、超纯水、分析纯；
步骤c、建立泽泻样品的指纹图谱：通过对色谱条件、泽泻制备、试验方法学、不同产地泽泻药材指纹图谱、各市场泽泻指纹图谱分析、化学模式识别、泽泻共有峰定性分析，将泽泻图谱导入软件进行分析，计算得出泽泻与生成的对照图谱的相似度，并根据指纹图谱分析结果，将生成的对照图谱中无法肉眼识别的小峰剔除；
步骤d、泽泻的含量测定：通过对色谱条件、泽泻制备、方法学考察，建立各自的指纹图谱，并对其差异性成分进行分析。
进一步地，在步骤c中，色谱条件包括测定波长和流动相，检测波长为210nm。
进一步地，在步骤c中，泽泻制备包括提取溶剂、提取时间的控制、样品中加酸量考察。
进一步地，在步骤c中，试验方法学包括精密度试验、重复性试验、稳定性试验、耐用性试验。
进一步地，在步骤c中，不同产地泽泻药材指纹图谱包括不同产地泽泻的相似度比较、不同产地泽泻指纹图谱的建立、不同产地泽泻共有峰的标定与分析。
进一步地，在步骤c中，化学模式识别包括聚类分析、主成分分析、正交最小二乘法判别分析。
进一步地，在步骤c中，泽泻共有峰定性分析包括色谱条件、质谱条件、各产地共有峰鉴定结果与分析。
进一步地，在步骤d中，色谱条件包括含量测定成分的选择、测定波长的选择、流动相的选择。
进一步地，在步骤d中，泽泻制备包括提取溶剂的选择、提取时间的选择。
进一步地，在步骤d中，方法学考察包括线性范围考察、精密度试验、重复性试验、稳定性试验、加样回收率试验、耐用性试验。
有益效果：本发明所建立的泽泻指纹图谱，能有效的表征泽泻成分的质量，可为泽泻汤质量的监控提供依据。能够更全面的对泽泻汤的质量进行评价，本发明所建立选定方法具有快速、稳定、重现性好、精密度高等优点，能够快速，准确的用于泽泻汤中的泽泻成分选定。
附图说明
为了易于说明，本发明由下述的具体实施例及附图作以详细描述；
图1为泽泻各对照品光谱图；
图2为泽泻指纹图谱不同流动相条件考察色谱图；
图3为不同溶剂提取的泽泻样品色谱图；
图4为不同提取时间的泽泻样品色谱图；
图5为不同加酸量的泽泻样品色谱图；
图6为不同色谱柱的泽泻样品色谱图；
图7为不同检测温度下泽泻样品的色谱图；
图8为不同流速下泽泻样品的色谱图；
图9为不同批次泽泻的指纹图谱；
图10为各产地泽泻指纹图谱；
图11为各产地泽泻对照图谱；
图12为市场泽泻与各产地对照图谱指纹图谱。
具体实施方式
下面结合附图下面将通过具体实施例对本发明做进一步的具体描述，但不能理解为是对本发明保护范围的限定。
对四川、广西、福建和江西产出泽泻样品进行收集，并对四川成都荷花池药材市场、安徽亳州中药材市场及广西玉林银丰国际中药港这三个大型中药材市场的泽泻进行采样。通过对产地及市场流通的泽泻样品进行指纹图谱分析，研究全国泽泻整体情况，依据不同产地的化学成分特点制定不同的指纹图谱标准。之后对四川、广西、福建和江西这四个产地的泽泻通过模式识别(CA、PCA和OPLS-DA)，将这四个产地泽泻进行区分并探讨它们之间成分的差异并通过HPLC-MS/MS对各成分进行鉴定，确认其差异性成分。
基于泽泻汤的泽泻成份的选定方法，包括如下步骤：
步骤a、泽泻样品的收集：在泽泻主产区进行样品收集，并进行编号。
在本实施例中，目前四川为泽泻的主产区，根据调研，当前全国流通的泽泻药材由四川产出的约80％。共收集四川样品19批，分别为S1-S19。
广西泽泻的产量目前仅次于四川，根据调研，当前全国流通的泽泻药材由广西产出的占约15％。共收集广西样品8批，分别为S20-S27。
江西与福建泽泻被统称为″建泽泻″，根据调研，当前全国流通的″建泽泻″占比约5％。收集江西样品2批，分别为S28-S29。收集福建样品2批，分别为S30-S31。
全国最大的泽泻药材交易市场为四川成都荷花池药材市场，安徽亳州中药材市场和广西玉林银丰国际中药港也有泽泻流通。共收集了15批四川成都荷花池药材市场、6批安徽亳州中药材市场和3批广西玉林银丰国际中药港这三个中药材交易市场流通的泽泻，分别为Y1-Y24。
步骤b、选择仪器与试剂：仪器包括高效液相色谱仪、质谱仪、超声清洗器、万分之一电子分析天平、十万分之一电子分析天平、高速离心机，试剂包括泽泻醇A、24-乙酰泽泻醇A、泽泻醇B、23-乙酰泽泻醇C、23-乙酰泽泻醇B、乙腈、甲酸、超纯水、分析纯。
在本实施例中，仪器包括Waters e2695高效液相色谱仪(包括2998PDA二极管阵列检测器，美国Waters公司)；AB SCIEX Triple TOFTM5600质谱仪(美国AB公司)；KH-250B型超声清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；AL210型万分之一电子分析天平(梅特勒-托利多仪器有限公司)；MS105十万分之一电子分析天平(梅特勒-托利多仪器有限公司)；TGL-16B高速离心机(上海安亭科学仪器厂)。
在本实施例中，泽泻醇A(批号JBZ-1648)、24-乙酰泽泻醇A(批号JBZ-1665)、泽泻醇B(批号JBZ-1649)、23-乙酰泽泻醇C(批号JBZ-1666)纯度均大于98.0％，购于南京金益柏生物技术有限公司；23-乙酰泽泻醇B(批号111846-201705)，购于中国食品药品检定研究所；乙腈(色谱纯，TEDIA公司)；甲酸(色谱纯，Merck公司)；超纯水(Milli-Q超纯水仪制得)，其他试剂均为分析纯。
步骤c、建立泽泻样品的指纹图谱：通过对色谱条件、泽泻制备、试验方法学、不同产地泽泻药材指纹图谱、各市场泽泻指纹图谱分析、化学模式识别、泽泻共有峰定性分析，将泽泻图谱导入软件进行分析，计算得出泽泻与生成的对照图谱的相似度，并根据指纹图谱分析结果，将生成的对照图谱中无法肉眼识别的小峰剔除。
在本实施例中，色谱条件包括测定波长和选择流动相。
1)测定波长的选择
将23-乙酰泽泻醇C、泽泻醇A、24-乙酰泽泻醇A、泽泻醇B和23-乙酰泽泻醇B的对照品这五个成分在190-400nm进行全波长扫描。结果表明23-乙酰泽泻醇C的最大吸收波长为246.4nm，23-乙酰泽泻醇B的最大吸收波长为190.9nm，泽泻醇A、24-乙酰泽泻醇A和泽泻醇B的最大吸收波长不在190-400nm区间内，在190-220nm间有吸收。结合样品图谱中干扰情况，最终确定检测波长为210nm。泽泻各对照品光谱图如图1所示。
2)流动相的选择
选定的检测波长为210nm，常用的流动相体系为甲醇-水/酸水或乙腈-水/酸水系统，甲醇的截止波长为210nm，乙腈的截止波长为190nm，甲醇-水/酸水体系干扰较大，因而考察了乙腈-水系统和乙腈-酸水系统。主要比较了以下四种流动相条件，条件(1)：乙腈(A)-水(B)，梯度洗脱(0-5min，35％A；5-10min，35-50％A；10-30min，50-55％A；30-60min，55-70％A；60-70min，75-85％A；70-80min，85-95％A；80-90min，95％A)；条件(2)：乙腈(A)-水(B)，梯度洗脱(0-30min，45-50％A；30-60min，55-95％A；60-70min，95％A)；条件(3)：乙腈(A)-水(B)，梯度洗脱(0-15min，40-55％A；15-32min，55-95％A；32-50min，95％A)；条件(4)：乙腈(A)-水(B)，梯度洗脱(0-15min，40-55％A；15-32min，55-95％A；32-50min，95-97％A；50-55min，97％A；55-56min，97-40％A)；条件(5)：乙腈(A)-0.1％甲酸水(B)，梯度洗脱(0-15min，40-55％A；15-32min，55-95％A；32-50min，95-97％A；50-55min，97％A；55-56min，97-40％A)；流速1.0mL/min；柱温35℃。五种不同流动相条件下运行的泽泻样品图谱如图2所示。
结果表明，按条件(4)运行样品，各主要色谱峰分离度良好、便于指认、基线平稳且运行时间适中，而在条件(4)的水相中加入0.1％甲酸后，色谱图基线严重下飘，不利于峰的指认，因此选定条件(4)为泽泻指纹图谱的流动相条件。
在本实施例中，泽泻制备包括提取溶剂、提取时间的控制、样品中加酸量考察。
1)提取溶剂的选择
称取四份泽泻粉末(药材粉碎，过五号筛)2.0g，置具塞锥形瓶中，分别加入甲醇、乙腈、90％乙腈、80％乙腈10mL，称重，超声提取30min，放冷后再次称重，用相应溶剂补足失重，摇匀。取适量药液，8000r/min，离心10min，取上清液，高效液相检测。各溶剂提取的泽泻样品色谱图如图3所示。
结果表明，甲醇和乙腈作为提取溶剂的效果相近，90％乙腈和80％乙腈提取效率较低，前沿峰较多，并且流动相系统为乙腈-水，综合考虑将提取溶剂定为乙腈。
2)提取时间的选择
称取三份泽泻粉末(药材粉碎，过五号筛)2.0g，置具塞锥形瓶中，分别加入乙腈10mL，称重，分别超声提取15、30、45min，再次称重，用乙腈补足失重，摇匀。取适量药液，8000r/min，离心10min，取上清液，高效液相检测。不同提取时间的泽泻样品色谱图如图4所示。
结果表明，泽泻样品超声提取15、30和40min，提取效率相近，峰数目基本一致，30min较15min的色谱图中提取效率稍高，因而选定30min为泽泻样品的提取时间。
3)样品中加酸量考察
称取泽泻粉末(药材粉碎，过五号筛)2.0g，置具塞锥形瓶中，加入乙腈10mL，称重，超声提取30min，再次称重，用乙腈补足失重，摇匀。取适量药液，8000r/min离心10min，取上清液。上清液分四份，一份不加酸，一份加入1μL乙酸，一份加入2μL乙酸，一份加入5μL乙酸，高效液相检测。不同加酸量的泽泻样品色谱图见如图5所示。
在本实施例中，试验方法学包括精密度试验、重复性试验、稳定性试验、耐用性试验。
1)精密度试验
取泽泻样品(编号S3)1份，按照前述方法配制与分析，连续进样6次。以泽泻醇B为对照峰，计算各共有峰的相对保留时间与相对峰面积RSD均小于3％，表明仪器的精密度良好。
2)重复性试验
取同一泽泻样品(编号S3)6份，按照前述方法配制与分析，以泽泻醇B为对照峰，计算各共有峰的相对保留时间与相对峰面积RSD均小于3％，表明方法的重复性良好。
3)稳定性试验
取泽泻样品(编号S3)1份，按照前述方法，在0、2、4、8、12、24h进样分析，以泽泻醇B为对照峰，计算各共有峰的相对保留时间与相对峰面积RSD均小于3％，供试品溶液在24h内稳定性良好。
4)耐用性试验
耐用性试验包括色谱柱的选择：比较同一泽泻样品分别在Hedera ODS-2(C18 4.6×250mm，5μm)、VenusilXBPC18(2)(4.6×250mm，5μm)和Kromasil C18(4.6x250mm，5μm)三根不同色谱柱上运行所得图谱的区别，结果如图6所示。
结果表明，Hedera ODS-2和Venusil XBP C18(2)色谱柱分离效果相近，基线平稳、分离效果较好。因而选定Hedera ODS-2或Venusil XBP C18(2)作为泽泻指纹图谱色谱柱均可行，后续实验选定Hedera ODS-2色谱柱作为泽泻指纹图谱的色谱柱。
耐用性试验还包括柱温的选择：比较同一泽泻样品分别在30℃、35℃和40℃条件下运行所得图谱，结果如图7所示。
结果表明，在30℃、35℃和40℃条件下，泽泻样品图谱运行时间相近，且各主要色谱峰分离度无明显区别，后续实验选定35℃作为泽泻指纹图谱的样品检测运行柱温。
耐用性试验还包括流速的选择：比较同一泽泻样品分别在0.8mL/min、1.0mL/min和1.2mL/min条件下运行所得图谱，结果如图8所示。
结果表明，随着流速的减小，泽泻样品各成分出峰时间前移，但分离度并未明显改善，因而后续实验选定分离度良好、样品运行时间适中的1.0mL/min作为泽泻指纹图谱的样品检测运行流速。
在本实施例中，不同产地泽泻药材指纹图谱包括不同产地泽泻的相似度比较、不同产地泽泻指纹图谱的建立、不同产地泽泻共有峰的标定与分析
1)不同产地泽泻的相似度比较
各产地共31批泽泻按前述方法配制供试品，在前述的色谱条件下进行测定，记录56min色谱图。将记录的31批泽泻图谱导入″中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件2012版″，结果如图9所示。
计算各批泽泻与生成的对照图谱的相似度，结果表明，四川泽泻相似度处于0.932-0.978；广西泽泻相似度处于0.301-0.393；江西与福建泽泻相似度处于0.732-0.746之间。同一产地的泽泻药材成分相似度接近，差距均在0.1之内，这表明同一产地泽泻间的成分差异较小；不同产地的泽泻药材成分相似度差距较大。不同产地间的泽泻成分差异较大，说明泽泻药材具有明显的地区差异，不能建立同一指纹图谱，应建立各自的指纹图谱进行分析。
2)不同产地泽泻指纹图谱的建立
分别将31批四川泽泻(样品S1-S19)，8批广西泽泻(样品S20-S27)，2批江西与福建泽泻(样品S28-S31)图谱导入″中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件2012版″进行分析。生成的四川、广西、江西与福建泽泻的指纹图谱如图10所示。
计算各批泽泻与生成的对照图谱的相似度，结果表明，四川泽泻与对照图谱的相似度处于0.967-0.997之间；广西泽泻与对照图谱的相似度处于0.950-0.997之间；江西与福建泽泻相似度处于0.930-0.994之间。该结果再次表明同一产地泽泻间的成分差异较小。
3)不同产地泽泻共有峰的标定与分析
根据指纹图谱分析结果，将生成的对照图谱中无法肉眼识别的小峰剔除，分别从19批四川产地泽泻图谱结果生成的对照图谱中标定了19个共有峰，8批广西产地泽泻泽泻图谱结果生成的对照图谱中标定11个共有峰，4批江西和福建泽泻图谱结果生成的对照图谱中标定19个共有峰。按保留时间进行排序，共22个色谱峰如图11所示。在标定的22个色谱峰中，峰1、2、3、7、11、13、14、16、17、18和19为四川、广西、江西与福建泽泻共有，峰4、5、6、7、9、10、20、21和22为四川、江西和福建泽泻共有，而峰8、12和15为广西泽泻独有。在四川泽泻中，峰14、16和17较高，峰16最高；广西泽泻中峰11和13较高，峰11最高；江西与福建泽泻14、16、17、19和21较高，峰17最高。根据对照图谱结果可以直观看出，四川与广西泽泻成分差异明显，四川与江西和福建成分也存在差异。
在本实施例中，通过产地实地调研，四川为当前泽泻主产区，而广西为泽泻的次产区，为了进一步了解泽泻的市场流通情况。本申请进一步收集了四川成都荷花池药材市场，安徽亳州中药材市场和广西玉林银丰国际中药港的泽泻，将其与各产地泽泻生成的对照指纹图谱导入″中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件2012版″进行分析，各批市场泽泻与各产地泽泻对照图谱如图12所示。
相似度结果表明，各批购自四川成都荷花池药材市场与和安徽亳州中药材市场的泽泻，和四川泽泻最为相似；各批购自广西玉林银丰国际中药港的泽泻与广西泽泻最为相似。
在本实施例中，化学模式识别包括聚类分析、主成分分析、正交最小二乘法判别分析。
1)聚类分析
将不同产地不同批次的泽泻指纹图谱标定的22个色谱峰峰面积导入SIMCA14.1统计软件(若在该保留时间下无对应色谱峰，则将峰面积定为0)，以″Single linkage″模式为距离计算方式，以高度为分类方式，对数据进行系统聚类。根据聚类分析结果，在度量距离为60时，31批泽泻可聚为两类，其中四川、江西与福建泽泻聚合为一类，广西泽泻聚合为一类；在度量距离为50时，31批泽泻可聚为三类，产地为江西与福建的泽泻样品S29、S30与S31这三批单独为一类，江西的泽泻样品S28仍与四川泽泻聚为一类；在度量距离为30时，四川泽泻、广西泽泻分别单独聚为一类。
2)主成分分析
将不同产地不同批次的泽泻指纹图谱标定的22个色谱峰峰面积导入SIMCA14.1统计软件(若在该保留时间下无对应色谱峰，则将峰面积定为0)，采用无监督模式识别PCA进行分析。根据平面分散图显示样本主要分为3类。各批次四川、广西泽泻分别聚集，江西与福建泽泻聚集，但是江西泽泻S28距离较远，与聚类分析结果一致。
由于平面图为三维立体图的其中一面空间投影，并且这四个产地的泽泻样品具有较大差异，样品S30与S31的投影超出该平面投影区域。通过三维立体图可以更直观的看出分类结果，四川泽泻分为一类、广西泽泻分为一类、江西与四川泽泻分为一类。
3)正交最小二乘法判别分析
根据相似度分析、聚类分析以及主成分分析都可以得出四川、广西、江西和福建这四个产地的泽泻差异性较大，被分为不同的三类的结果。为了进一步探究四川与广西、江西、福建泽泻之间成分的差异性，使用OPLS-DA进行对比分析。
根据该结果可以得出各标定峰对于区分各地泽泻的贡献程度(VIP值大于1表示该变量重要，VIP值小于0.5表示该变量不重要)。以VIP值大于1作为标准，筛选出5个对区分四川与广西泽泻贡献较大的变量，按影响大小排列依次是峰16、峰11、峰17、峰14和峰18，这5个成分为四个产地的共有峰；筛选出4个对区分四川与江西、福建泽泻贡献较大的变量，按影响大小排列依次是峰16、峰21、峰17和峰14，其中峰21非广西泽泻的共有峰；筛选出8个对区分广西与江西、福建泽泻贡献较大的变量，按影响大小排列依次是峰17、峰11、峰21、峰16、峰19、峰18、峰13和峰14，其中峰21非广西泽泻的共有峰。根据以上结果，这些差异性成分是导致各产地泽泻相似度较差的主要原因，可根据这些成分对不同产地的泽泻进行鉴别。
在本实施例中，泽泻共有峰定性分析包括色谱条件、质谱条件、各产地共有峰鉴定结果与分析。
1)色谱条件
Hanbon Hedera ODS-2(C18 4.6x250mm，5μm)；流动相为乙腈A-0.1％甲酸水B(为了提高检出灵敏度，流动相中水换为0.1％的甲酸)，梯度洗脱(0-15min，40-55％A；15-32min，55-95％A；32-50min，95-97％A；50-55min，97％A；55-56min，97-40％A)；流速1.0mL/min；柱温35℃；检测波长210nm；进样量10μL。
2)质谱条件
电喷雾离子源(ESI)；正/负离子模式检测质量扫描范围m/z为50-2000；喷雾电压为5500V；解簇电压为100V；碰撞电压为40V；碰撞电压为20V；离子源温度为600℃；雾化器为60psi；辅助加热器为60psi气帘气为40psi。
3)各产地共有峰鉴定结果与分析
为了进一步确认各产地泽泻之间的差异性成分，采用HPLC-MS/MS并结合对照品对照的方法对上述标定的22个色谱峰进行鉴定。
步骤d、泽泻的含量测定：通过对色谱条件、泽泻制备、方法学考察，建立各自的指纹图谱，并对其差异性成分进行分析。
在本实施例中，色谱条件包括含量测定成分的选择、测定波长的选择、流动相的选择。
1)含量测定成分的选择
通过指纹图谱及质谱分析，发现泽泻醇B是四川与其他产地的主要差异性成分，也是四川泽泻的主要三萜类成分，而在2015版《中国药典(一部)》泽泻含量测定项下仅限定了23-乙酰泽泻醇B，忽视了泽泻醇B的含量限定。本研究在按中国药典方法进行23-乙酰泽泻醇B含量测定时，发现以中国药典中23-乙酰泽泻醇B含量测定条件下，泽泻醇B分离度良好，在测定23-乙酰泽泻醇B的同时，可以进行泽泻醇B的含量测定。因此后续进行按2015版《中国药典(一部)》的23-乙酰泽泻醇B含量测定方法，进行同时测定泽泻醇B的方法学考察。
2)测定波长的选择
2015版《中国药典(一部)》″泽泻″药材的含量测定项下″23-乙酰泽泻醇B″的检测波长为208nm，结合泽泻醇B和23-乙酰泽泻醇B的对照品这两个成分在190-400nm全波长扫描结果，最终确定泽泻醇B和23-乙酰泽泻醇B这两个成分同时测定的检测波长为208nm。
3)流动相的选择
按照2015版《中国药典(一部)》中测定23-乙酰泽泻醇B的供试品制备方法及流动相条件乙腈-水(73∶27)运行样品，再将乙腈替换为同等比例甲醇。
结果表明，按2015版《中国药典(一部)》中测定23-乙酰泽泻醇B的流动相条件运行，泽泻醇B与23-乙酰泽泻醇B的色谱峰均分离度良好、基线平稳，因此选定乙腈-水(73∶27)为同时测定泽泻中泽泻醇B与23-乙酰泽泻醇B含量的流动相条件。
在本实施例中，泽泻制备包括提取溶剂的选择、提取时间的选择。
1)提取溶剂的选择
取五份泽泻粉末(过五号筛)约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，分别精密加入甲醇、乙腈、90％乙腈和70％乙腈25mL，密塞，称定重量，超声处理(功率250W，频率50kHz)30分钟，放冷，再称定重量，用乙腈补足减失的重量，摇匀。取适量药液，8000r/min，离心10min，取上清液，检测。
结果表明，甲醇和乙腈作为提取溶剂的效果相近，90％乙腈和80％乙腈提取效率较低，而且流动相体系为乙腈与水，2015版《中国药典(一部)》中采用的是乙腈提取，因而选定乙腈作为泽泻样品含量测定的提取溶剂。
2)提取时间的选择
取3份泽泻粉末(过五号筛)约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，各精密加入乙腈25mL，密塞，称定重量，分别超声处理(功率250W，频率50kHz)15、30、45分钟，放冷，再称定重量，用乙腈补足减失的重量，摇匀。取适量药液，8000r/min，离心10min，取上清液，检测。
结果表明，泽泻样品超声提取15、30和45min，提取效率相近，峰数目基本一致，30min较15min的色谱图中提取效率稍高，因而选定30min为泽泻样品的提取时间。
在本实施例中，方法学考察包括线性范围考察、精密度试验、重复性试验、稳定性试验、加样回收率试验、耐用性试验。
1)线性范围考察
精密称取泽泻醇B10.25mg，加乙腈定容至25mL。精密吸取上述溶液0.5mL、1.0mL、1.5mL、3.0mL、6.0mL分别置于10mL容量瓶中，加乙腈稀释至刻度，摇匀，即得。依照前述方法进行测定，以泽泻醇B的浓度为横坐标(X)，相应的峰面积为纵坐标(Y)，绘制标准曲线
2)精密度试验
取泽泻样品(编号S3)1份，按前述方法配制与分析，连续进样6次。泽泻醇B峰面积的RSD为3.50％(＜5％)，表明该方法的仪器的精密度良好。
3)重复性试验
取同一泽泻样品(编号S3)6份，按前述方法配制与分析。泽泻醇B峰面积的RSD为2.44％(＜5％)，表明该方法的重复性良好。
4)稳定性试验
取泽泻样品(编号S3)1份，按前述方法，在0、2、4、6、8、12、16、24h进样分析8。泽泻醇B峰面积RSD为1.79％(＜5％)，表明供试品溶液在24h内稳定性良好。
5)加样回收率试验
取已知含量的泽泻样品(编号S3，泽泻醇B含量：2.244mg/g)，取9份，每份约0.5g，精密称定，分别加入对照品溶液(溶剂为乙腈，泽泻醇B浓度：576μg/mL)1.0mL、2.0mL、3.0mL各三份，按前述方法配制与分析(溶剂加入量为25mL扣除加入的对照品溶液体积)。泽泻醇B的平均加样回收率为100.51％，RSD为0.98％，说明该方法准确度良好。
6)耐用性试验
耐用性试验包括色谱柱的选择：比较同一泽泻样品分别在Venusil XBP C18(2)(4.6x250mm，5μm)、Kromasil C18(4.6×250mm，5μm)和Boston Green ODS(4.6x250mm，5μm)三根不同色谱柱上测定结果。泽泻醇B峰面积的RSD为2.74％(＜5％)，该方法在不同填料为C18的色谱柱下耐用性良好，这三根色谱柱均可作为泽泻含量测定的色谱柱，后续实验选定Venusil XBP C18(2)色谱柱作为泽泻含量测定的色谱柱。
耐用性试验还包括柱温的选择：比较同一泽泻样品分别在25℃、30℃和35℃条件下运行测定结果。泽泻醇B峰面积的RSD为1.86％(＜5％)，该方法在25℃、30℃和35℃温度下耐用性良好，后续实验选定30℃作为泽泻含量测定的运行柱温。
耐用性试验还包括流速的选择：比较同一泽泻样品分别在0.8mL/min、1.0mL/min和1.2mL/min条件下运行测定结果。泽泻醇B峰面积的RSD为19.02％(＞5％)，后续实验选定1.0mL/min作为泽泻含量测定的运行柱温。
本发明所建立的泽泻指纹图谱，能有效的表征泽泻成分的质量，可为泽泻汤质量的监控提供依据。能够更全面的对泽泻汤的质量进行评价，本发明所建立选定方法具有快速、稳定、重现性好、精密度高等优点，能够快速，准确的用于泽泻汤中的泽泻成分选定。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，本发明要求保护范围由所附的权利要求书、说明书及其等效物界定。

Claims (10)

1.一种基于泽泻汤的泽泻成份的选定方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤a、泽泻样品的收集：在泽泻主产区进行样品收集，并进行编号；
步骤b、选择仪器与试剂：仪器包括高效液相色谱仪、质谱仪、超声清洗器、万分之一电子分析天平、十万分之一电子分析天平、高速离心机，试剂包括泽泻醇A、24-乙酰泽泻醇A、泽泻醇B、23-乙酰泽泻醇C、23-乙酰泽泻醇B、乙腈、甲酸、超纯水、分析纯；
步骤c、建立泽泻样品的指纹图谱：通过对色谱条件、泽泻制备、试验方法学、不同产地泽泻药材指纹图谱、各市场泽泻指纹图谱分析、化学模式识别、泽泻共有峰定性分析，将泽泻图谱导入软件进行分析，计算得出泽泻与生成的对照图谱的相似度，并根据指纹图谱分析结果，将生成的对照图谱中无法肉眼识别的小峰剔除；
步骤d、泽泻的含量测定：通过对色谱条件、泽泻制备、方法学考察，建立各自的指纹图谱，并对其差异性成分进行分析。
2.根据权利要求1所述的基于泽泻汤的泽泻成份的选定方法，其特征在于，在步骤c中，色谱条件包括测定波长和流动相，检测波长为210nm。
3.根据权利要求1所述的基于泽泻汤的泽泻成份的选定方法，其特征在于，在步骤c中，泽泻制备包括提取溶剂、提取时间的控制、样品中加酸量考察。
4.根据权利要求1所述的基于泽泻汤的泽泻成份的选定方法，其特征在于，在步骤c中，试验方法学包括精密度试验、重复性试验、稳定性试验、耐用性试验。
5.根据权利要求1所述的基于泽泻汤的泽泻成份的选定方法，其特征在于，在步骤c中，不同产地泽泻药材指纹图谱包括不同产地泽泻的相似度比较、不同产地泽泻指纹图谱的建立、不同产地泽泻共有峰的标定与分析。
6.根据权利要求1所述的基于泽泻汤的泽泻成份的选定方法，其特征在于，在步骤c中，化学模式识别包括聚类分析、主成分分析、正交最小二乘法判别分析。
7.根据权利要求1所述的基于泽泻汤的泽泻成份的选定方法，其特征在于，在步骤c中，泽泻共有峰定性分析包括色谱条件、质谱条件、各产地共有峰鉴定结果与分析。
8.根据权利要求1所述的基于泽泻汤的泽泻成份的选定方法，其特征在于，在步骤d中，色谱条件包括含量测定成分的选择、测定波长的选择、流动相的选择。
9.根据权利要求1所述的基于泽泻汤的泽泻成份的选定方法，其特征在于，在步骤d中，泽泻制备包括提取溶剂的选择、提取时间的选择。
10.根据权利要求1所述的基于泽泻汤的泽泻成份的选定方法，其特征在于，在步骤d中，方法学考察包括线性范围考察、精密度试验、重复性试验、稳定性试验、加样回收率试验、耐用性试验。
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